氧化亞銅納米粒在制備治療前列腺癌藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開氧化亞銅納米粒在制備治療前列腺癌藥物中的應(yīng)用，氧化亞銅納米粒對前列腺癌細(xì)胞系具有選擇性的殺傷作用，在有效殺傷前列腺癌細(xì)胞的同時，對正常前列腺上皮細(xì)胞的毒性很小，具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】
氧化亞銅納米粒在制備治療前列腺癌藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地講，涉及氧化亞銅納米粒在制備治療前列腺癌藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]前列腺癌是男性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，發(fā)病隨年齡增長而增加，全球范圍內(nèi)居男性癌癥發(fā)病率的第3位，病死率的第6位，在美國則分別居男性癌癥發(fā)病率第I位，病死率的第2位。近年來，中國男性前列腺癌發(fā)病率持續(xù)升高，對男性健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，也給社會帶來了巨大壓力。
[0003]納米科學(xué)的發(fā)展給科學(xué)進(jìn)步注入了新鮮動力，給包括醫(yī)學(xué)在內(nèi)的各個學(xué)科帶來了深刻的變革。納米醫(yī)學(xué)及其分支納米腫瘤學(xué)是納米科學(xué)的子學(xué)科，它們的發(fā)展給腫瘤治療及抗腫瘤藥物研發(fā)提供了可行的方法和思路。脂質(zhì)體靶向給藥系統(tǒng)、磁性納米粒給藥體系、量子點(diǎn)、納米分子成像技術(shù)以及無機(jī)納米藥物是抗腫瘤納米藥物的前沿研究對象。其中，抗腫瘤無機(jī)納米藥物既可以經(jīng)改造成為載藥體系，也可以作為抗腫瘤藥物靶向腫瘤組織，表現(xiàn)出許多獨(dú)特的作用，有許多有趣的科學(xué)問題亟待研究。棒狀納米金、星型納米金、納米氧化鋅、納米金鐵復(fù)合材料等多種無機(jī)納米藥物表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤作用，且具有獨(dú)特的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的靶向作用，可以選擇性的靶向腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核、線粒體等結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞水平和實(shí)驗(yàn)動物水平均表現(xiàn)出良好的腫瘤治療應(yīng)用前景。對于無機(jī)納米藥物的作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，金納米粒(Au NP s)可通過抑制MAPK信號通路抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移與增殖；納米T i 02可上調(diào)Bak/Bax的比值;Mn納米?？缮险{(diào)轉(zhuǎn)鐵蛋白的表達(dá);超磁性鐵納米粒通過激活β-catenin、cancer/testis抗原、間質(zhì)金屬蛋白酶麗P_2等蛋白的表達(dá)參與人間充質(zhì)干細(xì)胞的分化調(diào)控，還可與c-erbB-2受體結(jié)合革E向乳腺癌細(xì)胞;ZnO納米?？梢种艫kt、Erkl/2的磷酸化，激活JNK、P38;其中0-catenin、Akt、Erk、MMP等蛋白與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
[0004]氧化亞銅納米粒(Cuprous Oxide Nanoparticles，⑶NPs)作為一種含銅納米藥物，與急性早幼粒白血病特效藥物-亞砷酸(砒霜As2O3的水化物，為礦物中藥)具有相似的化學(xué)性質(zhì)。在重要中藥學(xué)典籍《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載曾青、扁青等含銅礦物中藥具有“破癥堅積聚”的作用，而“破癥堅積聚”就包括腫瘤這類疾??；同時，含銅礦物中藥具有“扶正祛邪”、“通血脈”、“療惡瘡”等作用，在治療疾病的同時還可以調(diào)動機(jī)體自身的抗病能力。另外，銅元素作為人體必需的微量元素，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移有著復(fù)雜的關(guān)系。目前已經(jīng)開發(fā)出銅離子/亞銅離子配合物等腫瘤化療藥物，這些藥物與在臨床廣泛應(yīng)用的鉑類抗腫瘤藥物有著類似的作用，同時具有相對較小的毒副作用，這也提示我們開發(fā)新型含銅抗腫瘤藥物具有良好的理論支持和應(yīng)用前景。
