森林腦炎抗體的檢測試紙、試紙制備方法及其檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種森林腦炎抗體檢測試紙，由樣品墊、Fe3O4磁性納米顆粒載體墊、硝酸纖維素膜、吸水墊依次搭接并貼在底襯卡組成，所述Fe3O4磁性納米顆粒載體墊為固定有金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)標(biāo)記磁性納米顆粒的玻璃纖維膜；所述硝酸纖維素膜設(shè)有檢測帶和質(zhì)控帶，所述檢測帶包被有與森林腦炎抗原；所述質(zhì)控帶包被能與SPA結(jié)合的抗體。由上述檢測試紙和過氧化物酶底物顯色液構(gòu)成用于檢測森林腦炎病毒抗體的檢測試劑盒。該試劑盒能有效檢測森林腦炎病毒抗體，檢測結(jié)果穩(wěn)定、可靠、特異性強(qiáng)、靈敏度高，比一般膠體金檢測試紙靈敏度高10-100倍，操作簡單，不需要檢測儀器，通過肉眼即可得到檢測結(jié)果。
【專利說明】森林腦炎抗體的檢測試紙、試紙制備方法及其檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測試劑領(lǐng)域，特別涉及一種森林腦炎抗體的檢測試紙、試紙的 制備方法及其檢測試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前針對森林腦炎病毒抗體的檢測技術(shù)主要是ELISA、化學(xué)發(fā)光等免疫學(xué)方法，其 中，ELISA檢測方法需要反復(fù)清洗、拍板，并要求風(fēng)光光度儀器進(jìn)行吸光度的檢測；化學(xué)發(fā) 光法中需要的熒光試劑比較昂貴，檢測需要特定的熒光分析儀器；這些方法需要昂貴的儀 器，操作繁瑣，并且整個檢測過程耗時長，還要求檢測人員具有一定的專業(yè)素質(zhì)。
[0003]ELISA、化學(xué)發(fā)光等免疫學(xué)檢測方法最關(guān)鍵的一個因素是抗原抗體的選擇，如果直 接采用森林腦炎病毒培養(yǎng)液制備抗原，存在抗原成分復(fù)雜、有效抗原的含量低、雜蛋白多、 免疫原性差以及生物安全風(fēng)險性高等問題，而且用于免疫學(xué)檢測時，容易導(dǎo)致陽性結(jié)果。
[0004] 另外，膠體金檢測方法適合現(xiàn)場檢測，但檢測靈敏度受到限制，主要是由于膠體金 連接了待標(biāo)記抗體或待標(biāo)記蛋白之后，很不穩(wěn)定，很容易因電荷的變化使得抗體脫離，造成 每個膠體金的標(biāo)記抗體量大大減少，從而造成靈敏度的降低。并且，膠體金試劑的制備采用 氯金酸，試劑成本比較高，導(dǎo)致免疫層析試紙的總體成本比較高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種快速檢測森林腦炎抗體的檢 測試紙、試紙的制備方法及其檢測試劑盒。該檢測試劑盒不需要專業(yè)技術(shù)人員即可完成檢 測工作，也不需要專門的檢測儀器即可判斷檢測結(jié)果，并且該檢測試劑盒具有較高的靈敏 度。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0007] -種森林腦炎抗體檢測試紙，由樣品墊、Fe304磁性納米顆粒載體墊、硝酸纖維素 膜、吸水墊依次搭接并貼在底襯卡組成，所述Fe304磁性納米顆粒載體墊為固定有金黃色葡 萄球菌A蛋白（SPA)標(biāo)記磁性納米顆粒的玻璃纖維膜；所述硝酸纖維素膜設(shè)有檢測帶和質(zhì) 控帶，所述檢測帶包被有與森林腦炎抗原；所述質(zhì)控帶包被能與SPA結(jié)合的抗體。
[0008] 如上所述的檢測試紙，優(yōu)選地，所述Fe304磁性納米顆粒的粒徑為5nm?500nm。
[0009] 如上所述的檢測試紙,優(yōu)選地，所述森林腦炎抗原的基因序列如SEQIDN0. 1所示。
