一種檢測豬傳染性胃腸炎病毒抗體的elisa試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測豬傳染性胃腸炎病毒抗體的ELISA 試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬傳染性胃腸炎（transmissible gastroenteritis, TGE)是由冠狀病毒科、冠狀 病毒屬的豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus, TGEV)引起的一 種急性、高度接觸性傳染病，以嘔吐、嚴重水樣腹瀉、脫水和對2周齡以內(nèi)仔豬高度致死率 為特征。TGE是一種世界范圍內(nèi)流行的疾病，國際獸疫局（OIE)將其列為B類疾病中必檢的 豬傳染病，因此，TGE診斷技術(shù)的研宄具有重要的意義。
[0003] 目前對于TGEV的診斷主要是依靠RT-PCR方法，該方法對實驗設備和條件要求較 高，不適合臨床上的大規(guī)模快速診斷。應用各種免疫血清學技術(shù)對疫病做出準確、迅速的 診斷是預防和控制該病的重要措施之一。ELISA法具有簡便、快速、特異性強等優(yōu)點，而且 ELISA檢測抗體能夠評價疫苗的免疫效果，但需要抗原純度較高且免疫原性良好。TGEV N 蛋白分子質(zhì)量為35~48kDa、磷酸化的核衣殼蛋白，N蛋白是病毒粒子內(nèi)部的一種蛋白質(zhì)， 主要構(gòu)成病毒的核蛋白，它包繞基因組RNA，呈螺旋式結(jié)構(gòu)，直徑9~16nm，使其易摻入病毒 中，體外復制時，N蛋白制備的抗血清能抑制90%的基因RNA的合成。N蛋白含有蛋白水解 位點，通過蛋白水解作用和去磷酸化作用，對病毒粒子的裝配起重要作用。N基因可誘導機 體產(chǎn)生細胞免疫，而由于核蛋白的高度保守性，對核蛋白作為診斷抗原的研宄也受到人們 的廣泛重視。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測TGEV抗體的ELISA試劑盒及其應用。該試劑盒成 本低廉、操作簡便，為TGEV的檢測提供了一種快捷易用的血清學診斷方法，市場前景良好。
[0005] 本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0006] -種檢測豬傳染性胃腸炎病毒抗體的ELISA試劑盒，包括以下組分：
[0007] DELISA板條：以豬傳染性胃腸炎病毒重組N蛋白作為包被抗原，ELISA板條經(jīng) 5% (M/V)脫脂乳封閉，以包裝袋密封包裝于4°C保存；
[0008] 2)洗滌液：含0. 05 %吐溫-20的pH7. 4磷酸鹽緩沖液（PBS-T);
[0009] 3)血清稀釋液：5% (M/V)脫脂乳；
[0010] 4)底物顯色液：已加入H2O2的TMB溶液；
[0011] 5)羊抗豬酶標二抗：已用血清稀釋液稀釋至工作濃度1:10000的羊抗豬酶標二 抗；
[0012] 6)終止液：2M H2SO4溶液；
[0013] 7) TGEV 陽性血清；
[0014] 8) TGEV 陰性血清。
[0015] 本發(fā)明所述的豬傳染性胃腸炎病毒重組N蛋白通過以下步驟制備：
[0016] 1)以豬傳染性胃腸炎病毒TGEV的RNA作為材料，通過RT-PCR方法擴增獲得其N 基因，基因登錄號JX827607. 1，擴增片段大小為816bp，并以pET-28a質(zhì)粒作為載體構(gòu)建重 組質(zhì)粒pET-28a-N，N基因與pET-28a載體分別用BamH I與Sal I雙酶切后，連接構(gòu)建重組 質(zhì)粒pET-28a-N，雙酶切鑒定重組質(zhì)粒；
[0017] 2)將陽性重組表達質(zhì)粒pET-28a-N轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)感受態(tài)細胞，獲得陽性質(zhì)粒菌 單克隆pET-28a-N/BL21 ;該單克隆于37°C培養(yǎng)，待A600值達到0. 4~0. 6時，加入IPTG至 終濃度為〇. 8mmol/L進行誘導表達，收集誘導表達后6h的菌體，進行SDS-PAGE鑒定，取誘 導表達后6h的菌體，超聲破碎，離心后分別取上清與沉淀進行SDS-PAGE電泳鑒定，根據(jù)電 泳結(jié)果，取上清表達液進行Western blot鑒定，大量誘導表達N蛋白，超聲破碎，取上清表 達液，使用Ni-TED柱進行純化，收集IxElution Buffer洗脫所得純化蛋白。
[0018] 本發(fā)明所述的ELISA試劑盒具體操作步驟如下：
[0019] 1)加入血清樣品：
[0020] 用血清稀釋液5 % (M/V)脫脂乳將待檢血清做1:80稀釋后，每孔加入100 μ L，每 一血清樣品添加兩孔，同時設立TGEV陰、陽性血清作為對照，各添加兩孔；室溫下作用30分 鐘，棄去反應孔中的液體：每個孔用200 μ L洗滌液充分清洗5次，每次5分鐘，每次洗滌后 將反應孔中的液體除去，最后一次除去洗滌液后，充分除去殘留的液體；
[0021] 2)加入羊抗豬酶標二抗：
[0022] 每孔加入100 μ L羊抗豬酶標二抗，室溫作用30分鐘，按步驟（1)中方法洗滌；
[0023] 3)加入底物顯色液：
