一種類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷標(biāo)志的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷標(biāo)志。
【背景技術(shù)】
[0002]類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一種常見的自身免疫疾病,主要表現(xiàn)是反復(fù)發(fā)作的關(guān)節(jié)滑膜炎，從而導(dǎo)致股關(guān)節(jié)破壞，晚期以致關(guān)節(jié)畸形、僵直。該病全世界范圍內(nèi)的發(fā)病幾率是0.5%?5.3%，中國(guó)為1%?2%，其中女性發(fā)病率為男性的2倍。雖然RA主要病癥集中在關(guān)節(jié)處，但是研究發(fā)現(xiàn)，這種疾病也會(huì)伴有很多其他的系統(tǒng)并發(fā)癥。研究還發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與遺傳、環(huán)境以及感染等因素密切相關(guān)，但是其具體的發(fā)病機(jī)制尚不明確。因此，尋找對(duì)于診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎早期診斷標(biāo)志物，對(duì)疾病的預(yù)后和治療策略的制定都有非常重要的意義。
[0003]從1912年發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕性因子(RF)至今，RF 一直作為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷的一個(gè)重要指標(biāo)。據(jù)報(bào)道，RF因子在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人中的陽(yáng)性率達(dá)到70%，因此，RF可以作為診斷RA的一個(gè)重要的指標(biāo)?，F(xiàn)在人們還發(fā)現(xiàn)，在RA患者血清中IgGO (糖鏈末端缺失半乳糖的免疫球蛋白)水平升高，而IgGO先于RA癥狀的出現(xiàn)，并且與發(fā)病機(jī)理和復(fù)發(fā)有著密切的關(guān)系，這對(duì)于RA的早期診斷有著非常重要的意義。這提示我們，對(duì)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的早期診斷標(biāo)志物的探索還有著廣闊的空間。
[0004]β -半乳糖苷酶是一種能把乳糖水解成葡萄糖和半乳糖的酶，廣泛存在于動(dòng)植物界。目前，半乳糖苷酶有著較為廣泛的應(yīng)用:在食品方面，半乳糖苷酶幫助乳糖解決不耐受患者的乳品消費(fèi)問(wèn)題、提高乳品甜度、防止乳制品冷凍結(jié)晶等發(fā)揮著重要的作用；在免疫和檢測(cè)方面，β_半乳糖苷酶作為一種輔助蛋白，制備融合蛋白；此外β_半乳糖苷酶在基因工程中還可以用于作為報(bào)告基因，構(gòu)建載體、轉(zhuǎn)基因研究等多種生物學(xué)領(lǐng)域。但是，尚未有報(bào)道表明β-半乳糖苷酶可以作為某種疾病的生物診斷標(biāo)志物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提出血清中β半乳糖苷酶表達(dá)水平可作為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的診斷標(biāo)志，并具體提出一種特異性檢測(cè)血清中β半乳糖苷酶表達(dá)水平的試劑在制備診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷工具中的應(yīng)用；所述應(yīng)用中，血清β半乳糖苷酶的水平與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生密切相關(guān)，表現(xiàn)為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的血清β半乳糖苷酶水平明顯高于正常個(gè)體，因此，可用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的早期診斷和/或預(yù)后評(píng)估，進(jìn)而用于指導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療。
[0006]具體地，一方面，本發(fā)明提供了一種特異性檢測(cè)血清中β半乳糖苷酶表達(dá)水平的試劑在制備用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷和/或預(yù)后評(píng)估的診斷工具中的應(yīng)用。
[0007]上述應(yīng)用中，作為優(yōu)選，所述β半乳糖苷酶表達(dá)水平為β半乳糖苷酶的mRNA水平和/或蛋白質(zhì)水平。
[0008]進(jìn)一步優(yōu)選地，通過(guò)定量或半定量PCR法檢測(cè)β半乳糖苷酶的mRNA水平。
[0009]作為優(yōu)選，所述特異性檢測(cè)β半乳糖苷酶表達(dá)水平的試劑包括特異性擴(kuò)增β半乳糖苷酶基因或轉(zhuǎn)錄本的引物對(duì)和/或特異性識(shí)別β半乳糖苷酶基因或轉(zhuǎn)錄本的探針。
[0010]進(jìn)一步優(yōu)選地，通過(guò)免疫測(cè)定法檢測(cè)β半乳糖苷酶的蛋白質(zhì)水平；更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述免疫測(cè)定法為酶免疫測(cè)定法、免疫比濁測(cè)定法、乳膠免疫凝集法、電化學(xué)發(fā)光法或熒光法；最優(yōu)選地，所述免疫測(cè)定法為酶免疫測(cè)定法。