[0010] 如上所述森林腦炎抗體檢測試紙的制備方法,優(yōu)選地，該方法包括：
[0011](1)、利用森林腦炎抗原的基因序列如SEQIDNO. 1所示，制備森林腦炎抗原；
[0012] (2)、SPA標(biāo)記羧基化處理的Fe304磁性納米顆粒，噴涂于玻璃纖維膜上，制備Fe304 磁性納米顆粒載體墊；
[0013] (3)、包被硝酸纖維素膜，將步驟（1)獲得的森林腦炎病毒重組蛋白抗原和羊抗兔 IgG分別包被于硝酸纖維素膜上作為檢測帶和質(zhì)控帶；
[0014] (4)、處理樣品墊；
[0015] (5)、試紙條的組裝：將步驟（4)處理后的樣品墊、步驟（2)SPA標(biāo)記的Fe304磁性納 米顆粒載體墊、步驟（3)包被后的硝酸纖維素膜、吸水墊依次貼在底襯卡上，獲得森林腦炎 抗體檢測試紙。
[0016] 如上所述森林腦炎抗體檢測試紙的制備方法，優(yōu)選地，所述步驟（4)處理樣品墊 步驟為：將含有體積比0.5%?2%的吐溫20、pH= 7. 2?7.6的PBS，噴涂于樣品墊上，烘 干或自然干燥后待用。
[0017] 如上所述森林腦炎抗體檢測試紙的制備方法，優(yōu)選地，所述步驟（5)中吸水墊為 吸水紙或純棉絨漿濾紙。
[0018] 一種森林腦炎病毒抗體檢測試劑盒，該試劑盒包括,如上所述的檢測試紙和辣根 過氧化物酶底物。
[0019] 如上所述的檢測試劑盒，優(yōu)選地，所述辣根過氧化物酶底物為鄰苯二胺（0PD)體 系、四甲基聯(lián)苯胺（TMB)體系、3. 3 -二氨基聯(lián)苯胺（DAB)體系或2, 2'-邊氮基-雙3-乙基 苯并噻吡咯啉-6磺酸（ABTS)體系中的任一種。
[0020] 上述的辣根過氧化物酶底物的體系當(dāng)中均含有過氧化氫。
[0021] 如上所述的檢測試劑盒，優(yōu)選地，所述四甲基聯(lián)苯胺體系包括：四甲基聯(lián)苯胺和過 氧化氫，所述四甲基聯(lián)苯胺的質(zhì)量濃度為〇. 〇lmg/ml?10mg/ml，所述過氧化氫的摩爾濃度 為 0? 25mmol/L?L2mmol/L〇
[0022] 如上所述的檢測試劑盒，優(yōu)選地，所述四甲基聯(lián)苯胺體系配制方法如下：a)先將 四甲基聯(lián)苯胺溶于二甲基亞砜，再將加入蒸餾水定容，獲得A液；
[0023]b)先配制質(zhì)量濃度為0. 5%?30%的過氧化氫尿素溶液，之后稱取檸檬酸、磷酸 氫二納，加入過所述氧化氫尿素溶液，用蒸餾水定容，所述檸檬酸的終濃度為〇.lmol/L、所 述磷酸氫二納的終濃度為〇. 2mol/L，所述過氧化氫尿素的摩爾濃度為0. 5mmol/L?2. 4m mol/L，獲得B液；
[0024]c)將上述A液與B液等體積混合獲得TMB應(yīng)用液備用。
[0025] 本發(fā)明提供一種森林腦炎病毒抗體的檢測試紙，首先制備獲得一種森林腦炎病毒 的重組抗原蛋白；其次將四氧化三鐵磁性納米顆粒經(jīng)羧基化修飾后，再進(jìn)行SPA的標(biāo)記， 標(biāo)記后形成免疫磁珠，該免疫磁珠比較穩(wěn)定，能有效結(jié)合待檢的目標(biāo)物，不會導(dǎo)致假陰性結(jié) 果，從而避免出現(xiàn)漏檢；利用制備的重組抗原蛋白和SPA標(biāo)記的四氧化三鐵磁性納米顆粒 制備森林腦炎病毒抗體免疫層析檢測試紙。
[0026] 利用制備的森林腦炎病毒抗體免疫層析檢測試紙，進(jìn)行樣品的檢測，判斷結(jié)果時， 最后加入TMB應(yīng)用液，增強(qiáng)結(jié)果的顯色功能。主要是利用Fe304磁性納米顆粒具有辣根過氧 化物酶的催化特性，加入辣根過氧化物酶的底物顯色反應(yīng)后，判斷檢測結(jié)果，底物通過四氧 化三鐵的催化作用，使檢測條帶的顏色加深，極大地放大反應(yīng)效果，靈敏度大大提高，可比 膠體金檢測靈敏度高10-100倍的數(shù)量級，且不需要檢測儀器進(jìn)行結(jié)果的判定。
