同時檢測慶大霉素和喹諾酮類藥物的量子點免疫熒光試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品安全檢測領(lǐng)域，具體設(shè)及一種同時檢測動物源性食品中慶大霉素 和哇諾酬類藥物殘留的量子點免疫巧光試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 慶大霉素(Gentamycin，GM)，是氨基糖巧類抗生素的一種，慶大霉素呈堿性、易溶 于水、性狀穩(wěn)定，與硫酸結(jié)合成臨床上使用的硫酸慶大霉素。它的抗菌譜較廣，對綠脈桿菌、 大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、克雷白桿菌、奇異變形桿菌、某些嗎I噪變形桿菌、某些奈瑟菌、某些無 色素雷桿菌和志賀菌等革蘭氏陰性菌有抗菌作用，而且對革蘭氏陽性菌中的金黃色葡萄球 菌也有很強的抗菌作用;其抗菌作用機理是直接與30S核糖體亞單位16rRNA的解碼區(qū)的A部 位結(jié)合，從而導(dǎo)致菌體死亡。但是，隨著慶大霉素的廣泛使用，一些細(xì)菌逐漸對其產(chǎn)生了耐 藥性。雖然慶大霉素對奶牛乳房炎、子宮內(nèi)膜炎等有很好的療效，常用作獸醫(yī)臨床治療及飼 料藥物添加劑，但不規(guī)范用藥會引起畜產(chǎn)品，尤其是泌乳動物的乳汁中有藥物殘留，對人類 的健康構(gòu)成潛在危害，造成耳毒性和腎臟毒性。國內(nèi)外相繼規(guī)定了其在動物性食品中的最 高殘留限量。我國農(nóng)業(yè)部235號公告規(guī)定，慶大霉素在肌肉、脂肪中的最高殘留限量為 lOOppb，在肝中的最高殘留限量為2000ppb，在腎中的最高殘留限量為5000ppb，在牛奶中的 最局殘留限量為20化pb。
[0003] 哇諾酬類(Quinolones，QNs)，是一類人工合成的含4-哇諾酬基本結(jié)構(gòu)，對細(xì)菌DNA 螺旋酶具有選擇性抑制的抗生素。1962年最早的哇諾酬類藥物糞晚酸首先用于臨床，由于 其抗菌譜窄、口服吸收差、副作用高等原因現(xiàn)在已很少使用。當(dāng)前應(yīng)用的哇諾酬大多為含有 氣原子的氣哇諾酬類。運類藥物抗菌譜廣，對革蘭氏染色呈陰性桿菌活性較高，對其他抗生 素耐藥的德細(xì)菌也具有良好的抗菌作用，無交叉耐藥性;在體內(nèi)分布廣，體內(nèi)和組織中藥物 濃度高；口服吸收好，半衰期長，使用方便;與頭抱菌素類藥物相比，抗菌作用相似，但價格 便宜。目前在獸醫(yī)臨床上常用的藥物主要有諾氣沙星、氧氣沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉 沙星、氣甲哇等十幾種，隨著應(yīng)用的增加，其各種毒副作用也逐漸顯現(xiàn)出來，主要體現(xiàn)在頭 暈、低血糖、惡屯、、胃腸道癥狀、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和過敏反應(yīng)。特別是近幾年，嚴(yán)重的不良反應(yīng) 發(fā)生率約為1.6%~1.8%，引起了全世界的關(guān)注。為了保障動物源性食品的安全，歐盟、美國及 我國等很多國家都對哇諾酬類藥物在動物源性食品中殘留制定了最大殘留限量(M化）。我 國農(nóng)業(yè)部文件(農(nóng)質(zhì)發(fā)[2009]3號文件）中規(guī)定了2009年我國畜禽產(chǎn)品監(jiān)測項目，禽肉中4種 哇諾酬類藥物殘留是重要的監(jiān)測項目之一。
