用凝集測定檢測和分類抗凝血劑的制作方法
【專利說明】用凝集測定檢測和分類抗凝血劑 相關申請的交叉引用 本申請要求2014年7月31日提交的美國臨時申請?zhí)?2/031,371和2015年2月3日 提交的美國臨時申請?zhí)?2/111，376的優(yōu)先權，其中每一個在此通過引用以其整體作為參 考· 背景 本發(fā)明涉及凝血和止血領域. 隨著人口老齡化，涉及心臟和循環(huán)系統(tǒng)疾病的風險已成為日益關注的問題?？鼓獎?已被用于對抗和/或管理（如，預防）包括患者的心房顫動、肺栓塞、深靜脈血栓形成、靜脈 血栓栓塞、充血性心臟衰竭、中風、心肌梗塞和血液凝固性過高的綜合癥.在過去，抗凝血 劑藥物華法林，其減少了所有維生素K依賴性凝血因子的功能水平，被經常使用。然而，最 近改良的抗凝血劑已被開發(fā)為在凝血級聯反應中特異性靶向某些因子。 例如，口服抗凝血劑的引入已經改變有靜脈和動脈血栓栓塞疾病的患者的管理.不同 于傳統(tǒng)的口服維生素K拮抗劑（VKA)，最近開發(fā)的不普遍降低維生素K依賴性因子的口服 抗凝血劑以固定劑量給藥，并具有較低潛在的藥物與食物相互作用，因此消除了常規(guī)實驗 室監(jiān)測的要求（AnsellJ.等人，Chest133 :160S-198S，2008;AgenoW.等人，Chest141: e44S-88S，2012)。與VKA藥物如華法林相比，這些新制劑顯示出類似的或改良的功效和安 全性，并建立包括未分級肝素和低分子量肝素的非腸道藥劑。 然而，這些新的口服抗凝血劑的現有管理挑戰(zhàn)著臨床醫(yī)生和實驗室人員，當患者出現 出血傾向（如因外傷或手術期間）。缺乏現成的方法來確定抗凝作用的程度在臨床治療潛 在接受抗凝血劑的出血患者中產生重大挑戰(zhàn).在某些情況下，沒有有用的方法來檢測和監(jiān) 控這些藥劑（參見Miyares和Davis，Am.J.Health.Syst.Pharm. 69 :1473-1484, 2012)。 有一個快速方法來檢測取自患者樣品中抗凝血劑的存在將是有用的.確定患者的樣 品中有哪種類型的抗凝血劑也將是有用的. 實施方案概要 在一些實施方案中，本發(fā)明提供了一種快速和準確的方法以檢測取自患者的樣品中的 抗凝血劑的存在和逆轉。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了一種快速和準確的方法以鑒定 在樣品中是哪種類型的抗凝血劑。 因此，在第一方面，本發(fā)明提供了在懷疑有抗凝血劑的患者中檢測至少治療相關量的 (即，治療相關量或更高量）抗凝血劑的方法.該方法包括（a)使對照血液成分的對照樣 品，該對照樣品已知不包含抗凝血劑，在凝血因子Xa試劑的存在下經歷凝集測定以獲得對 照樣品的凝血測量結果；和（b)使來自懷疑有抗凝血劑的患者的血液成分的患者樣品，在 凝血因子Xa試劑存在下以凝集測定得到該患者樣品的凝血測量結果，其中患者樣品凝血 測量結果大于對照樣品凝血測量結果，表明所述抗凝血劑在患者中以治療相關量存在，且 其中患者樣品凝血測量結果小于或等于對照樣品凝血測量結果，表明在患者中不存在治療 相關量的抗凝血劑。在一些實施方案中，抗凝血劑是口服抗凝血劑.該口服抗凝血劑可以 是直接凝血酶抑制劑，或者可以是凝血因子Xa抑制劑. 在一些實施方案中，所述方法還包括：對被確定為存在于患者中的抗凝血劑分類，通過 (a)使所述對照血液成分的對照樣品，在蝰蛇毒試劑的存在下經歷凝集測定以獲得對照蝰 蛇毒凝血測量結果；和（b)使來自患者的血液成分的患者樣品，在蝰蛇毒試劑的存在下經 歷凝集測定以獲得患者蝰蛇毒凝血測量結果，其中當患者蝰蛇毒凝血測量結果大于對照蝰 蛇毒凝血測量結果時，則鑒定患者中的抗凝血劑為直接凝血酶抑制劑（DTI)，并且其中所述 患者蝰蛇毒凝血測量結果小于或等于對照蝰蛇毒凝血測量結果，鑒定患者中的抗凝血劑為 抗-凝血因子Xa抗凝血劑。 