[0024] 每孔加入100 μ L已加入H2O2的TMB溶液，室溫下避光作用10分鐘；
[0025] 4)終止反應：
[0026] 每孔加入100 μ L 2Μ H2SO4終止液，終止顯色反應；
[0027] 5)用酶標儀測定OD值：
[0028] 使用酶標儀在450nm波長下測定各孔吸光光度（OD)值；
[0029] 6)結(jié)果判定：
[0030] 間接ELISA檢測時加入陽性血清、陰性血清，用酶標儀在450nm波長下測定OD值。 試驗成立的條件是：陽性對照孔0D450值均應該3 I. 0且〈3. 0,陰性對照孔0D450值均應 該蘭0. 2。計算各份血清0D450與陽性對照孔0D450的比值KQ，當樣品KQ值彡26. 768時 為陽性，< 26. 768時為陰性。
[0031] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明ELISA試劑盒，使用豬傳染性胃腸炎病病毒（TGEV) 重組N蛋白作為包被抗原，該蛋白為TGEV N基因重組pET-28a-N表達載體的原核表達產(chǎn)物， 易于制備與純化，免疫反應性良好，該蛋白純化后作為包被抗原，其濃度易于確定與控制， 有利于該試劑盒的大量生產(chǎn)與成本控制；本發(fā)明試劑盒用于檢測豬傳染性胃腸炎病毒的抗 體，經(jīng)檢驗，該試劑盒特異性、敏感性、重復性均良好。該試劑盒檢測準確、操作簡便，適合 于在臨床應用中進行推廣，為豬傳染性胃腸炎病的快速檢測提供了可靠手段。
【附圖說明】
[0032] 圖1是pET-28a-N/BL21表達菌陽性單克隆鑒定；M :DS 15000Marker ;1 :陽性 pET-28a-N/BL21 菌單克??；2 :陰性 pET-28a-N/BL21 菌單克??；
[0033] 圖 2 是 TGEV N 蛋白的誘導表達；M :Prestained Peotein Ruler ;1 :誘導后 pET-28a-N/BL21菌液樣品；2 :未誘導的pET-28a-N/BL21菌液樣品；
[0034] 圖 3 是 N 蛋白可溶性表達鑒定；M :BlueRay Prestained Peotein ladder ;1 :超聲 破碎后上清液樣品；2 :超聲破碎后包涵體樣品；
[0035] 圖 4 是 Western Blot 鑒定；M :BlueRay Prestained Peotein ladder ; 1 :誘導后 pET-28a-N/BL21 菌液樣品；
[0036] 圖 5是N蛋白的純化；M :BlueRay Prestained Peotein ladder ; 1 :第 ImL洗脫液； 2 :第2mL洗脫液；3 :第3mL洗脫液。
【具體實施方式】
[0037] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的說明，以下所述，僅是對本發(fā)明的較佳實施 例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示 的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實質(zhì)對以下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0038] 實施例1試劑盒的制備
[0039] I. TGEV N蛋白表達載體的構(gòu)建
[0040] 提取豬傳染性胃腸炎病毒感染病豬（江蘇省洪澤鑫象豬場）腸道病料RNA，擴增 獲得其N基因（登錄號JX827607. 1)。N基因連接pMD19-T載體（TaKaRa)，16°C連接過夜。 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans5a感受態(tài)細胞（TaKaRa)，并涂布至氨節(jié)青霉素抗性（100mg/ml)的LB 平板，37°C培養(yǎng)過夜。挑取單克隆，于氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)IOh后，提取 質(zhì)粒，酶切鑒定。將初步鑒定為陽性的菌液進行測序。選取測序正確的PMD18-T-N質(zhì)粒，與 pET-28a空質(zhì)粒（Novagen)，分別使用BamH I與Sal I雙酶切。酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠 電泳，分別切取N基因目的條帶與pET-28a載體條帶，切膠回收?；厥债a(chǎn)物16°C連接過夜。 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans5a感受態(tài)細胞，常規(guī)化選取陽性克隆，提取菌體質(zhì)粒酶切鑒定，如圖1 所示，獲得pET-28a-N重組質(zhì)粒。
[0041] 2.重組表達質(zhì)粒的誘導表達
[0042] 重組pET-28a-N質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)感受態(tài)細胞（TaKaRa)，常規(guī)化選取陽性克 隆，提取菌體質(zhì)粒酶切鑒定，命名為pET-28a-N/BL21。pET-28a-N/BL21表達菌活化培養(yǎng)，至 A600 = 0. 6,取Iml菌液保存，加入0. 1 % IPTG進