[0027] 采用TMB作為顯色底物時，只需要添加本發(fā)明配置的一種TMB應(yīng)用液就可實(shí)現(xiàn)顯 色反應(yīng)，比常規(guī)應(yīng)用TMB溶液顯色需要分別添加A液、B液使用方便，節(jié)省時間，且不需要用 現(xiàn)用現(xiàn)配。
[0028] 本發(fā)明制備的森林腦炎病毒抗體檢測試劑盒，試劑成本低，檢測試劑溶液穩(wěn)定、特 異性強(qiáng)、靈敏度高、比膠體金檢測結(jié)果靈敏度高10-100倍，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，操作簡單， 不需要較強(qiáng)的專業(yè)技術(shù)就可以操作，通過肉眼觀察來判斷檢測結(jié)果，并不需要儀器進(jìn)行判 斷，使用方便。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1是本發(fā)明重組質(zhì)粒的陽性克隆的電泳結(jié)果圖。
[0030] 圖2是本發(fā)明森林腦炎病毒重組蛋白表達(dá)SDS-PAGE電泳圖。
[0031] 圖3是本發(fā)明森林腦炎病毒抗體的檢測試劑盒的檢測結(jié)果。
[0032] 圖4是膠體金免疫層析試紙檢測結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0033]目前在生物技術(shù)檢測方面，有利用四氧化三鐵納米顆粒進(jìn)行檢測的應(yīng)用，主要是 利用其具有磁響應(yīng)性的功能，對待檢目的物進(jìn)行富集分離的，可有效提高檢測率。四氧化 三鐵納米顆粒還具有辣根過氧化物酶催化底物變色的特性，但是利用這個特性進(jìn)行ELISA 檢測鮮有報道，主要原因可能是一方面考慮到由于四氧化三鐵納米顆粒的量子化尺寸效應(yīng) 等，使它對某種波長的光吸收帶有藍(lán)移現(xiàn)象，并對各種波長光的吸收有寬化現(xiàn)象，認(rèn)為對 ELISA檢測需要測量吸光度值不是很準(zhǔn)確；另一方面，由于四氧化三鐵本身具有的顏色，會 對后續(xù)測定吸光度值有影響，所以認(rèn)為利用四氧化三鐵納米顆粒具有辣根過氧化物酶的特 性進(jìn)行免疫學(xué)方法的檢測，尤其是ELISA檢測，結(jié)果不是很準(zhǔn)確、可靠，有一定的技術(shù)偏見。 [0034]本發(fā)明利用四氧化三鐵具有辣根過氧化物酶催化的特性，即能催化鄰苯二胺體 系即含有過氧化氫和鄰苯二胺（0PD)、四甲基聯(lián)苯胺體系即含有過氧化氫和四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)的溶液、3. 3 -二氨基聯(lián)苯胺即含有過氧化氫和3. 3 -二氨基聯(lián)苯胺（DAB)的溶液， 或2. 2' -邊氮基-雙3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸（ABTS)即含有過氧化氫和2. 2' -邊氮 基-雙3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸（ABTS)的溶液顯色的特點(diǎn)，首次將四氧化三鐵納米顆 粒利用到免疫層析試紙上進(jìn)行抗原抗體的檢測，利用四氧化三鐵可使辣根過氧化物酶底物 顯色的特性，極大地增強(qiáng)檢測信號，使本發(fā)明的制備的免疫層析試紙檢測靈敏度大大提高， 也使四氧化三鐵具有辣根過氧化物酶催化的特性，能用于免疫學(xué)方法檢測成為可能。
[0035]本發(fā)明利用四氧化三鐵磁性納米顆粒制備檢測試紙還有效解決了，采用膠體金材 料制備試紙時，膠體金包被不穩(wěn)定性，使靈敏度降低的問題。主要是，本發(fā)明制備檢測試紙 時，對四氧化三鐵顆粒進(jìn)行了羧基化處理，有利于包被反應(yīng)，且與包被物形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)， 并且包被后不會影響包被物的免疫學(xué)特性。