在另一個方面，本發(fā)明提供用于在懷疑有抗凝血劑的患者中檢測和/或分類治療相 關量或更高量的抗凝血劑的方法，其包括使來自患者的血液成分的第一樣品，在凝血因子 Xa試劑的存在下經歷凝集測定以獲得患者凝血因子Xa凝血測量結果，使來自患者的所述 血液成分的第二樣品，在蝰蛇毒試劑的存在下經歷凝集測定以獲得患者蝰蛇毒凝血測量結 果；以及比較患者凝血因子Xa的凝血測量結果和來自已知缺乏抗凝血劑的對照血液成分 的對照凝血因子Xa的凝血測量結果，以及比較患者蝰蛇毒凝血測量結果和來自對照血液 成分的對照蝰蛇毒凝血測量結果；其中所述患者蝰蛇毒凝血測量結果大于對照蝰蛇毒凝血 測量結果，則確定在患者中抗凝血劑以治療相關量或高于治療相關量存在，并確定該抗凝 血劑為直接凝血酶抑制劑（DTI)，并且其中患者凝血因子Xa凝血測量結果大于對照凝血因 子Xa凝血測量結果，則確定在患者中抗凝血劑以治療相關量或高于治療相關量存在，并鑒 定抗凝血劑為抗-凝血因子Xa抗凝血劑，并且其中患者凝血因子Xa凝血測量結果小于或 等于對照凝血因子Xa凝血測量結果，則確定在患者中缺乏治療相關量或高于治療相關量 的抗凝血劑. 在另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于從患者的血液成分中分類治療相關量或高于治 療相關量的抗凝血劑的方法，其包括：確定血液成分中抗凝血劑的存在，通過（i)使已知不 包含抗凝血劑的對照血液成分的第一部分，在凝血因子Xa試劑的存在下經歷凝集測定以 獲得對照凝血因子Xa凝血測量結果；和（ii)使來自患者的血液成分的第一部分，在凝血因 子Xa試劑的存在下經歷凝集測定以獲得患者凝血因子Xa凝血測量結果，其中所述患者凝 血因子Xa凝血測量結果大于對照凝血因子Xa凝血測量結果，表明在患者血液成分中所述 抗凝血劑以治療水平存在，和其中所述患者凝血因子Xa凝血測量結果小于或等于對照凝 血因子Xa凝血測量結果，表明在患者血液成分中缺乏治療相關量的抗凝血劑，以及分類抗 凝血劑，如果存在于患者的血液成分，通過（i)使對照血液成分的第二部分，在蝰蛇毒試劑 的存在下經歷凝集測定以獲得對照蝰蛇毒凝血測量結果；和（ii)使患者血液成分的第二 部分，在所述蝰蛇毒試劑的存在下經歷凝集測定以獲得患者蝰蛇毒凝血測量結果，其中當 患者蝰蛇毒凝血測量結果大于對照蝰蛇毒凝血測量結果時，則鑒定該抗凝血劑為直接凝血 酶抑制劑（DTI)，并且其中所述患者蝰蛇毒凝血測量結果小于或等于對照蝰蛇毒凝血測量 結果，鑒定所述抗凝血劑為抗-凝血因子Xa抗凝血劑. 在一些實施方案中，凝集測定選自凝血酶原時間（PT)測定、活化部分凝血活酶時間 (APTT)測定和活化凝血時間（ACT)測定. 在一些實施方案中，對照樣品的凝血測量結果的范圍為來自已知缺乏抗凝血劑的至少 兩個對照血液成分的至少兩個對照樣品的至少兩個凝血測量結果. 在一些實施方案中，凝集測定是粘彈性分析凝集測定.在一些實施方案中，使用含有 位于容器內的樣品的容器進行粘彈性分析.在一些實施方案中，使用容器和針進行粘彈性 分析，其中所述針相對于所述容器移動.在一些實施方案中，使用容器和針進行粘彈性分 析，其中所述容器相對于所述針移動。在一些實施方案中，所述容器沒有底面。 在各個實施方案中，所述患者是人.在一些實施方案中，患者正經歷包括手術、創(chuàng)傷、 出血、中風或血栓栓塞事件的條件。 