血漿作為肝癌診斷標記物的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于評估肝癌疾病的新生物標記物，所述生物標記物對肝癌中病理學 改變較敏感，特別是在疾病或損傷早期階段。此外，本發(fā)明涉及用于評估人患肝癌的風險。
【背景技術】
[0002] 代謝組學（1116丨3130110111；[08/1116丨313010111；[08)是繼基因組學、轉錄組學、蛋白質(zhì)組學之 后提出的一門新的學科，是系統(tǒng)生物學中的一個重要組成部分。生物機體在受到外界病源 或環(huán)境改變的刺激時，會產(chǎn)生多層次、多器官和多組織的應答反應，這些應答反應最終將影 響到終端代謝水平的變化正是研究這種機體在受到內(nèi)因、外因的刺激時，機體內(nèi)的終端小 分子代謝物(通常指分子量小于1000 Da)的變化規(guī)律的科學，從整體上動態(tài)地闡述生理或病 理狀態(tài)下機體對外界刺激的應答和動態(tài)系統(tǒng)性的變化過程，為全面理解多因素影響下的癌 癥的發(fā)生機制研究將提供一個新的視角。同時，從整體上考察人體的生理狀態(tài)，能得到更多 的疾病相關信息，有利于癌癥的早期診斷。另外，代謝組學技術分析的樣本主要是尿液和血 液，其采集過程對人體無傷害或是有極小的傷害，因此代謝組學的方法將有利于癌癥的大 規(guī)模篩查。
[0003] 癌癥是一大類惡性腫瘤的統(tǒng)稱。癌細胞的特點是無限制、無止境地增生，使患者體 內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗；癌細胞釋放出多種毒素，使人體產(chǎn)生一系列癥狀；癌細胞還可 轉移到全身各處生長繁殖，導致人體消瘦、無力、貧血、食欲不振、發(fā)熱以及嚴重的臟器功能 受損等等，繼而破壞組織、器官的結構和功能，引起壞死出血合并感染，患者最終由于器官 功能衰竭而死亡。
[0004] 據(jù)統(tǒng)計，全世界每年新發(fā)肝癌患者約六十萬，居惡性腫瘤的第五位。原發(fā)性肝癌按 細胞分型可分為肝細胞型肝癌、膽管細胞型肝癌及混合型肝癌。按腫瘤的形態(tài)可分為結節(jié) 型、巨塊型和彌漫型。原發(fā)性肝癌在我國屬于高發(fā)病，一般男性多于女性。中國是乙肝大 國，我國的肝癌多在乙肝肝硬化的基礎上發(fā)展而來，丙肝病人也在逐漸增加，乙肝后也會發(fā) 展為肝癌。目前我國發(fā)病人數(shù)約占全球的半數(shù)以上，占全球肝癌病人的55%，已經(jīng)成為嚴重 威脅我國人民健康和生命的一大殺手。因其惡性度高、病情進展快，病人早期一般沒有什么 不適，一旦出現(xiàn)癥狀就診，往往已屬中晚期。故治療難度大、療效差，發(fā)病后生存時間短。在 我國，每年有11萬人死于肝癌，其中男性8萬，女性3萬，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%。作 為最常見的一種惡性腫瘤，肝癌死亡率僅居高，全國每年至少有12萬人被肝癌奪去生命。
[0005] 肝癌起病隱匿，超過60%的肝癌患者在初次就診時已經(jīng)進入中晚期，從而失去根 治性治療的機會，總體5年生存率只有7%左右。目前，臨床上常用的肝癌診斷標記物為甲 胎蛋白，簡稱AFP。然而，甲胎蛋白診斷肝癌的敏感度和特異度并不十分理想，在妊娠婦女、 急慢性肝炎、生殖腺腫瘤和胃腸道腫瘤等人群中也可能升高。而且，臨床上有40%的肝癌患 者甲胎蛋白并不升高，呈現(xiàn)陰性。因此，尋找特異性和敏感性均高的診斷肝癌、特別是早期 肝癌的分子標記物，成為臨床研究的重點和難點。
[0006] 目前臨床上以大分子癌癥標記物的單一或聯(lián)合使用作為癌癥診斷手段的研究較 多，而對于小分子類癌癥標記物缺乏系統(tǒng)深入的研究?，F(xiàn)代研究表明，內(nèi)源性小分子物質(zhì)多 胺類化合物與癌癥的發(fā)生密切相關。國內(nèi)外研究均表明癌癥患者體內(nèi)多胺水平高于正常人 群及非腫瘤患者體內(nèi)多胺水平。多胺在生物體內(nèi)多是水溶性的，通常在體液pH環(huán)境下完全 質(zhì)子化，以多陽離子形式存在，常與RNA，DNA等多陰離子復合體結合在一起，并處于動態(tài)平 衡之中。多胺能直接參與生物體內(nèi)的多種生理活動，如核酸的復制、轉錄、翻譯，蛋白質(zhì)的 合成和膜結構的穩(wěn)定等，它是生物體生長和細胞代謝所必須的內(nèi)源性微量活性物質(zhì)。一般 在RNA，DNA及蛋白質(zhì)合成增高之前，多胺含量急劇上升，如在癌癥組織中多胺水平明顯升 高，而多胺的過度積累還會導致細胞的凋亡及轉變，使癌癥進一步惡化。多胺包括1，3-丙 二胺、腐胺、尸胺、精脒、精胺、酰化精脒、?；返?。多胺包括1，3-丙二胺、腐胺、尸胺、精 脒、精胺、?；摺Ⅴ；返?。目前研究未能證實何種多胺為癌癥的生物標記物，也未能 找到肝癌的特異性標記物，這大大影響了多胺作為肝癌輔助診斷、預后和療效評價指標等 方面的應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供肝癌的特異性多胺生物標記物，該標記物為人血漿中的腐胺 和精脒，具體為腐胺和精脒濃度的乘積。
[0008] 本發(fā)明采用UHPLC-MS/MS法分別檢測健康人和肝癌病人血漿樣本中1，3-丙二 胺（DAP)，腐胺（PUT)，尸胺（CAD)，精脒（SPD)，精胺（SPM)，胍丁胺（AGM)，鳥氨酸（0RN)， 賴氨酸（LYS)，精氨酸（ARG)，S-腺苷蛋氨酸（SAM)，酰化腐胺（NPUT)，酰化精胺（NSPM)， 酰化精脒（NSPD)與Y-氨基丁酸（GABA)等14種與多胺合成與分解代謝密切相關物 質(zhì)的濃度° (詳見 Determination of polyamine metabolome in plasma and urine by ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method:Application to identify potential markers for human hepatic cancer. Anal Chim Acta. 2013; 791:36-45)對于得到的檢測數(shù)據(jù)，首先對所測得的血漿中多胺類物質(zhì)的 數(shù)據(jù)進行異常值檢測，去掉由于樣本收集或者測定誤差等導致的異常樣本。進而分別對肝 癌和健康人賦值為1和2作為因變量，以14種待測物為自變量進行二元邏輯回歸分析，所 得到的變量腐胺和精脒濃度的乘積可以作為區(qū)分肝癌與健康人的依據(jù)。最后以此變量為指 標采用聚類分析的方法進行驗證。結果表明以腐胺和精脒濃度的乘積為指標可以將肝癌患 者與健康人區(qū)分開來。
[0009] 本發(fā)明的目的還包括提供應用血漿中腐胺和精脒濃度的乘積進行肝癌評估的方 法，其步驟包括：
[0010] (1)分別收集肝癌患