[0036]本發(fā)明采用磁性納米顆粒包被SPA制備檢測試紙時，對所用的磁性納米顆粒粒徑 的選擇做了研究，研究結(jié)果表明磁性納米顆粒粒徑優(yōu)選在5nm?500nm范圍內(nèi)，粒徑小于 5nm，顆粒太小，抗原或抗體很難包被，粒徑大于500nm時，磁性納米顆粒容易聚集，導(dǎo)致沉 淀從而不適宜用于制備檢測試紙。
[0037] 另外，通過對樣品墊的處理方式進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)采用本發(fā)明的處理方法，可有效 地避免非特異性反應(yīng)，降低假陽性的檢出率。
[0038]本發(fā)明還對辣根過氧化物酶顯色的底物做了進(jìn)一步的研究，研究表明，含有雙氧 水的鄰苯二胺（0PD)、四甲基聯(lián)苯胺（TMB)、3. 3 -二氨基聯(lián)苯胺（DAB)或2. 2' -邊氮基-雙 3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸（ABTS)等溶液均可使四氧化三鐵納米顆粒制備的檢測試紙顯 色加強(qiáng)。
[0039] 本發(fā)明對TMB應(yīng)用液中TMB的含量和H202的含量，進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，研究表明 TMB含量在0? 01mg/ml?10mg/ml，過氧化氫的摩爾濃度為0? 25mmol/L?1. 2mmol/L，四 氧化三鐵納米顆粒制備的檢測試紙顯色效果較佳。
[0040] 常規(guī)ELISA采用的底物為TMB顯色液，反應(yīng)時，首先需要加入含有TMB的A液，再加 入含有H202的B液，進(jìn)行反應(yīng)，一般A液與B液是分開存放或是現(xiàn)用現(xiàn)配，因TMB溶液與單 獨(dú)的H202溶液混合一起后，存放一段時間容易產(chǎn)生渾濁或沉淀，長期存放會影響檢測結(jié)果， 一般采用H202溶液時最好現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0041] 本發(fā)明對TMB應(yīng)用液的配制方法進(jìn)一步進(jìn)行改進(jìn)，研究發(fā)現(xiàn)采用過氧化氫水溶液 和過氧化氫尿素的效果相同，但采用采用過氧化氫尿素配制的溶液比采用H202配制的溶液 更加穩(wěn)定，過氧化氫尿素的水溶液具有尿素和H202性質(zhì)。
[0042] 本發(fā)明配制的TMB應(yīng)用液可直接使用，但需要4°C避光存放。優(yōu)選地，配制的方法 如下：
[0043] 1.底物液A:TMB200mg，溶于二甲基亞砜100ml，加雙蒸水至1000ml。
[0044] 2.底物B:先配制重量濃度為1%過氧化氫尿素待用，稱取Na2HP0414. 21g，檸檬酸 9. 607g，加入1 %過氧化氫尿素2. 4ml，加雙蒸水至500ml。
[0045] 3.將底物液A和底物B按1:1混合即成TMB應(yīng)用液。
[0046] 這種方法簡單、方便、節(jié)約試劑，同時過氧化氫尿素較過氧化氫穩(wěn)定，更能夠確保 試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。
[0047] 本發(fā)明中所指的蒸餾水可以是一次蒸餾水，也可以是二次蒸餾水、三次蒸餾水或 超純水。
[0048] 下面對本發(fā)明的技術(shù)方案作詳細(xì)的說明。以下具體優(yōu)選地實(shí)施例中所用的所用試 劑如無特別說明均為常規(guī)試劑，所述百分比如無特別說明均為重量百分比含量。
[0049]實(shí)施例1森林腦炎抗原的制備
