一種液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯的方法及其在富含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯的油脂樣品分析中的應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(Long-chainpolyunsaturated fatty acids，LC-PUFAs)是指含有兩個(gè)或兩個(gè)以上雙鍵且碳鏈長(zhǎng)度為18-22個(gè)碳原子的直鏈脂肪酸，根據(jù)第一個(gè)不飽和鍵位置不同，PUFAs可分為ω-3、ω-6、ω-7、ω-9等系列。ω-3系多不飽和脂肪酸主要包括 α -亞麻酸(a -Linolenic acid，a -Ln)、二十碳五稀酸(Eicosapentaenoic acid,EPA)和二十二碳六稀酸(Docosahexaenoic acid，DHA) ; ω-6系多不飽和脂肪酸主要有亞油酸(Leinoleic acid，L)、γ -亞麻酸(Linolenic acid，γ -Ln)和花生四稀酸(ARA)。多不飽和脂肪酸與人體健康息息相關(guān)，尤其是DHA，EPA, AM等長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFAs)，在維護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，預(yù)防和治療心血管疾病，動(dòng)脈硬化，癌癥，肥胖等疾病方面具有明顯效果。而甘油三醋(Triacylglycerols，TAGs)作為脂肪酸最主要的存在形式，由I個(gè)甘油分子和3個(gè)脂肪酸分子脫水縮合而成。脂肪酸在甘油三酯中甘油骨架上的分布位置有兩類:sn-l，3(α )和sn_2 ( β )。長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸在TAGs中的分布位置決定著油脂的吸收代謝情況。例如，二十二碳五烯酸(EPA)及二十二碳六烯酸(DHA)處于sn-2位比處于sn-1，3位的吸收利用要有效得多。因此，對(duì)LC-PUFAs TAGs中脂肪酸酰基位置進(jìn)行剖析對(duì)于揭示LC-PUFAs的營(yíng)養(yǎng)學(xué)特性有著重要的意義。
[0003]HPLC法不受熱穩(wěn)定性和揮發(fā)性的限制，已廣泛用于油脂分析中。迄今為止，非水反相液相色譜和正相銀離子液相色譜是分離油脂中甘油三酯組成的兩種主要方法。甘油三酯在非水反相液相色譜(商品化的C18柱)中的保留取決于當(dāng)量碳數(shù)(equivalent carbonnumber，ECN)，即甘油三酯中?；溈偺紨?shù)(CNs)減去兩倍的雙鍵數(shù)(DBs)。但非水反相液相色譜很難分離具有相同ECN值的甘油三酯；對(duì)甘油三酯位置異構(gòu)體的分離選擇性也較差。銀離子正相液相色譜利用銀離子(Ag+)與甘油三酯分子中不飽和脂肪酸雙鍵的絡(luò)合吸附作用來提高對(duì)甘油三酯化合物的分離選擇性。甘油三酯在銀離子色譜中的保留取決于甘油三酯的雙鍵數(shù)目、雙鍵位置等因素。但雙鍵數(shù)越多，TAG在銀離子色譜柱上的保留時(shí)間越長(zhǎng)甚至根本不能被洗脫；且即使將多根銀離子色譜柱串聯(lián)使用，仍無法實(shí)現(xiàn)雙鍵數(shù)大于7的LC-PUFA TAG位置異構(gòu)體的分離。
[0004]LC-PUFAs TAGs碳鏈長(zhǎng)，雙鍵數(shù)目多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，同時(shí)存在大量的同分異構(gòu)體和位置異構(gòu)體，其在色譜柱上的保留行為與低碳鏈數(shù)、低飽和度的甘油三酯有所不同，傳統(tǒng)的分析低碳鏈數(shù)、低飽和度的甘油三酯的液相色譜方法并不適合用于LC-PUFAs TAGs的分析。因此建立一種液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯的方法顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用分析長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯的方法，該方法操作簡(jiǎn)單，能夠?qū)崿F(xiàn)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯的高效、高通量的檢測(cè)。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0007]一種液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用分析長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯的方法，使用的色譜柱為安捷倫Zorbax Eclipse Plus PAH色譜柱，該色譜柱具有“槽式結(jié)構(gòu)”和疏水相互作用，可以實(shí)現(xiàn)單柱液相色譜分離長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯及其?；恢卯悩?gòu)體，其特征在于:它包括如下步驟:
[0008]I)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯的液相色譜-質(zhì)譜分離:
[0009]長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品用異丙醇溶解，配成lmg/mL的溶液，進(jìn)樣前用相應(yīng)的流動(dòng)相稀釋成0.01mg/mL，此處流動(dòng)相為:90% (v/v)乙腈，10%異丙醇(v/v)；液相色譜柱為安捷倫Zorbax Eclipse Plus PAH(4.6mmX 150mm 1.d.)色譜柱，進(jìn)樣體積為10 μ L ;采用梯度洗脫，流動(dòng)相為A:乙腈、B:異丙醇；梯度洗脫:0-30min (不含Omin)，90%-30% (v/v) A (10%-70% B，v/v)，保持 Imin ;31_31.Imin (不含 31min)，30-90% (v/v)A(70-10% B, v/v) ;31.1- 35min (不含 31.lmin)，90% (v/v) A(30% B, v/v);流速 lmL/min;在該條件下同時(shí)實(shí)現(xiàn)8種雙鍵數(shù)不同、當(dāng)量碳數(shù)相同和不同的甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品的分離；
