丹酰肼及其衍生物在糖蛋白特異性檢測(cè)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及糖蛋白特異性英光檢測(cè)技術(shù)，具體地說是丹醜脫及其衍生物在糖蛋白 特異性英光檢測(cè)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)糖基化修飾在生命科學(xué)研究領(lǐng)域具有至關(guān)重要的作用，作為最主要和普遍 的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一，目前已知哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)中至少有二分之一發(fā)生了糖基化，該 些糖蛋白廣泛分布于組織、細(xì)胞、體液中，特別是在細(xì)胞膜表面、體液等中含量豐富，糖基化 對(duì)于蛋白質(zhì)的折疊、運(yùn)輸和定位等都起著重要作用，并參與受體激活、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞載附 等諸多重要的生物過程。糖蛋白數(shù)量變化或糖鏈結(jié)構(gòu)的改變，都可能導(dǎo)致疾病發(fā)生。不但 目前已知的很多疾病的診斷標(biāo)志物是糖蛋白，而且通過國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)證的藥物中，糖蛋白也 占到較高的比例。
[0003]目前糖蛋白檢測(cè)領(lǐng)域試劑盒主要集中于外國(guó)的生物試劑公司，且多數(shù)產(chǎn)品均W高 附加值的價(jià)格在市場(chǎng)銷售，價(jià)格高昂，不利于生物技術(shù)基礎(chǔ)研究的發(fā)展。尤其國(guó)內(nèi)利用現(xiàn)有 的生物試劑進(jìn)行生物實(shí)驗(yàn)成本居高不下，無法實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)效益與實(shí)驗(yàn)共同發(fā)展。本發(fā)明開發(fā) 的丹醜脫及其衍生物英光染色方法靈敏度接近Pro-QEmerald488染色法，是一種靈敏、便 捷、特異的糖蛋白英光檢測(cè)技術(shù)，有較好的基礎(chǔ)與臨床意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供丹醜脫及其衍生物在糖蛋白特異性英光檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明所述的丹醜脫相關(guān)化合物是指W丹醜脫陰離子為母核的軸鹽、鐘鹽和饋鹽 等。
[0006] 丹醜脫母核為：
[0007]
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明還提供了應(yīng)用丹醜脫進(jìn)行糖蛋白特異性英光檢測(cè) 的方法包括如下步驟：
[0009] 1)將經(jīng)SDS-PAGE電泳后含蛋白質(zhì)樣品的凝膠置于固定液中固定10~60min，棄 固定液。
[0010] 優(yōu)選的固定時(shí)間為30min，固定液可W是含有40%己醇和10%己酸的水溶液；
[0011] 2)在高楓酸溶液里氧化10~40min，其中高楓酸溶液為含重量體積比0. 1~1% 的高楓酸及按體積比0. 5~5 %的己酸水溶液。然后用按體積比0. 5~5 %的己酸水溶液沖 洗2~5次，每次1~lOmin;優(yōu)選的氧化時(shí)間為20min，優(yōu)選的氧化液組成為含重量體積比 0. 5 %的高楓酸及按體積比3 %的己酸水溶液；氧化后優(yōu)選的洗脫次數(shù)為3次，每次5min，優(yōu) 選的洗脫液組成為體積比為3%的己酸溶液。
[0012] 3)加入染色液5~60min，其中染色液為含重量體積比0. 001~0. 02%的丹醜脫 或其衍生物及按體積比0. 5~5%的己酸水溶液。優(yōu)選的染色時(shí)間為30min，優(yōu)選的染色液 組成為含重量體積比0. 006%的丹醜脫及按體積比3%的己酸水溶液；
[0013] 4)加入洗脫液，洗脫液組成為體積比0. 5~5. 0%的己酸水溶液，洗脫1~3次， 每次5~20min。優(yōu)選的洗脫次數(shù)為2次，每次lOmin，優(yōu)選的洗脫液組成為按體積比3%的 己酸水溶液。
[0014] 5)檢測(cè)，可在激光掃描儀下觀察染色后的糖蛋白。
[0015] 前期研究表明該技術(shù)有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0016] 1)靈敏度高；丹醜脫糖蛋白特異性英光檢測(cè)法靈敏度同Pro-QEmerald488靈敏度 相當(dāng)；