[0050] 制備森林腦炎抗原具體步驟如下：
[0051]a、重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0052] 對森林腦炎抗原的選擇，本發(fā)明發(fā)明人進(jìn)行多次試驗(yàn)，最終確定選擇森林腦炎 (TBE)外膜蛋白，其核苷酸序列（GenBank序列號：HM133639. 1)，依據(jù)大腸桿菌Escherichia coli0127:H6偏愛密碼子對基因序列進(jìn)行改造，并通過生物信息學(xué)對重組蛋白二級結(jié)構(gòu)篩 選，（篩選方案見實(shí)質(zhì)審查參考資料，在此不做贅述），并經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，最終確定的基因 序列如SEQIDNO. 1所示。
[0053] 按照SEQIDNO. 1所示的序列委托上海英俊公司合成，連接入表達(dá)載體 PGEX-4T-2,獲得連接產(chǎn)物即重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化于DH5a感受態(tài)細(xì)胞；用PCR和雙酶切鑒定重組 質(zhì)粒，篩選陽性克隆送上海英俊公司測序，將測序正確的重組質(zhì)粒命名為PGEX-4T-2-TBE， 陽性克隆的電泳結(jié)果見圖1，圖1中，從左至右四條條帶的上樣樣品依次為：誘導(dǎo)菌液上清、 誘導(dǎo)4h菌沉淀、誘導(dǎo)6h菌沉淀、分子量標(biāo)準(zhǔn)M。
[0054]b、重組蛋白的表達(dá)及鑒定
[0055] 將測序正確的重組質(zhì)粒PGEX-4T-2-TBE轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，將鑒定正確的單菌落 接種到含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)過夜，次日按1:100接種于新的含 氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至0D600達(dá)0. 5-0. 8后，冷卻菌液溫度至22°C，力口 入終濃度為〇. 8mM的IPTG，在22°C進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；并分別于1、2、3、4、5、6小時時吸取lmL 菌液，超聲裂解，收集菌液，l〇〇°C煮沸l(wèi)Omin，4°C、12000r/min離心3min，冰上放置，吸取上 清進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測；電泳結(jié)束后，膠用考馬斯亮蘭染色80min，再脫色2h后觀察蛋 白誘導(dǎo)表達(dá)情況；從誘導(dǎo)后lh起就有分子量約為28KD的目的蛋白表達(dá)，6h時產(chǎn)量最高。結(jié) 果如圖2所示，其中，條帶1-3上樣的樣品分別為誘導(dǎo)菌液上清、4小時誘導(dǎo)、6小時誘導(dǎo)測 得的結(jié)果，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。
[0056] C、重組蛋白的提取純化
[0057] 吸取2ml誘導(dǎo)表達(dá)6小時的菌液做SDS-PAGE，初步確定蛋白是否表達(dá)，及其表達(dá) 量，4°C，12000r/min離心30分鐘，收集細(xì)胞沉淀，用0.01MpH7.4的PBS洗滌三次，加入 PH8. 0裂解液（Tris-Nacl)懸浮，超聲，離心后分別取10yl上清和沉淀做SDS-PAGE，電泳 后用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行凝膠染色，脫色液進(jìn)行脫色后檢查特異性目的蛋白條帶。