[0005]受已有相關(guān)研究的啟發(fā)，本課題組從2010年開始，在國內(nèi)外首次對CONPs的抗腫瘤作用和機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，取得了一定的原創(chuàng)性成果。體外細(xì)胞水平的研究發(fā)現(xiàn)，CONPs(粒徑分布在50-100nm之間)可以選擇性的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)出選擇性的腫瘤細(xì)胞毒性作用，對小鼠高侵襲性黑色素瘤B16-F10細(xì)胞和人黑色素瘤YUMAC細(xì)胞具有極強(qiáng)的殺傷作用，研究成果發(fā)表在納米醫(yī)學(xué)專業(yè)雜志Internat1nal Journal of Nanomedicine(2012,7,2641-2652 ；年度影響因子為4.976)；基于體外初步的研究結(jié)果，課題組進(jìn)一步開展了 CONPs對黑色素瘤動物模型的治療及凋亡誘導(dǎo)機(jī)制的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，通過小鼠皮下荷瘤和肺轉(zhuǎn)移瘤模型，發(fā)現(xiàn)CONPs可以顯著抑制黑色素瘤增殖，延長小鼠的生存率，最重要的是研究還發(fā)現(xiàn)CONPs可以抑制黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移，減少肺轉(zhuǎn)移小鼠模型肺表面的黑色素瘤結(jié)節(jié)數(shù)目；并且初步闡明了線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路在CONPs誘導(dǎo)腫瘤凋亡中起到的重要作用。與納米金、納米銀、納米二氧化鈦等無機(jī)納米藥物及量子點(diǎn)很難被機(jī)體降解、排泄不同，而本課題組還發(fā)現(xiàn)CONPs可被小鼠快速排泄，具有極小的肝腎毒性，表現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力。該部分的研究成果已發(fā)表在Nature出版集團(tuán)旗下轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)期刊Cell Death&Disease雜志(2013，4，e783 ；年度影響因子為6.044)。
[0006]本課題擴(kuò)大了CONPs的腫瘤治療譜，通過研究發(fā)現(xiàn)了 CONPs對前列腺癌細(xì)胞系具有選擇性的殺傷作用，在有效殺傷前列腺癌細(xì)胞的同時，對正常前列腺上皮細(xì)胞的毒性很小，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用打下來堅實(shí)基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的第一個目的在于提供氧化亞銅納米粒在制備治療前列腺癌藥物中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的第二個目的在于提供一種治療前列腺癌的藥物。
[0009]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第一個目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案:氧化亞銅納米粒在制備治療前列腺癌藥物中的應(yīng)用。
[00?0]作為一個優(yōu)選方案，所述氧化亞銅納米粒的粒徑為50-100nm之間。
[0011]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第二個目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案:一種治療前列腺癌的藥物，所述藥物由氧化亞銅納米粒和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑組成。
[0012]作為一個優(yōu)選方案，所述氧化亞銅納米粒的粒徑為50-100nm之間。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:CONPs對前列腺癌細(xì)胞系具有選擇性的殺傷作用，在有效殺傷前列腺癌細(xì)胞的同時，對正常前列腺上皮細(xì)胞的毒性很小，具有良好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0014]圖1為CONPs對前列腺癌細(xì)胞具有顯著地選擇性殺傷作用。
[0015]圖2為CONPs可顯著誘導(dǎo)前列腺癌DU145(A)和PC-3(B)細(xì)胞系凋亡。
[0016]圖3為CONPs可顯著抑制前列腺癌DU145(A)和PC-3(B)細(xì)胞系迀移。
[0017]圖4為CONPs可活化自噬相關(guān)蛋白LC3A和LC3B。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0019]實(shí)施例
[0020]I，實(shí)驗(yàn)材料:
[0021]PC-3^LNCaP FGC、RWPE-1細(xì)胞:ATCC公司引進(jìn)。
[0022]DU145、RM-1:中科院細(xì)胞庫引進(jìn)。
[0023]F12、DMEM、K-SFM、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清 FBS:Gibco 公司。