在另一個方面，本發(fā)明提供了用于在懷疑有抗凝血劑的患者中分類治療相關量（或更 高）的抗凝血劑的方法.該方法包括（a)確定來自所述患者的血液成分中抗凝血劑的存 在，包括以下步驟：（i)使對照血液成分的對照樣品，所述對照血液成分已知不包含抗凝血 劑，在凝血因子Xa試劑的存在下經歷凝集測定以獲得對照樣品的凝血因子Xa的凝血測量 結果；和（ii)使來自患者的血液成分的患者樣品，在凝血因子Xa試劑的存在下經歷凝集測 定以獲得患者樣品的凝血因子Xa凝血測量結果，其中患者樣品的凝血因子Xa凝血測量結 果大于對照樣品的凝血因子Xa凝血測量結果，表明在患者中所述抗凝血劑以治療相關量 存在，并且其中第二樣品的凝血因子Xa凝血測量結果小于或等于對照樣品的凝血因子Xa 凝血測量結果，表明在患者中缺乏治療相關量的抗凝血劑；和（b)分類患者的抗凝血劑，其 包括以下步驟：（i)使對照血液成分的第二對照樣品，在蝰蛇毒試劑的存在下經歷凝集測 定以獲得第二對照樣品的蝰蛇毒凝血測量結果；和（ii)使來自患者血液成分的第二患者 樣品，在蝰蛇毒試劑的存在下經歷凝集測定以獲得第二患者樣品的蝰蛇毒凝血測量結果， 其中第二患者樣品的蝰蛇毒凝血測量結果大于第二對照樣品的蝰蛇毒凝血測量結果，鑒定 該抗凝血劑為直接凝血酶抑制劑（DTI)，并且其中所述第二患者樣品的蝰蛇毒凝血測量結 果小于或等于第二對照樣品的蝰蛇毒凝血測量結果，鑒定該抗凝血劑為抗-凝血因子Xa試 劑· 在另一個方面，所述方法用于在懷疑有抗凝血劑的患者中檢測治療相關量或更高量的 抗凝血劑的逆轉.所述方法包括通過（a)使已知缺乏（S卩，沒有）抗凝血劑的對照血液成分 的樣本，在蝰蛇毒試劑的存在下經歷凝集測定以獲得對照蝰蛇毒凝血測量結果；(b)使已 知缺乏（即，沒有）抗凝血劑的對照血液成分的樣品，在凝血因子Xa試劑的存在下經歷凝 集測定以獲得對照凝血因子Xa凝血測量結果；(c)使來自已知或懷疑含有逆轉劑或解毒劑 (例如，idarucizumab或andexanet)的患者的血液成分，在抗凝血劑的存在或缺乏下，在蜂 蛇毒試劑的存在下，經歷凝集測定以獲得患者蝰蛇毒凝血測量結果，和（d)使來自已知或 懷疑含有逆轉劑或解毒劑（例如，idarucizumab和/或andexanet)的患者的血液成分，在 抗凝血劑的存在或缺乏下，在凝血因子Xa試劑的存在下，經歷凝集測定以獲得患者凝血因 子Xa凝血測量結果，和比較對照蝰蛇毒凝血測量結果和患者蝰蛇毒凝血測量結果，和比較 對照凝血因子Xa凝血測量結果和患者凝血因子Xa凝血測量結果.當患者蝰蛇毒凝血測量 結果和/或患者凝血因子Xa凝血測量結果小于或等于對照蝰蛇毒凝血測量結果和/或對 照凝血因子Xa凝血測量結果時，則確定患者含有逆轉劑，所述逆轉劑已逆轉了患者的抗凝 血劑的抗凝血活性.在一些實施方案中，所述逆轉是在患者的抗凝血劑的抗凝血活性的完 全逆轉.在一些實施方案中，所述逆轉是在患者的抗凝血劑的抗凝血活性的部分逆轉.在 一些實施方案中，所述逆轉劑是凝血酶原復合濃縮物（PCC)，或用于特異性逆轉直接凝血酶 抑制劑或凝血因子Xa抑制劑的活性物質如單克隆抗體，或肽，或可逆轉直接凝血酶抑制劑 和凝血因子Xa抑制劑的試劑. 在一些實施方案中，抗凝血劑是口服抗凝血劑。所述口服抗凝血劑可以是直接凝血酶 抑制劑，或者可以是凝血因子Xa抑制劑。 在一些實施方案中，凝集測定選自凝血酶原時間（PT)測定、活化部分凝血活酶時間 (APTT)測定和活化凝血時間（ACT)測定. 在一些實施方案中，對照樣品的凝血測量結果的范圍為來自已知缺乏抗凝血劑的至少 兩個對照血液成分的至少兩個對照樣品的至少兩個凝血測量結果. 在一些實施方案中，凝集測定是粘彈性分析凝集測定.