堅桿火絨草或其炮制品中綠原酸等三種成分的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及堅桿火絨草或其炮制品中綠原酸等三種成分的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 堅桿火絨草，別名莪藥、山毛香，為菊科火絨草屬植物堅桿火絨草Leontopodium franchetii Beauv.的干燥全草，是藏醫(yī)火灸治療中的重要原材料，其藏藥名"扎托巴"[1]， 也叫"扎瓦" [2]。據(jù)藏醫(yī)學(xué)傳統(tǒng)書籍《晶珠本草》記載："扎瓦，治瘟病時疫，解礦石合毒，治 肉瘤" [3]?！端牟酷t(yī)典》明確闡述："但凡'培根'與'龍'型的寒性病、脈病、'黃水'病等，臨 床皆可通過煮、燒、烤、熏等方式用灸草的藥性和熱能刺激穴位以治之"[4]。藏藥草灸療法以 其療效顯著、成本低廉、操作簡便等優(yōu)勢，從古沿用至今。堅桿火絨草作為藏醫(yī)臨床施灸的 原材料，以每年的7-8月正值其花開旺盛之時，擇吉日采集全草，曬干，揉成圓錐狀以備用， 此時灸草的葉和花朵生長茂盛，無籽且葉不宜斷殘，是采集灸草的最佳時節(jié)[5]。
[0003] 發(fā)明人在研宄中發(fā)現(xiàn)，堅桿火絨草中含有總黃酮和總酚酸類成分，現(xiàn)代研宄表明， 酚酸和黃酮類化合物是許多中草藥的有效成分，某些酚酸類具有清除自由基、抗菌、抗炎、 抗氧化和調(diào)節(jié)心血管疾病的作用[6<，某些黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗炎、 降血脂、降血壓、鎮(zhèn)痛、保肝護肝、調(diào)節(jié)免疫、保護心腦血管系統(tǒng)等藥理作用[941];同時，通過 對堅桿火絨草不同采收期、不同植物部位總黃酮和總酚酸含量的測定比較，發(fā)現(xiàn)花期采摘 的藥材中總黃酮和總酚酸含量明顯高于果期，確定了其花期為最佳采收期，這一結(jié)論與藏 醫(yī)的"在秋季花開旺盛時擇吉日采集全草"臨床實踐經(jīng)驗相一致。上述發(fā)現(xiàn)表明，總黃酮和 總酚酸含量可以作為堅桿火絨草最佳采收期和藥材品質(zhì)的評價指標。
[0004] 目前還未見對堅桿火絨草中具體化學(xué)成分的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明人進一步對堅桿火絨草中的黃酮和酚酸類成分進行比對，首次在堅桿火絨草 中發(fā)現(xiàn)了綠原酸、咖啡酸、木犀草素這三種化學(xué)成分，其中，綠原酸具有抗菌、抗病毒、抗氧 化、抗腫瘤、保護心血管等功效，咖啡酸也具備抗菌抗病毒等功效，木犀草素具有多種藥理 活性，如消炎、抗過敏、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等，前兩者為典型的酚酸類成分代表，而后者則 為重要的天然黃酮類成分。因此，在發(fā)現(xiàn)堅桿火絨草具有上述三種成分的基礎(chǔ)上，研宄其中 各成分的檢測方法，可以對該類藥材的質(zhì)量監(jiān)測或控制提供可能。
[0006] 本發(fā)明目的在于提供一種堅桿火絨草或其炮制品中綠原酸等三種成分UPLC檢測 方法。本發(fā)明的另一目的在于提供堅桿火絨草或其炮制品的質(zhì)量控制方法，不限于對上述 三種成分的檢測。
[0007] 超高效液相色譜（Ultra Performance Liquid Chromatography\UPLC)(又名超高 壓液相色譜、超高速液相色譜）是分離科學(xué)中的一個全新類別，UPLC借助于HPLC(高效液 相色法）的理論及原理，涵蓋了小顆粒填料、非常低系統(tǒng)體積及快速檢測手段等全新技術(shù)， 增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量。本發(fā)明正是采用UPLC進行檢測的。
[0008] 具體地，本發(fā)明提供了堅桿火絨草或其炮制品中綠原酸、咖啡酸、木犀草素中的一 種或多種成分的UPLC檢測方法，它包括如下操作步驟：
[0009] (1)取待檢樣品，加40~60% v/v甲醇提取，收集提取液，制備供試品溶液； [0010] (2)取綠原酸、咖啡酸、木犀草素中的一種或兩種以上的混合物，制備對照品溶 液；
[0011] (3)將供試品溶液、對照品溶液分別注入超高效液相色譜儀中，采用外標法檢測即 可；其中，色譜條件如下：
[0012] 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料
[0013] 檢測波長和流動相條件如下：
[0014]
[0015] 本發(fā)明一個【具體實施方式】中，使用了 50% v/v甲醇作為提取溶劑，考慮在提取溶 劑配制過程中存在的誤差，本發(fā)明亦可選擇使用45~55% v/v甲醇。
[0016] 進一步地，步驟（1)中，甲醇提取的方式為冷浸后超聲提取。