[0024]2，實(shí)驗(yàn)方法:
[0025]2.1，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
[0026]選擇人PC-3、LNCaP FGC、DU145和小鼠RM-1等前列腺癌細(xì)胞系為研究對象，選擇人正常前列腺上皮RWPE-1細(xì)胞為對照，其中PC-3細(xì)胞應(yīng)用F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，LNCaP FGC和DU145細(xì)胞應(yīng)用RMPI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，RM-1選擇DMEM培養(yǎng)基，上述細(xì)胞培養(yǎng)基均添加10%FBS和
I%青霉素-鏈霉素，RWPE-1應(yīng)用K-SFM培養(yǎng)基(添加rhEGF和牛垂體提取物)。取96孔板，每孔加入200μ1的細(xì)胞懸液，每孔3000個細(xì)胞，孵育過夜，棄培養(yǎng)基，按濃度梯度加入CONPs，除對照組以外，實(shí)驗(yàn)組濃度梯度設(shè)定為0.625yg/ml、1.25yg/mU2.5yg/mU5yg/ml、10yg/ml每個濃度梯度設(shè)置5個復(fù)孔，分別在48h、72h棄去加入藥物的培養(yǎng)基，按10:1的比例每孔加入10μI的CCK8溶液和ΙΟΟμΙ培養(yǎng)基配好的混合液，37°C孵箱避光孵育4h，用酶標(biāo)儀在450nm處測定細(xì)胞吸光度，按照抑制率(%) = ( 1-實(shí)驗(yàn)組平均A值/對照組平均A值)X 100 %的公式計算出抑制率，通過SPSS16.0計算出IC50，利用GraphPad Prism 5進(jìn)行量效柱狀圖繪制，并以RWPE-1細(xì)胞為對照進(jìn)行Student’s t test。
[0027]2.2，細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)
[0028]主要檢測⑶NPs對DU145、PC_3細(xì)胞系凋亡的影響。六孔板中，每孔加入10萬個細(xì)胞，每孔2ml培養(yǎng)基，孵育過夜，72小時實(shí)驗(yàn)組第二天按照濃度梯度加入CONPs，濃度梯度為2.5、5、10yg/ml。48小時實(shí)驗(yàn)組在第三天按照濃度梯度加藥。在同一天上流式分析儀，分別收集細(xì)胞上清液入離心管，PBS清洗貼壁細(xì)胞，胰酶消化貼壁細(xì)胞，按照濃度梯度加入對應(yīng)上清液中，離心棄培養(yǎng)基，PBS重懸離心棄上清，Annexin V binding buffer重懸離心棄上清，細(xì)胞量少，200μ1 Annexin V binding buffer重懸(細(xì)胞量多可加至300_400μ1)，加入Annexin V FITC 5μ1，避光孵育15分鐘后，加入5μ1 PI，并上機(jī)檢測。實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)用f1wjo 7.6分析。
[0029]2.3細(xì)胞迀移實(shí)驗(yàn)
[0030]將PC-3和DU145細(xì)胞饑餓處理24小時，第二天棄培養(yǎng)基，胰酶消化，離心，用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為每200μ1含有I萬個細(xì)胞，12孔板中放入小室，小室上層加入200μ1的I萬個細(xì)胞懸液，小室下層加入600μ1含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。注意小室上下不要形成氣泡，48小時后，用PBS淋洗小室上下層，棉簽輕輕擦去小室上層的細(xì)胞，用無水乙醇固定3h，后用結(jié)晶紫染色lh，風(fēng)干后顯微鏡下放大100倍，隨機(jī)選選取10個視野拍照。
[0031]2.4自噬相關(guān)蛋白的檢測
[0032]將PC-3細(xì)胞培養(yǎng)于6cm培養(yǎng)皿中，至密度為50%左右時加入⑶NPs至終濃度為1.25、2.5、5yg/ml，處理48h，應(yīng)用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，蛋白應(yīng)用BCA試劑盒進(jìn)行定量，采用12.5% SDS-PAGE凝膠電泳80V濃縮膠電泳15min、120V分離膠電泳50min，PVDF膜300mA轉(zhuǎn)膜90min ο5 %脫脂奶粉室溫封閉3h，TBST洗滌5次，每次3min ； LC3A、LC3B—抗4°C孵育過夜，TBST洗滌5次，每次3min; 二抗孵育Ih，TBST洗滌5次，每次3min，應(yīng)用ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行發(fā)光，于掃膜儀進(jìn)行掃膜。
[0033]3，結(jié)果:
[0034]3.1 CONPs可選擇性抑制前列腺癌細(xì)胞增殖，對正常細(xì)胞系RWPE-1毒性很低
