一種樣品前處理技術(shù)結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用測定水環(huán)境中10種抗生素的方法
【專利說明】一種樣品前處理技術(shù)結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用測定水環(huán)境中?ο種抗 生素的方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及測定水中微量有機(jī)污染物的檢測方法，特別地提供一種新的樣品前處 理方式和靈敏的檢測方式，具體來說是樣品前處理技術(shù)結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)直接測定水樣中 10種常見抗生素的含量，屬于水環(huán)境中微量有機(jī)污染物質(zhì)殘留安全檢測領(lǐng)域。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 抗生素主要是由細(xì)菌、霉菌或其他微生物產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物或人工合成的類似 物，主要用于治療各種細(xì)菌感染或致病微生物感染類疾病，為人類健康事業(yè)作出了巨大貢 獻(xiàn)。但是，近年來抗生素濫用現(xiàn)象十分嚴(yán)重，衛(wèi)生部曾表示，在中國，患者抗生素的使用率達(dá) 到70%，是歐美國家的兩倍，但真正需要使用的不到20%。此外，抗生素的濫用除了體現(xiàn)在 醫(yī)藥行業(yè)外，也體現(xiàn)在畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及工業(yè)上。
[0003] 抗生素的濫用給我國地表水造成了嚴(yán)重的污染。有報(bào)道稱，已有68種抗生素在我 國的地表水環(huán)境中被檢出，而且被檢出抗生素的總體濃度水平與檢出頻率均較高，其中一 些抗生素在珠江、黃浦江等地的檢出頻率高達(dá)100%，有些抗生素檢出的濃度高達(dá)每升幾百 納克，工業(yè)發(fā)達(dá)的國家則小于20納克。這些在水環(huán)境中長期存在的抗生素會(huì)誘導(dǎo)微生物的 耐藥性，并最終通過食物鏈對(duì)人類健康構(gòu)成潛在威脅，控制水環(huán)境中的抗生素已刻不容緩。
[0004] 樣品的前處理是關(guān)系到分析結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵步驟，有調(diào)查顯示在整個(gè)色譜分析 過程中，30%的誤差來源于樣品前處理。由此可見，要保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須從樣品 前處理技術(shù)入手。隨著人們對(duì)于水環(huán)境中抗生素問題的日益重視，有關(guān)水環(huán)境中抗生素殘 留檢測的專利和論文已有公開發(fā)表。例如中國專利公開號(hào)CN101639466A公開了一種測定 水環(huán)境中磺胺和抗生素的SPE-HPLC方法；中國專利公開號(hào)CN101696964A公開了一種針對(duì) 水環(huán)境中氟喹諾酮的SPE-HPLC-熒光方法；中國專利公開號(hào)CN103336080A公開了一種測定 水環(huán)境中四環(huán)素的HLB-HPLC-MS/MS方法；中國專利公開號(hào)CN103278587A公開了一種針對(duì) 水環(huán)境中頭孢的HLB-HPLC-MS方法等，這些方法的前處理方式主要是以固相萃取為主。水 環(huán)境中物染污物的種類多，存在形態(tài)各異，濃度較低而且環(huán)境基質(zhì)比較復(fù)雜，采取固相萃取 為前處理方式，可以去除不需要的雜質(zhì)，降低基質(zhì)效應(yīng)。但是，經(jīng)固相萃取后，樣品中待測物 的濃度在一定程度上會(huì)被稀釋，這在一定程度上限制了其使用。
[0005] 分散液液微萃?。―LLME)是由Rezaee等人于2006年首次提出的前處理方法，具 有操作簡單，有機(jī)試劑用量少，富集倍數(shù)大等優(yōu)點(diǎn)，但是其不適用于環(huán)境等復(fù)雜基質(zhì)。
[0006] 隨著水安全標(biāo)準(zhǔn)的日益提高，對(duì)于能夠快速、靈敏、準(zhǔn)確地測定水源中盡可能多的 抗生素殘留存在迫切需要，也是目前水環(huán)境領(lǐng)域中深入研究的重點(diǎn)課題之一。超高效液相 色譜-質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS)是21世紀(jì)初發(fā)展起來的一種分析技術(shù)，它是一種結(jié)合了UPLC 的高效分離能力與MS/MS的高靈敏度和極強(qiáng)專屬性的分離檢測技術(shù)，具有應(yīng)用范圍廣、分 離能力強(qiáng)、靈敏度高、分析速度快和自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已成為有機(jī)物分析，特別是 藥物分析的重要方法之一。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0007] 本發(fā)明的目的旨在克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種同時(shí)測定水環(huán)境（飲用水、自來 水、河水、污水處理廠進(jìn)出水）中10種不同結(jié)構(gòu)抗生素的方法。本發(fā)明采用固相萃取結(jié)合分 散液液微萃取作為水環(huán)境樣品的前處理技術(shù)，并利用超高液相色譜-質(zhì)譜連用為檢測器， 克服了現(xiàn)有方法有機(jī)試劑消耗大、干擾多以及檢測限等問題，能夠快速檢測水環(huán)境中磺胺 嘧啶、磺胺甲惡唑、霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、氯霉素、頭孢呋辛酯和 替硝唑10種抗生素的含量，適用對(duì)象廣，測定結(jié)果靈敏，準(zhǔn)確，干擾少。