[0017] 更進一步地，步驟（1)中，冷浸時間為8~12h以上（如浸泡過夜），超聲提取時間 為30~40min，超聲提取時間優(yōu)選為30min。
[0018] 進一步地，步驟（2)中，對照品溶液的溶劑選自甲醇或甲醇水溶液。
[0019] 其中，步驟（3)中，所述色譜柱填料的粒徑為1.7~3.5 μπι，為L 7~1.8 μπι，更 優(yōu)選為1. 7 μ m。
[0020] 其中，所述色譜柱尺寸為：2. lX50mm;優(yōu)選地，所述色譜柱的型號為：ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱。
[0021] 其中，所述流動相流速為0. 2mL. miiT1;色譜柱柱溫為35°C。
[0022] 其中，所述待檢樣品為菊科火絨草屬植物堅桿火絨草Leontopodium franchetii Beauv.的根、莖、葉、花、種子或全草。
[0023] 上述檢測方法，簡單、準確、分析時間短、穩(wěn)定性好，可以用于堅桿火絨草中上述三 種成分的檢測。
[0024] 本發(fā)明還提供了堅桿火絨草或其炮制品的質(zhì)量控制方法，它是采用UPLC法進行 檢測的，包括如下操作步驟：
[0025] (1)取待檢樣品，加 40~60% v/v甲醇提取，收集提取液，制備供試品溶液；
[0026] (2)將供試品溶液注入超高效液相色譜儀中，檢測即可；其中，色譜條件如下：
[0027] 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料
[0028] 檢測波長和流動相條件如下：
[0029]
[0030]
[0031] 本發(fā)明一個【具體實施方式】中，使用了 50% v/v甲醇作為提取溶劑，考慮在提取溶 劑配制過程中存在的誤差，本發(fā)明亦可選擇使用45~55% v/v甲醇。
[0032] 進一步地，步驟（1)中，甲醇提取的方式為冷浸后超聲提取。
[0033] 更進一步地，步驟（1)中，冷浸時間為8~12h以上（如浸泡過夜），超聲提取時間 為30~40min，超聲提取時間優(yōu)選為30min。
[0034] 進一步地，步驟（2)中，對照品溶液的溶劑選自甲醇或甲醇水溶液。
[0035] 其中，步驟（3)中，所述色譜柱填料的粒徑為1.7~3.5 μ m，為L 7~1.8 μ m，更 優(yōu)選為1. 7 μ m。
[0036] 其中，所述色譜柱尺寸為：2. lX50mm;優(yōu)選地，所述色譜柱的型號為：ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱。
[0037] 其中，所述流動相流速為0. 2mL. rnirf1;色譜柱柱溫為35°C。
[0038] 進一步地，該質(zhì)量控制方法中采用指紋圖譜技術(shù)進行檢測。
[0039] 從色譜圖可以看出，堅桿火絨草在上述色譜條件下得出的色譜圖中不僅僅含有本 發(fā)明發(fā)現(xiàn)的綠原酸、咖啡酸、木犀草素這三種成分，其他未知或未探明成分較多（見圖5)， 因此，研宄人員亦可采用上述色譜條件對堅桿火絨草的其他成分進行檢測，或者，亦可對 上述色譜條件得出的色譜圖進行指紋圖譜研宄比對，均可實現(xiàn)對堅桿火絨草質(zhì)量的綜合研 宄。
【附圖說明】
[0040] 圖1堅桿火絨草中總黃酮含量測定（mg. 〇
[0041] 圖2~圖2續(xù)b不同流動相條件下的色譜圖；其中，A乙腈-水，B甲醇-水，C甲 醇-0.05%磷酸水，D甲醇-0.10%磷酸水，E甲醇-0.20%磷酸水，F(xiàn)甲醇-0.35%磷酸水， G甲醇-0.50%磷酸水
[0042] 圖3~圖3續(xù)不同柱溫條件下的色譜圖；其中，A 25°C，B 30°C，C 35°C，D 40°C， E 45 °C
[0043] 圖4不同流速條件下的色譜圖；其中，A 0· ImL. mirf1、B 0· 2mL. mirf1、C 0· 3mL. mirf1
[0044] 圖5混合對照品（A)和樣品（B)UPLC圖（I.綠原酸2.咖啡酸3.木犀草素）
【具體實施方式】
[0045] 實施例1本發(fā)明UPLC檢測方法的實驗前研宄--堅桿火絨草總黃酮的含量的測 定
[0046] 1材料與方法
[0047] I. 1 材料
[0048] 試驗用堅桿火絨草樣本分別在2013年7月2和9月24日采收于西南民族大學(xué)青 藏高原研宄基地紅原草地，并經(jīng)于西南民族大學(xué)民族醫(yī)藥研宄院劉圓教授鑒定。樣品用超 純水洗凈曬干，在60°C電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干后，粉碎，過四號篩，得堅桿火絨草粉末。
[0049] I. 1. 2主要試劑
[0050] 無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為國產(chǎn)分析純；蘆丁對照品，購自成 都曼思特生物科技有限公司（批號MUST-12040302,含量彡98% )，試驗用水為實驗室自制 超純水。
[0051] 1.1. 3主要儀器
[0052] DHG-9246A型電熱恒