[0004] 現(xiàn)有的慶大霉素和哇諾酬類藥物檢測方法多為色譜法，但是運些方法的靈敏度受 樣品的凈化、濃縮等步驟的影響較大，再者運些方法需要復(fù)雜的儀器，過程繁瑣，不適應(yīng)現(xiàn) 場大量樣本的篩查，且目前現(xiàn)有的快速檢測產(chǎn)品存在一定的局限性，無法同時檢測慶大霉 素和哇諾酬類藥物的殘留。量子點免疫巧光檢測方法具有特異性強、穩(wěn)定快速、檢測范圍 寬、操作簡單自動化程度高、試劑穩(wěn)定且有效期長(6~18個月）等優(yōu)點，其檢測限比化ISA和 理化檢測方法高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種同時檢測慶大霉素和哇諾酬類藥物的量子點免疫巧光 試劑盒，包括包被原、量子點標(biāo)記的抗體； 所述包被原為慶大霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物和哇諾酬藥物半抗原與載體蛋白 的偶聯(lián)物的混合物； 所述的慶大霉素半抗原，為式I所示的化合物；
式I。
[0006] 所述的哇諾酬藥物半抗原，為式Π 所示的化合物；
式Π 。
[0007] 本發(fā)明還公開了式Π 所示化合物的制備方法，包括如下步驟： (1) 稱取環(huán)丙沙星33.3mg，溶于1.5mL去離子水中，用1M氨氧化鋼溶液調(diào)pH9.0; (2) 冰浴中加入乙二醇二縮水甘油酸20化，室溫攬拌反應(yīng)4h，混合液真空干燥，得到的 固體即為產(chǎn)物。
[0008] 本發(fā)明提供的慶大霉素抗原，是將式I所示化合物和載體蛋白偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物。
[0009] 常用載體蛋白均可采用，如牛血清白蛋白（BSA)，卵清蛋白（OVA)，人血清白蛋白 (HSA)，鼠血清白蛋白（MSA)，甲狀腺蛋白（TG)或血藍(lán)蛋白化LH)等，慶大霉素與BSA的摩爾結(jié) 合比具體可為8:1。
[0010] 本發(fā)明還公開了所述慶大霉素抗原制備的方法，包括如下步驟： (1) 取26mg慶大霉素，溶于4ml碳酸鹽緩沖液（取63.6mg無水化0)3和117.6mg化肥化， 用純水定容至20mL); (2) 取BSA 60mg，溶于6ml所述碳酸鹽緩沖液； (3) 將步驟（1)得到的慶大霉素溶液加到步驟(2)得到的BSA溶液中并室溫混勻lOmin， 然后加入487yl 1%(體積比）戊二醒水溶液并室溫攬拌過夜，然后加入化BH4溶液（5mg Na冊4溶于50化1純水)并室溫攬拌比，然后用純水透析，再然后用PBS緩沖液(pH7.2、0.01M) 進(jìn)行透析，然后4500巧m離屯、6min并取上清液。
[0011] 本發(fā)明提供的哇諾酬藥物抗原，是將式π所示化合物和載體蛋白偶聯(lián)得到的偶聯(lián) 物，環(huán)丙沙星與BSA的摩爾結(jié)合比具體可為7:1。
[0012] 本發(fā)明還公開了所述哇諾酬藥物抗原制備的方法，包括如下步驟： (1) 取11.3mg半抗原溶于1血0.1Μ碳酸鋼緩沖液； (2) 逐滴加入牛血清白蛋白溶液巧Omg牛血清白蛋白溶于5mL0.1M碳酸鋼緩沖液）； (3) 室溫攬拌過夜后裝入透析袋，PBS 4度透析72小時，期間換透析液6次。將透析液在 無菌條件下過0.22 Ml孔徑的濾膜，分裝于安培瓶中，-20度保存。
[0013] 所述慶大霉素抗原、哇諾酬藥物抗原可W作為免疫原制備相應(yīng)的特異性抗體，也 可W作為包被原制備量子點免疫巧光微孔板。
[0014] 所述檢測抗體為慶大霉素的特異性抗體和哇諾酬藥物的特異性抗體的混合物。
[0015] 所述慶大霉素的特異性抗體為所述慶大霉素藥物的單克隆抗體;所述哇諾酬藥物 的特異性抗體為所述哇諾酬藥物的單克隆抗體，具體可為對11種哇諾酬類化合物(恩諾沙 星、氧氣沙星、環(huán)丙沙星、諾氣沙星、達(dá)氣沙星、氣甲哇、嗯哇酸、麻保沙星、氨氣沙星、培氣沙 星、依諾沙星)都有交叉反應(yīng)的環(huán)丙沙星單克隆抗體。