結(jié)果 表明重組蛋白以包涵體的形式表達(dá)，收集超聲離心后的細(xì)胞沉淀（主要含有一些細(xì)胞碎片 和包涵體），加入pH8. 0濃度為8M的尿素懸浮，置于冰上搖2小時溶解包涵體，12000r/min， 離心30分鐘，上清液經(jīng)0. 22ym的濾膜過濾后用HisTrapTMHP(組氨酸）親和吸附柱純 化系統(tǒng)進(jìn)行純化，SDS-PAGE鑒定純度，最后將純化的蛋白透析到0. 01M，pH7. 4的PBS中， PEG-20000濃縮，得到分子量約28KD的純化重組蛋白；取2mg純化的重組蛋白制備多抗，采 用常規(guī)方法進(jìn)行免疫大白兔，獲得陽性兔血清。
[0058] 實(shí)施例2制備森林腦炎病毒抗體的檢測試紙條
[0059]A、SPA標(biāo)記磁性納米顆粒，并制備磁性納米顆粒載體墊：
[0060]取100ill四氧化三鐵磁性納米顆粒溶液（四氧化三鐵顆粒粒徑優(yōu)選為12nm)，力口 700ill水，200ill25%的戊二醛溶液，搖晃3h;lml水洗1-2次，在PBS洗2次，即將四氧化 三鐵磁性納米顆粒進(jìn)行羧基化處理；加入500iil，2mg/ml的SPA，搖晃3h，pH值7. 6 ;加入 500iil，0. 5%BSA，搖晃30分鐘，進(jìn)行封閉；加入含0. 01 %吐溫-20濃度為0. 01M的PBS，， 洗3-4次；加入lmL重懸液，其中重懸液中含有重量百分比為0. 1%的Tris堿、1%的BSA和 5%的蔗糖，混勻，噴涂于玻璃纖維膜上，37 °C干燥4h;
[0061]B、包被硝酸纖維素膜：將實(shí)施例1制備的森林腦炎病毒重組蛋白抗原和羊抗兔 IgG用PBS溶液分別稀釋至lmg/mL和0. 8mg/mL，用噴膜機(jī)將稀釋后的森林腦炎重組抗原和 羊抗兔IgG包被于硝酸纖維素膜上作為檢測帶和質(zhì)控帶，置于37°C干燥過夜；
[0062]C、樣品墊處理：1% (v/v)吐溫20的PBS，pH= 7. 4,噴涂于玻璃纖維膜上；
[0063]D、試紙條的組裝：，將玻璃纖維素膜制成的樣品墊、SPA標(biāo)記的磁性納米顆粒結(jié)合 墊、包被后的硝酸纖維素膜、吸水紙制成的吸水墊依次貼在底襯卡上，切成寬度為〇. 4cm的 條，裝殼；
[0064]E、試紙條的驗(yàn)證：將陰性兔血清取80yL滴加在樣品墊上僅質(zhì)控帶出現(xiàn)棕黃色； 并且在2分鐘后取上述配制的50yLTMB應(yīng)用液滴加在樣品墊上，僅質(zhì)控帶的顏色加深， lOmin后判斷結(jié)果，結(jié)果表明，僅質(zhì)控帶顯色；將森林腦炎抗原免疫的陽性兔血清取80yL 滴加在樣品墊上，質(zhì)控帶和檢測帶均出現(xiàn)棕黃色；并且在2分鐘后取50yLTMB應(yīng)用液滴加 在樣品墊上，質(zhì)控帶和陽性檢測條帶30s內(nèi)加深，lOmin后判斷結(jié)果，質(zhì)控帶和檢測帶均出 現(xiàn)棕黃色條帶，試紙條合格，可進(jìn)行森林腦炎抗體的檢測。
[0065] 在進(jìn)行森林腦炎病毒抗體的檢測時，取80iiL血清樣品滴加在樣品墊上，并且在2 分鐘后取50yLTMB應(yīng)用液滴加在樣品墊上，lOmin后判斷結(jié)果。若僅質(zhì)控帶出現(xiàn)棕黃色， 結(jié)果為陰性，說明待檢血清樣品中不含有森林腦炎病毒抗體；若質(zhì)控帶和檢測帶均出現(xiàn)棕 黃色，結(jié)果為陽性，說明待血清檢樣品中含有森林腦炎病毒抗體；若兩條帶都沒有顯色或者 只有檢測帶顯色，則說明此試紙條已經(jīng)失效，結(jié)果無效。
[0066] 實(shí)施例3本發(fā)明制備的森林腦炎抗體的檢測試紙和膠體金免疫層析試紙的靈敏 度檢測
[0067] 其中，本發(fā)明制備的森林腦炎抗體的檢測試紙的制備方法見實(shí)施例2;
[0068] 膠體金免疫層析試紙的制備方法：