[0010]2)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯酰基位置異構(gòu)體的液相色譜-質(zhì)譜分離:
[0011]長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯酰基位置異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品用異丙醇溶解，配成lmg/mL的溶液，進(jìn)樣前用流動(dòng)相稀釋成0.01mg/mL，此處流動(dòng)相為:90% (v/v)乙腈，10% (v/v)異丙醇；進(jìn)樣體積為10 μ L，液相色譜柱為安捷倫Zorbax Eclipse Plus PAH(4.6mmX 250mm1.d.)色譜柱；采用梯度洗脫，流動(dòng)相為A:乙腈、B:異丙醇；梯度洗脫:0-60min，90% -30%(v/v) A (10% -70% B，v/v);保持 lmin，61.0-61.lmin, 30-90% (v/v) A (70-10 % B，v/v)；
61.1 - 65min,90% (v/v) A (10% B, v/v);流速lmL/min ;在該條件下實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯?；恢卯悩?gòu)體EpEpP/EpPEp標(biāo)準(zhǔn)品的分離；
[0012]3)在分析油脂樣品(富含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯的油脂樣品)時(shí)，包括如下步驟:
[0013](I)富含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯的油脂樣品用丙酮溶解，配成lmg/mL的溶液，進(jìn)樣前用流動(dòng)相稀釋成0.05mg/mL，此處流動(dòng)相為:90%乙腈，10%異丙醇(v/v);進(jìn)樣體積為10uL，采用步驟2)的方法，測(cè)試富含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯的油脂樣品，得到富含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯的液相色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)；
[0014](2)根據(jù)液相色譜一質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)富含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯的油脂樣品中的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯及其?；恢卯悩?gòu)體進(jìn)行鑒定和定性分析；
[0015]其中:
[0016]a)所得的數(shù)據(jù)為富含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯的油脂樣品中甘油三酯的譜圖和譜峰數(shù)據(jù)；
[0017]b)所述的富含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯的油脂樣品包括海豹油、魚油或微生物油等。
[0018]所述步驟3)包括如下具體步驟:富含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯的油脂樣品中長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯的分離檢測(cè):油脂樣品用丙酮溶解，配成lmg/mL的溶液，進(jìn)樣前用流動(dòng)相稀釋成0.05mg/mL，此處流動(dòng)相為:90%乙腈，10%異丙醇(v/v);進(jìn)樣體積為 10 μ L，液相色譜柱為安捷倫 Zorbax Eclipse Plus PAH(4.6mmX 250mm 1.d.)色譜柱；采用梯度洗脫，流動(dòng)相為A:乙腈、B:異丙醇；梯度洗脫:0-60min,90% -30% (v/v)A(10% -70% B, v/v);保持 lmin，61.0-61.lmin，30-90% (v/v) A(70-10% B, v/v) ；61.1 -65min,90% (v/v) A(10% B，v/v);流速lmL/min ;柱溫35°C ;在該條件下實(shí)現(xiàn)富含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯的油脂樣品中長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯的分離，得到富含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯的液相色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)；進(jìn)一步根據(jù)液相色譜一質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)富含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯的油脂樣品中的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯及其?；恢卯悩?gòu)體進(jìn)行鑒定和定性分析。
[0019]對(duì)富含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯的油脂樣本進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，液相色譜-質(zhì)譜分析得到油脂樣品中甘油三酯的定性數(shù)據(jù)。其中，液相色譜分析條件為美國(guó) Agilent 公司 Agilentl200 液相色譜儀，配有美國(guó) Applied B1systems 公司 4000Q_Trap質(zhì)譜檢測(cè)器。質(zhì)譜 APCI (atmospheric pressure chemical 1nizat1n)模式:正離子；溫度(Temperature, TEM):450°C ;掃描模式:EMS_EPI ;掃描速度:1000u/s ;離子源氣體 I (1nSource Gasl, GSl):344.75k