[0017] 2)操作簡(jiǎn)單迅速：操作步驟少，可在2個(gè)小時(shí)內(nèi)完成；
[0018] 3)重現(xiàn)性好；受溫度、搖床擺動(dòng)頻率等外部條件影響較小；
[001引 4)可逆性好；容易脫色；
[0020] W質(zhì)譜兼容性好：由于丹醜脫英光檢測(cè)法不影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，所W可與 MLDI-T0F等質(zhì)譜儀高度兼容；
[0021] 6)使用安全；采用毒性低的染料，提高實(shí)驗(yàn)操作的安全性，對(duì)環(huán)境污染小；
[002引 7)成本低。
【附圖說明】
[0023]圖1.丹醜脫的化學(xué)結(jié)構(gòu)；
[0024]圖2.在一向SDS-PA(iE膠上，丹醜脫糖蛋白英光染色法與其它染色法檢測(cè)蛋白 質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品效果的比較。（A)丹醜脫糖蛋白英光染色法，炬)Pro-QEmerald糖蛋白英光染色 法，（C)SYPRORuby全蛋白英光染色法。Pro-Q血erald糖蛋白英光染色法和SYPR0Ruby 全蛋白英光染色法均按照文獻(xiàn)記載操作。采用Sigma公司的8種不同標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為樣 品；Transferrin(糖蛋白），BSA(非糖蛋白），IgG(糖蛋白），0VA(糖蛋白），a1-acid glycoprotein(糖蛋白），a-casein(非糖蛋白），目-casein(非糖蛋白），avidin(糖蛋 白），在圖中用斜體字表示糖蛋白。帶1，100化g;帶2,50化g;帶3,25化g;帶4,125ng;帶 5,64ng;帶 6, 32ng;帶 7,16ng;帶 8,8ng;帶 9,4ng;帶 10, 2ng。
[0025]圖3.在一向SDS-PAGE膠上，丹醜脫糖蛋白英光染色法與其它染色方法檢測(cè)實(shí)際 樣品效果的比較。（A)丹醜脫糖蛋白英光染色法，炬)Pro-QEmerald糖蛋白英光染色法，（C) SYPR0Ruby全蛋白英光染色法。Pro-Q血erald糖蛋白英光染色法和SYPR0Ruby全蛋白英光 染色法均按照文獻(xiàn)記載操作；采用提取的人血清總蛋白為樣品。帶l，5000ng;帶2,2500ng; 帶 3,1250ng;帶 4,625ng;帶 5,31化g;帶 6,160ng;帶 7,80ng;帶 8,40ng;帶 9,20ng;帶 10， lOng。
[0026] 圖4.在二向SDS-PAGE膠上，丹醜脫糖蛋白英光染色法與其它染色方法檢測(cè)實(shí)際 樣品效果的比較。（A)丹醜脫糖蛋白英光染色法，炬)Pro-QEmerald糖蛋白英光染色法，（C) SYPR0Ruby全蛋白英光染色法。分離樣品為大鼠肝臟總蛋白；IPG膠條長(zhǎng)13cm，P冊(cè)-10;分 離膠的濃度為11.4% ;樣品上樣量為25yg/膠條。
[0027] 圖5.在一向SDS-PAGE膠上，丹醜脫糖蛋白英光染色法與其它染色方法針對(duì)糖蛋 白染色特異性的考察。（A)丹醜脫糖蛋白英光染色法，炬)Pro-QEmerald糖蛋白英光染色 法，（C)SYPRORuby全蛋白英光染色法。用PNGaseF去除標(biāo)準(zhǔn)蛋白a1-acidglycoprotein 及人血清總蛋白中N-鏈糖。帶1，人血清總蛋白；帶2,去N-鏈糖后人血清總蛋白；帶3， a1-acidglycoprotein;帶 4,去N-鏈糖后a1-acidglycoprotein;帶 5,PNGaseF酶。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，該些實(shí)施例僅用于說明 本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0029] 實(shí)施例1丹醜脫糖蛋白特異性英光染色
[0030] 圖1是丹醜脫的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
[0031] 丹醜脫糖蛋白英光染色法采用如下述步驟進(jìn)行：
[0032] 1)將經(jīng)SDS-PAGE電泳后的蛋白質(zhì)樣品凝膠置于40%己醇和10%己酸水溶液中固 定30min，棄固定液；
[0033] 2)在高楓酸溶液里氧化20min，其中高楓酸溶液為含重量體積比0. 5%的高楓酸 及按體積比3%的己酸水溶液。然后用按體積比3%的己酸水溶液沖洗3次，每次5min;
[0034] 3)加入染色液染色30min，其中染色液為含重量體積比0. 006%的丹醜脫及按體 積比