[0035]不同濃度的CONPs處理培養(yǎng)于96孔板的腎癌細(xì)胞48和72小時之后，采用CCK8法檢測⑶NPs對細(xì)胞增殖的影響。檢測結(jié)果顯示，48h時間節(jié)點(diǎn)，CONPs對前列腺癌細(xì)胞系PC-3、LNCaP ?6(:、01]145、1?1-1細(xì)胞的半效抑制濃度1050依次為6.604yg/ml、0.913yg/ml、3.813μg/ml、8.82yg/ml，正常人前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1的IC50為45.997yg/ml，t檢驗(yàn)結(jié)果顯示PC-3^LNCaP 卩6(:、01]145、咖-1細(xì)胞的？值依次為0.0412、0.0062、0.0342、0.0393，均小于0.05。72h時間節(jié)點(diǎn)，⑶NPs對前列腺癌細(xì)胞系PC-3、LNCaP FGC、DU145、RM_1細(xì)胞的半效抑制濃度IC50依次為3.793yg/ml、0.44yg/ml、4.781yg/ml、I.045yg/ml，正常人前列腺上皮細(xì)胞RffPE-1 的48h的 IC50遠(yuǎn)大于45.997yg/ml，t檢驗(yàn)結(jié)果顯示PC_3、LNCaP FGC、DU145、RM_1 細(xì)胞的P值依次為0.0279、0.0135、0.0290、0.0170，均小于0.05。(圖1)結(jié)果顯示，CONPs可以顯著抑制前列腺癌細(xì)胞系的增殖，而正常人前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1對CONPs的殺傷作用耐受，因此CONPs表現(xiàn)出選擇性的前列腺癌殺傷作用，具有潛在的前列腺癌臨床治療價值。
[0036]3.2 CONPs可顯著誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡
[0037]本研究采用Annexin V/PI雙染法檢測了CONPs對PC-3和DU145細(xì)胞凋亡的影響。分別用2.5yg/mK5yg/ml、10yg/ml的⑶NPs對兩株細(xì)胞處理48小時和72小時。CONPs作用于DU145細(xì)胞48小時，早期凋亡比率分別為2.42%、4.05%、7.43%，晚期凋亡比率分別為
5.28%、5.26%、25.2%，藥物作用72小時之后，早期凋亡比率分別為1.86%、3.19%、10.6%，晚期凋亡比率分別為3.01%、9.24%、47.7%。
[0038]同樣濃度梯度的⑶NPs作用于PC-3細(xì)胞48小時，早期凋亡比率分別為34.5%、27.5%、32.4%，晚期凋亡比率分別為5.72%、45.9%、37.4%。藥物作用?(:-3細(xì)胞72小時，早期凋亡比率分別為62.3%、40.6%、22.6%，晚期凋亡比率分別為0.06%、18.2%、64.4%。(圖2)。
[0039]3.3 CONPs可顯著抑制前列腺癌細(xì)胞迀移
[0040]細(xì)胞迀移試驗(yàn)中，⑶NPs作用48小時，PC-3細(xì)胞中，對照組每高倍視野(207 ± 16)，、2.5yg/ml 組(173±7)、5yg/ml 組(113±ll)、10yg/ml 組(76±3)(Ρ〈0.005)(圖3Α)<^υ?45 細(xì)胞中，對照組每高倍視野(96±10),2.5yg/ml組(75±7)、5yg/ml組(39±3)、10yg/ml組(27±5)，且每組與對照組之間(P〈0.005)(圖3B)。
[0041 ] 3.4 CONPs可誘導(dǎo)自噬
[0042]應(yīng)用WesternBlot檢測，LC3A、LC3B均發(fā)生活化，LC3A 1、LC3B I向LC3A Π、LC3BΠ形式轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明CONPs可誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡發(fā)生，參與腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)(圖4)。
[0043]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.氧化亞銅納米粒在制備治療前列腺癌藥物中的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氧化亞銅納米粒在制備治療前列腺癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述氧化亞銅納米粒的粒徑為50-1 OOnm之間。3.—種治療前列腺癌的藥物，其特征在于，所述藥物由氧化亞銅納米粒和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑組成。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種治療前列腺癌的藥物，其特征在于，所述氧化亞銅納米粒的粒徑為50-100nm之間。
【文檔編號】A61K9/14GK105832674SQ201610308780
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月11日
【發(fā)明人】孫穎浩, 王野, 訾曉淵, 楊啟維, 呂建敏
【申請人】上海長海醫(yī)院