[0011]優(yōu)選地，所述特異性檢測(cè)β半乳糖苷酶表達(dá)水平的試劑包括特異性識(shí)別β半乳糖苷酶的抗體或配體。
[0012]所述抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)知識(shí)制備，也可以采用已經(jīng)商業(yè)化的抗體。多克隆抗體的生產(chǎn)可以采用半乳糖苷酶蛋白免疫動(dòng)物，包括小鼠、家兔、大鼠等，配合多種佐劑增強(qiáng)免疫反應(yīng)，得以生產(chǎn)。
[0013]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述抗體為單克隆抗體或抗原結(jié)合片段；更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述抗體為鼠抗人單克隆抗體。
[0014]優(yōu)選地，所述診斷工具為診斷試劑、試劑盒、基因芯片、蛋白芯片或免疫檢測(cè)試紙。
[0015]上述應(yīng)用中，優(yōu)選地，通過(guò)檢測(cè)待測(cè)個(gè)體的血清β半乳糖苷酶的mRNA或蛋白質(zhì)水平，將其與相同檢測(cè)條件下的正常個(gè)體的血清β半乳糖苷酶的mRNA或蛋白質(zhì)水平相比的增高，診斷為患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
[0016]優(yōu)選地，將待測(cè)個(gè)體的血清β半乳糖苷酶的mRNA或蛋白質(zhì)水平比相同檢測(cè)條件下的正常個(gè)體的血清β半乳糖苷酶的mRNA或蛋白質(zhì)水平增高至少I倍以上，診斷為患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
[0017]另一方面，本發(fā)明還提供了一種類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷工具，包括特異性檢測(cè)血清中β半乳糖苷酶表達(dá)水平的試劑；
[0018]優(yōu)選地，所述β半乳糖苷酶表達(dá)水平為β半乳糖苷酶的mRNA水平或蛋白質(zhì)水平;
[0019]優(yōu)選地，所述特異性檢測(cè)血清中β半乳糖苷酶表達(dá)水平的試劑包括特異性擴(kuò)增β半乳糖苷酶基因或轉(zhuǎn)錄本的引物對(duì)和/或特異性識(shí)別β半乳糖苷酶基因或轉(zhuǎn)錄本的探針；
[0020]優(yōu)選地，所述特異性檢測(cè)血清中β半乳糖苷酶表達(dá)水平的試劑包括特異性識(shí)別β半乳糖苷酶的抗體或配體。
[0021]上述診斷工具還包括其他的反應(yīng)試劑,如PCR反應(yīng)試劑,免疫結(jié)合試劑,或者酶聯(lián)免疫反應(yīng)試劑等，以及用于提取DNA、雜交、以及顯色等所需的試劑，包括但是不限于:提取液、擴(kuò)增液、雜交液、標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品、顯色液以及洗滌液等等。
[0022]優(yōu)選地，所述診斷工具為診斷試劑、試劑盒、基因芯片、蛋白芯片或免疫檢測(cè)試紙。
[0023]本發(fā)明發(fā)明人使用realtime-PCR等方法和ELISA等方法分別檢測(cè)了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人及正常人血清中β -半乳糖苷酶的mRNA水平和蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人中其表達(dá)水平要明顯高于正常人(即在mRNA水平或者蛋白表達(dá)水平上高于正常對(duì)照至少I倍以上，且具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，并且兩者方法取得了較好的一致性。
[0024]通過(guò)動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)，也證明了 β -半乳糖苷酶對(duì)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中都發(fā)揮了重要的作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)高劑量的注射β_半乳糖苷酶，能夠明顯提高類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎因子的產(chǎn)生，這些結(jié)果顯示，β -半乳糖苷酶在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中所扮演的重要的角色，它也因此可以作為診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一種新的預(yù)后標(biāo)志物以及新的治療靶標(biāo)。
[0025]本發(fā)明發(fā)明人基于上述發(fā)現(xiàn)，提出了血清中β半乳糖苷酶的水平可作為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷標(biāo)志，用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的早期診斷和/或預(yù)后評(píng)估，進(jìn)而用于指導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療。
【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1是實(shí)施例1中的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