在一些實施方案中，使用含有 在容器內的樣本的容器進行粘彈性分析。在一些實施方案中，使用容器和針進行粘彈性分 析，其中所述針相對于所述容器移動。在一些實施方案中，使用容器和針進行粘彈性分析， 其中所述容器相對于所述針移動.在一些實施方案中，所述容器沒有底面. 在各個實施方案中，所述患者是人.在一些實施方案中，患者正經歷包括手術、創(chuàng)傷、 出血、中風或血栓栓塞事件的條件. 在一些實施方案中，對照樣品的凝血因子Xa凝血測量結果的范圍為來自已知缺乏抗 凝血劑的至少兩個對照血液成分的至少兩個對照樣品的至少兩個凝血因子Xa凝血測量結 果。在一些實施方案中，對照血液成分的蝰蛇毒凝血測量結果的范圍為已知缺乏抗凝血劑 的至少兩個對照血液成分的至少兩個蝰蛇毒凝血測量結果. 在另一個方面，本發(fā)明提供了用于在懷疑有抗凝血劑的患者中檢測治療相關量或更高 量的抗凝血劑的方法，該方法包括使來自患者的血液成分的患者樣品，在凝血因子Xa試劑 的存在下經歷凝集測定以獲得患者樣品的凝血測量結果，其中所述患者樣品的凝血測量結 果大于已知缺乏抗凝血劑的對照血液成分的對照樣品的凝血測量結果，則確定在患者中抗 凝血劑以治療相關量存在. 在一些實施方案中，患者樣品的凝血測量結果比對照樣品的凝血測量結果大至少1. 25 倍，則確定在患者中抗凝血劑以治療相關量存在.在一些實施方案中，患者樣品的凝血測 量結果比對照樣品的凝血測量結果大至少1. 5倍，則確定在患者中抗凝血劑以治療相關量 存在。 在一些實施方案中，凝集測定選自凝血酶原時間（PT)測定、活化部分凝血活酶時間 (APTT)測定和活化凝血時間（ACT)測定。 在一些實施方案中，對照樣品的凝血測量結果的范圍為來自已知缺乏抗凝血劑的至少 兩個對照血液成分的至少兩個對照樣品的至少兩個凝血測量結果. 在一些實施方案中，凝集測定是粘彈性分析凝集測定.在一些實施方案中，使用含有 位于容器內的樣品的容器進行粘彈性分析。在一些實施方案中，使用容器和針進行粘彈性 分析，其中所述針相對于所述容器移動.在一些實施方案中，使用容器和針進行粘彈性分 析，其中所述容器相對于所述針移動.在一些實施方案中，所述容器沒有底面。 在各個實施方案中，所述患者是人。在一些實施方案中，患者正經歷包括手術、創(chuàng)傷、出 血、中風或血栓栓塞事件的條件。 在一些實施方案中，對照樣品的凝血測量結果的范圍為來自已知缺乏抗凝血劑的至少 兩個對照血液成分的至少兩個對照樣品的至少兩個凝血測量結果. 在一些實施方案中，抗凝血劑是口服抗凝血劑.所述口服抗凝血劑可以是直接凝血酶 抑制劑，或者可以是凝血因子Xa抑制劑. 還有在另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于在懷疑有抗凝血劑的患者中分類治療相關 量或更高量的抗凝血劑的方法，該方法包括：(a)使來自患者的血液成分的第一患者樣品， 在凝血因子Xa試劑的存在下經歷凝集測定以獲得患者血液成分的凝血因子Xa的凝血測量 結果，其中患者血液成分的所述凝血因子Xa凝血測量結果大于已知缺乏抗凝血劑的對照 血液成分的對照血液樣品的凝血因子Xa的凝血測量結果，則確定在患者中所述抗凝血劑 以治療相關量存在；和（b)使來自患者的血液成分的第二患者樣品，在蝰蛇毒試劑的存在 下經歷凝集測定以獲得患者血液成分的蝰蛇毒凝血測量結果；其中第二患者樣品的蝰蛇毒 凝血測量結果大于對照血液成分的對照樣品的蝰蛇毒凝血測量結果，鑒定所述抗凝血劑為 直接凝血酶抑制劑（DTI)，并且其中所述第二患者樣品的蝰蛇毒凝血測量結果小于或等于 對照樣品的蝰蛇毒凝血測量結果，鑒定所述抗凝血劑為抗-凝血因子Xa試劑. 在另一個方面，本發(fā)明提供用于在患者中檢測和分類治療相關量或更高量的抗凝血劑 的方法。