[0016] 本發(fā)明還公開了應(yīng)用慶大霉素抗原、哇諾酬藥物抗原和慶大霉素特異性抗體、哇 諾酬藥物特異性抗體制備得到的量子點免疫巧光酶聯(lián)免疫試劑盒，包括量子點標(biāo)記的所述 抗體。
[0017] 慶大霉素特異性抗體的量子點標(biāo)記物和環(huán)丙沙星特異性抗體的量子點標(biāo)記物的 制備方法均如下： ① 取2.5mg量子點，用抑4.7、0.1M的MES緩沖液洗涂，然后用1ml pH4.7、0.1M的MES緩沖 液重懸，加入0.96mg EDC和1.15mg N服，37°C反應(yīng)30分鐘，20000巧m離屯、5min，收集沉淀，即 為活化后的量子點； ② 取步驟①得到的活化后的量子點，用pH8.5、50mM的棚砂緩沖液洗涂，然后將2.5mg活 化后量子點、所述抗體(蛋白質(zhì)含量為〇.15mg)和抑8.5、50mM的棚砂緩沖液混勻（總體積為 0.81111)，25°(3反應(yīng)3.5小時； ③ 取完成步驟②的液相，加入BSA并使其質(zhì)量百分含量為5%，37°C反應(yīng)30分鐘， 20000巧m離屯、5min，收集沉淀，用抑7.4、0.02M的PBS緩沖液洗涂，用1ml pH7.4、0.02M的PBS 緩沖液重懸； 步驟③得到的液相，用pH7.4、0.02M的PBS緩沖液稀釋至65000倍體積。
[0018] 本發(fā)明還保護(hù)W上所述試劑盒在檢測待測樣本中是否含有慶大霉素和哇諾酬類 藥物中的應(yīng)用。
[0019] W上任一所述哇諾酬類可為諾氣沙星和/或恩諾沙星和/或嗯哇酸和/或環(huán)丙沙星 和/或達(dá)氣沙星和/或氣甲哇和/或洛美沙星和/或依諾沙星和/或培氣沙星和/或麻保沙星 和/或氧氣沙星。
[0020] 本發(fā)明依靠免疫學(xué)、免疫化學(xué)基本原理和殘留分析技術(shù)手段，設(shè)計、合成小分子目 標(biāo)分析物半抗原，并與載體蛋白偶聯(lián)，制備有效人工抗原，免疫動物制備針對小分子分析物 的特異性抗體。利用抗原抗體的特異性免疫學(xué)反應(yīng)，定量的檢測樣品中微量小分子目標(biāo)分 析物。本發(fā)明提供的試劑盒能同時檢測樣本中是否含有慶大霉素和哇諾酬類藥物，具有前 處理簡單、靈敏度高、特異性強、適用范圍廣、操作簡便(對操作人員沒有專業(yè)要求）、快捷、 成本低廉、非常適合現(xiàn)場大批量樣本的篩選，可用于專業(yè)化驗、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生防疫、質(zhì)量監(jiān) 巧。、乳業(yè)企業(yè)等，具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟、社會效益。
【附圖說明】
[0021] 圖1為實施例1試劑盒檢測慶大霉素含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中，橫坐標(biāo)為各標(biāo)準(zhǔn)品溶 液中慶大霉素濃度(yg/L)，縱坐標(biāo)為百分巧光強度值(％)。
[0022] 圖2為實施例1試劑盒檢測環(huán)丙沙星含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中，橫坐標(biāo)為各標(biāo)準(zhǔn)品溶 液中環(huán)丙沙星濃度(yg/L)，縱坐標(biāo)為百分巧光強度值(％)。
【具體實施方式】
[0023] W下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。W下實施例中的定量試驗，均設(shè)置Ξ次重復(fù)實驗，結(jié)果取平 均值。
[0024] 慶大霉素原料藥:Sigma-Ald;rich，G1397。環(huán)丙沙星原料藥