[0069] 采用常規(guī)方法制備膠體金免疫層析試紙，其中采用SPA標(biāo)記膠體金顆粒，硝酸纖 維素膜上的檢測帶包被有森林腦炎病毒重組抗原，質(zhì)控帶包被羊抗兔IgG。
[0070] 采用實(shí)施例2制備的試紙條分別檢測森林腦炎抗體血清，用胎牛血清稀釋為 1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000,同時將胎牛血清作為陰性對照，取 80i!L血清樣品加樣孔內(nèi)，并且在2分鐘后取50i!LTMB應(yīng)用液滴加在樣品墊上，lOmin判斷 結(jié)果，比較納米磁珠免疫層析試紙及對比例1制備的膠體金免疫層析試紙條的靈敏性。
[0071] 試驗(yàn)結(jié)果表明，作為陰性對照的胎牛血清均為陰性，制備的納米磁珠免疫層析試 紙可檢測出稀釋至1:100000的森林腦炎抗體，而膠體金免疫層析試紙僅可檢測出稀釋至 1:10000的森林腦炎抗體，靈敏度相差10倍。納米磁珠免疫層析試紙檢測結(jié)果如圖3所示， 圖4為膠體金免疫層析試紙檢測結(jié)果，其中圖中：C為質(zhì)控帶；T為檢測帶；1-6分別為森林 腦炎陽性血清稀釋濃度：1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000 ;7 為陰性對 照。
[0072] 實(shí)施例4森林腦炎抗體檢測試紙的特異性檢測
[0073] 采用實(shí)施例2制備的森林腦炎抗體檢測試紙進(jìn)行森林腦炎抗體的檢測時，取 80iiL血清樣品滴加在檢測試紙的樣品墊上，并且在2分鐘后取50iiLTMB應(yīng)用液滴加在樣 品墊上，lOmin判斷結(jié)果。若僅質(zhì)控帶出現(xiàn)棕黃色，結(jié)果為陰性，說明待檢血清樣品中不含有 森林腦炎抗體；若質(zhì)控帶和檢測帶均出現(xiàn)棕黃色，結(jié)果為陽性，說明待血清檢樣品中含有森 林腦炎抗體；若兩條帶都沒有顯色或者只有檢測帶顯色，則說明此試紙條已經(jīng)失效，結(jié)果無 效。
[0074] 通過對森林腦炎病毒重組蛋白陽性血清、土拉熱抗體陽性血清、禽流感病毒抗體 陽性血清、西尼羅病毒抗體陽性血清的檢測，檢測結(jié)果表明只有森林腦炎陽性血清為陽性 結(jié)果，其余樣品為陰性結(jié)果，說明本發(fā)明的森林腦炎抗體檢測試紙的特異性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確可 〇
[0075] 實(shí)施例5本發(fā)明檢測試紙的應(yīng)用
[0076] 應(yīng)用實(shí)施例2中制備的試紙條檢測吉林省林區(qū)采集的鼠血清樣本25份，取80iiL 鼠血清樣品加樣孔內(nèi)，并且在2分鐘后取50yLTMB應(yīng)用液滴加在樣品墊上，lOmin后判斷 結(jié)果，均為陰性，和ELISA檢測結(jié)果一致，其中，ELISA檢測所用試劑盒為購自德國IBL公司 的TBEV/FSMEIgGELISA試劑盒。
[0077] 在以上實(shí)施列中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。
[0078]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對本發(fā)明做其它形式的限制，任 何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等 效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所 作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種森林腦炎抗體檢測試紙，由樣品墊、Fe304磁性納米顆粒載體墊、硝酸纖維素膜、 吸水墊依次搭接并貼在底襯卡組成，所述Fe304磁性納米顆粒載體墊為固定有金黃色葡萄 球菌A蛋白（SPA)標(biāo)記磁性納米顆粒的玻璃纖維膜；所述硝酸纖維素膜設(shè)有檢測帶和質(zhì)控 帶，所述檢測帶包被有與森林腦炎抗原；所述質(zhì)控帶包被能與SPA結(jié)合的抗體。