該方法包括使對照血液成分的對照樣品（已知不包含抗凝血劑），在蝰蛇毒試劑的 存在下經歷凝集測定以獲得對照蝰蛇毒測量結果；和使來自懷疑有抗凝血劑的患者的血液 成分樣品，在蝰蛇毒試劑的存在下經歷凝集測定以獲得患者蝰蛇毒凝血測量結果，其中患 者樣品的凝血測量結果大于對照樣品的凝血測量結果，表明在患者中抗凝血劑以治療相關 量或更高量存在，并將其分類為DTI。 本發(fā)明還提供了用于在懷疑有抗凝血劑的患者中檢測和分類治療相關量或更高量的 抗凝血劑的方法。該方法包括：(a)使來自患者的血液成分的第一患者樣品，在蝰蛇毒試劑 的存在下經歷凝集測定以獲得患者血液成分的蝰蛇毒凝血測量結果，其中患者血液成分的 蝰蛇毒凝血測量結果大于已知缺乏抗凝血劑的對照血液成分的對照血液樣品的蝰蛇毒凝 血測量結果，則確定在患者中抗凝血劑以治療相關量存在，并確定所述抗凝血劑為直接凝 血酶抑制劑（DTI);和（b)使來自患者血液成分的第二患者樣品，在凝血因子Xa試劑的存 在下經歷凝集測定以獲得第二患者樣品的凝血因子Xa凝血測量結果；其中第二患者樣品 的凝血因子Xa凝血測量結果大于對照血液成分的對照樣品的凝血因子Xa凝血測量結果， 則確定在患者中抗凝血劑以治療相關量存在，并鑒定所述抗凝血劑為抗-凝血因子Xa，以 及其中第二患者樣品的凝血因子Xa凝血測量結果小于或等于對照樣品的凝血因子Xa凝血 測量結果，則確定所述樣品無抗凝血劑. 在一些實施方案中，患者樣品的凝血因子Xa凝血測量結果比對照樣品的凝血因子Xa凝血測量結果大至少1. 25倍，則確定在患者中抗凝血劑以治療相關量存在.在一些實施方 案中，患者樣品的凝血因子Xa凝血測量結果比對照樣品的凝血因子Xa凝血測量結果大至 少1. 5倍，則確定在患者中抗凝血劑以治療相關量存在. 在一些實施方案中，患者樣品的蝰蛇毒凝血測量結果比對照樣品的蝰蛇毒凝血測量結 果大至少1. 25倍，鑒定該抗凝血劑為直接凝血酶抑制劑（DTI).在一些實施方案中，患者樣 品的蝰蛇毒凝血測量結果比對照樣品的蝰蛇毒凝血測量結果大至少1. 5倍，鑒定該抗凝血 劑為直接凝血酶抑制劑（DTI). 在一些實施方案中，抗凝血劑是口服抗凝血劑。所述口服抗凝血劑可以是直接凝血酶 抑制劑，或者可以是凝血因子Xa抑制劑. 在一些實施方案中，凝集測定選自凝血酶原時間（PT)測定、活化部分凝血活酶時間 (APTT)測定和活化凝血時間（ACT)測定。 在一些實施方案中，對照樣品的凝血測量結果的范圍為來自已知缺乏抗凝血劑的至少 兩個對照血液成分的至少兩個對照樣品的至少兩個凝血測量結果. 在一些實施方案中，凝集測定是粘彈性分析凝集測定.在一些實施方案中，使用含有 位于容器內的樣品的容器進行粘彈性分析.在一些實施方案中，使用容器和針進行粘彈性 分析，其中所述針相對于所述容器移動.在一些實施方案中，使用容器和針進行粘彈性分 析，其中所述容器相對于所述針移動.在一些實施方案中，所述容器沒有底面。 在各個實施方案中，所述患者是人。在一些實施方案中，患者正經歷包括手術、創(chuàng)傷、出 血、中風或血栓栓塞事件的條件。 在一些實施方案中，對照樣品的凝血因子Xa凝血測量結果是來自已知缺乏抗凝血劑 的至少兩個對照血液成分的至少兩個對照樣品的至少兩個凝血因子Xa凝血測量結果。在 一些實施方案中，對照血液成分的蝰蛇毒凝血測量結果的范圍為已知缺乏抗凝血劑的至少 兩個對照血液成分的至少兩個蝰蛇毒凝血測量結果. 在不同實施方案中，對確定為含有存在治療相關量或更高量的抗凝血劑的患者施用 治療相關量的逆轉劑。在一些實施方案中，所述逆轉劑是凝血酶原復合濃縮物。在一些實 施方案中，對確定為含有存在治療相關量或更高