[0008] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：
[0009] -種分離富集并同時(shí)檢測水環(huán)境中10種抗生素的方法，其具體步驟如下：
[0010] 固相萃取-液液微萃取分離富集條件的優(yōu)化
[0011] 選擇環(huán)境中常見的抗生素（磺胺嘧啶、磺胺甲惡唑、土霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、環(huán) 丙沙星、左氧氟沙星、氯霉素、頭孢呋辛酯、替硝唑），采用單因素試驗(yàn)，對(duì)SPE-DLLME水中殘 留抗生素進(jìn)行條件考察，包括固相萃取小柱的種類、固相萃取pH值、洗脫劑種類、分散液液 微萃取萃取劑和分散劑的種類和用量等，選擇最優(yōu)的條件，得到在最優(yōu)條件下對(duì)抗生素的 最大萃取率；
[0012] 本發(fā)明包括如下步驟：
[0013] (1)水樣的預(yù)處理
[0014] 采集、過濾后的水樣加入金屬螯合劑Na2-EDTA，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至3. 0-4. 0 ;
[0015] (2)固相萃?。⊿PE)富集濃縮過程
[0016] 依次用甲醇和等體積的純水活化固相萃取小柱，將預(yù)步驟（1)中處理過的水樣過 柱，富集，純水淋洗，甲醇洗脫，洗脫液用氮?dú)獯蹈?，得殘?jiān)鼈溆茫?br>[0017] (3)液液微萃?。―LLME)富集濃縮過程
[0018] 將步驟（2)中得到的殘?jiān)眉状既芙?，往該樣品加入用稀鹽酸調(diào)節(jié)的pH為 3. 0-4. 0的純水，再分別加入二氯甲烷和體積比為1:1的分散劑甲醇-乙腈，渦旋，超聲，離 心，去除上層水，下層有機(jī)相用氮?dú)獯蹈桑脷堅(jiān)鼈溆谩?br>[0019] (4)超高液相-質(zhì)譜聯(lián)用測定水環(huán)境中10種抗生素
[0020] 超高液相色譜分離
[0021] 有機(jī)相為乙腈（B)，水相為體積比為0. 1%的甲酸水溶液（A)，采取梯度洗脫程序， 其梯度洗脫程序?yàn)椹朹5min，流動(dòng)相乙腈與0. 1 %甲酸-水的比例從30:70,改變?yōu)?0:30;流 速為0· 2mL·min\柱溫為35°C。
[0022] 質(zhì)譜檢測
[0023] 離子源為電噴霧離子化源（ESI源），源溫度為120°C，錐孔電壓：30V，提取離子電 壓為3kV，毛細(xì)管電壓為3kV，脫溶劑氣溫度：350°C，脫溶劑氣流速為450L/hr，掃描時(shí)間： 0.ls，檢測方式選擇多反應(yīng)離子檢測（MRM);
[0024] 精密量取乙腈-水（35:65)溶液100μL溶解步驟⑶中的殘?jiān)?，渦旋后，用 0. 45μm濾膜過濾，得供試品，進(jìn)樣量10μL。
[0025] 其中，步驟（1)中水樣體積（mL)與金屬螯合劑Na2-EDTA的用量（g)為：1000:1， 取水樣250-500mL，加入螯合劑Na2-EDTA(0.lg/100mL水），所述的酸為稀鹽酸；
[0026] 步驟（2)中固相萃取小柱為聚合物填料萃取小柱，活化固相萃取小柱的甲醇和純 化水的用量為：小柱體積的1-2倍，洗脫用甲醇的用量為：小柱體積的1-2倍；
[0027] 步驟⑶中二氯甲燒、甲醇-乙腈（1:1)的用量分別為：700-900μL和 1100-1300yL；
[0028] 禍旋時(shí)間：l_2min超聲時(shí)間：4_6min離心轉(zhuǎn)速：3000-5000rpm離心時(shí)間：5_8min
[0029] 具體地，本發(fā)明可以采用如下方法制備：
[0030] (1)水樣的預(yù)處理
[0031] 水樣采集后封裝冷凍，臨用前解凍，過濾，其過濾方式為依次經(jīng)雙層定量濾紙過濾 1-4遍（根據(jù)水樣潔凈程度），0. 45μm濾膜過濾1遍；定量取過濾后的水樣250-500mL，加 入金屬螯合劑Na2-EDTA(0.lg/100mL水），用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至3. 0-4. 0;
[0032] (2)固相萃?。⊿PE)富集濃縮過程
[0033] 依次用小柱體積1-2倍體積的甲醇和等體積的純水活化聚合物填料萃取小柱， 將預(yù)步驟（1)中處理過的水樣以5-10mL·min1過柱，富集完成后用小柱體積的1-2倍的 純水淋洗并將小柱置于真空狀態(tài)下干燥l〇min后，用小柱體積的1-2倍的甲醇以流速為 1.OmL·min1洗脫目標(biāo)待測物，接收容器為的具塞玻璃離心管，洗脫液在30-35Γ水浴條件 下，用氮?dú)獯蹈?，得殘?jiān)鼈溆谩?br>[0034] (3)液液微萃?。―LLME)富集濃縮過程
[0035] 將步驟（2)中得到的殘?jiān)?0yL甲醇溶解，往該樣品中加入用稀鹽酸調(diào)節(jié)后pH 為3. 0-4. 0的水5mL，再分別加入萃取劑二氯甲烷700-900μL和體積比為1:1的分散劑甲 醇-乙臆 1100-1300μL，禍旋l_2min，超聲 4_6min，在 3000-5000rpm下離心 5_8min，去除 上層水，下