2. 如權(quán)利要求1所述的檢測試紙，其特征在于，所述Fe304磁性納米顆粒的粒徑為 5nm ?500nm〇
3. 如權(quán)利要求1所述的檢測試紙，其特征在于，所述森林腦炎抗原的基因序列如SEQ ID NO. 1 所示。
4. 一種森林腦炎抗體檢測試紙的制備方法，其特征在于，該方法包括： (1) 、利用森林腦炎抗原的基因序列如SEQ ID NO. 1所示制備森林腦炎抗原； (2) 、SPA標(biāo)記羧基化處理的Fe304磁性納米顆粒，噴涂于玻璃纖維膜上，制備Fe30 4磁性 納米顆粒載體墊； (3) 、包被硝酸纖維素膜，將步驟（1)獲得的森林腦炎病毒重組蛋白抗原和羊抗兔IgG 分別包被于硝酸纖維素膜上作為檢測帶和質(zhì)控帶； (4) 、處理樣品墊； (5) 、試紙條的組裝：將步驟（4)處理后的樣品墊、步驟（2)SPA標(biāo)記的Fe304磁性納米顆 粒載體墊、步驟（3)包被后的硝酸纖維素膜、吸水墊依次貼在底襯卡上，獲得森林腦炎抗體 檢測試紙。
5. 如權(quán)利要求4所述森林腦炎抗體檢測試紙的制備方法，其特征在于，所述步驟（4)處 理樣品墊步驟為：將含有體積比0. 5%?2%的吐溫20、pH = 7. 2?7. 6的PBS，噴涂于樣 品墊上，烘干或自然干燥后待用。
6. 如權(quán)利要求4所述森林腦炎抗體檢測試紙的制備方法，其特征在于，所述步驟（5)中 吸水墊為吸水紙或純棉絨漿濾紙。
7. -種森林腦炎病毒抗體檢測試劑盒,該試劑盒包括，如權(quán)利要求1-3中任一所述的 檢測試紙和辣根過氧化物酶底物。
8. 如權(quán)利要求3所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述辣根過氧化物酶底物為鄰苯二 胺（0PD)體系、四甲基聯(lián)苯胺（TMB)體系、3. 3 -二氨基聯(lián)苯胺（DAB)體系或2. 2'-邊氮 基-雙3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸（ABTS)體系中的任一種。
9. 如權(quán)利要求8所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述四甲基聯(lián)苯胺體系包括：四甲基 聯(lián)苯胺和過氧化氫，所述四甲基聯(lián)苯胺的質(zhì)量濃度為〇. 〇lmg/ml?10mg/ml，所述過氧化氫 的摩爾濃度為〇? 25m mol/L?1. 2mmol/L。
10. 如權(quán)利要求9所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述四甲基聯(lián)苯胺體系配制方法如 下：a)先將四甲基聯(lián)苯胺溶于二甲基亞砜，再將加入蒸餾水定容，獲得A液； b) 先配制質(zhì)量濃度為0. 5%?30%的過氧化氫尿素溶液，之后稱取檸檬酸、磷酸氫二 納，加入過所述氧化氫尿素溶液，用蒸餾水定容，所述檸檬酸的終濃度為0. lmol/L、所述磷 酸氫二納的終濃度為〇. 2mol/L，所述過氧化氫尿素的摩爾濃度為0. 5m mol/L?2. 4m mol/ L，獲得B液； c) 將上述A液與B液等體積混合獲得TMB應(yīng)用液備用。
【文檔編號】G01N33/558GK104330556SQ201410570748
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月22日
【發(fā)明者】楊宇, 韓輝, 曾婷婷, 趙婷婷, 王靜, 徐寶梁 申請人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院