專利名稱：性病的集成診斷芯片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種性病的集成診斷芯片以及這種芯片的制備方法。
性病是一種發(fā)病率較高，對(duì)人類健康危害極大的傳染性疾病，常見的如淋病、梅毒、尖銳濕疣、軟下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器皰疹、性病性淋巴肉芽腫、愛滋病等，更有部分癌癥也是由性傳播疾病引起。引起性病的病原微生物常見的包括淋球菌、梅毒螺旋體、單純皰疹病毒、乳頭瘤病毒、一些真菌、支原體、衣原體等類型，病原種類多，難以診斷和判定，故對(duì)它們的快速、有效的診斷對(duì)性病的監(jiān)控、預(yù)防和治療極為重要。為此，各國投入了大量的經(jīng)費(fèi)和人力進(jìn)行這方面的研究，并且發(fā)展了一些診斷性病病原的物理、化學(xué)方法，物理方法一般是經(jīng)過取樣，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)后鏡檢，程序復(fù)雜。常見的化學(xué)方法有ELISA測(cè)抗原或抗體，PCR測(cè)抗原基因等。但傳統(tǒng)的免疫學(xué)方法都是首先將純化的抗原或抗體與酶或其它標(biāo)記物結(jié)合，再加相應(yīng)的底物通過顯色或特殊的儀器來測(cè)定其相應(yīng)的抗原或抗體，這些方法化學(xué)計(jì)量關(guān)系較復(fù)雜，染料著色的程度和部位很難控制，操作煩瑣，導(dǎo)致假陽性假陰性較多，成本也較高PCR方法由于符合率差等原因已被國家暫時(shí)取消。而且，所有這些方法都還有一大缺陷，就是效率低，一次只能測(cè)一種病原或幾次才能鑒定出一種病原。而現(xiàn)實(shí)的情況是病人往往感染了幾種病原，多種性病病原都能感染人體。傳統(tǒng)的方法針對(duì)有限的幾種病原進(jìn)行檢測(cè)，末免帶有盲目性。為此，急需發(fā)展一種標(biāo)準(zhǔn)化的程序和方法能夠一次性地診斷出受染微生物的種類和受染程度，便于正確、快速地采取治療措施。
基因(或DNA)芯片技術(shù)的出現(xiàn)，使這道難題迎刃而解?；蛐酒夹g(shù)是一項(xiàng)可與計(jì)算機(jī)芯片技術(shù)媲美、具有劃時(shí)代意義的革命性技術(shù)?；蛐酒瑢?shí)質(zhì)上是一種高密度的寡聚核苷酸(DNA探針)陣列，它采用在位組合化學(xué)、合成化學(xué)和微電子芯片的光刻技術(shù)，或者利用其它方法將大量特定序列的DNA探針有序地固定在玻璃或硅襯底上，它已能實(shí)現(xiàn)在1萬平方厘米見方玻璃上固定40余萬個(gè)寡聚核苷酸片段，每種探針的空間尺度可達(dá)10-20微米，在與待測(cè)樣品DNA作用后，DNA芯片即可檢測(cè)到大量相應(yīng)的生命信息，用于基因識(shí)別、鑒定，以及基因突變和基因表達(dá)等。到目前為止，DNA芯片技術(shù)的出現(xiàn)不過幾年時(shí)間，主要在兩個(gè)方面進(jìn)行了研究，一是用大量寡核苷酸探針來測(cè)定基因序列，使破解人類DNA編碼的速度達(dá)到常規(guī)方法的25倍；二是開發(fā)了檢測(cè)癌癥患者P53基因突變的芯片。
本發(fā)明的目的在于提供一種性病的集成診斷芯片以及這種芯片的制備方法，利用這種芯片可對(duì)淋病、梅毒、尖銳濕疣、軟下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器皰疹、性病性淋巴肉芽腫、愛滋病等傳染性性病原微生物進(jìn)行集成診斷，一次操作就可方便、快速、準(zhǔn)確地完成上述幾種性病的檢測(cè)以及各自的感染程度等。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的性病集成診斷芯片是在玻璃或硅片上固定有淋病、梅毒、尖銳濕疣、軟下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器皰疹、性病性淋巴肉芽腫、愛滋病等性病病原的具有診斷意義的特征基因(單鏈)，或者固定用于PCR擴(kuò)增這八種性病病原的引物。這八種性病原的分子生物學(xué)研究在國內(nèi)外已有大量的報(bào)導(dǎo)，具有診斷意義的特征基因的序列已公布，這些特征基因(或其引物)可直接購買，也可利用分子生物學(xué)的基因操作實(shí)驗(yàn)技術(shù)提取。
首先將病人血清、黏膜或尿樣中病原微生物的DNA提取出來作為模版，參照公布的基因序列設(shè)計(jì)引物，PCR或RT-PCR擴(kuò)增目的基因，然后克隆到質(zhì)粒載體上在大腸桿菌中擴(kuò)增，酶切、純化提取得到所需的特征基因。
玻璃或硅片先經(jīng)過表面設(shè)計(jì)規(guī)劃基因(探針、引物)分布，采用微電子光刻技術(shù)將表面刻制成所需的微坑陣列。
具體的技術(shù)方案如下一種性病集成診斷芯片，它是在玻璃或硅片上光刻有微坑陣列，這些陣列分為八個(gè)區(qū)域，依次在這些微坑中固定有淋病、梅毒、尖銳濕疣、軟下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器皰疹、性病性淋巴肉芽腫、愛滋病等性病病原的具診斷意義的特征基因，或者是用于擴(kuò)增它們的引物。
制備上述性病集成診斷芯片的方法先將玻璃或硅片采用微電子光刻成微坑陣列；用表面鍵合偶聯(lián)活化劑對(duì)其進(jìn)行活化處理，活化試劑為親水性硅烷化試劑等。處理?xiàng)l件為常溫，0.5～2.5小時(shí)。
依次將淋病、梅毒、尖銳濕疣、軟下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器皰疹、性病性淋巴肉芽腫、愛滋病等性病病原的具診斷意義的特征基因或其引物轉(zhuǎn)移到八個(gè)區(qū)域的微坑陣列中；用偶聯(lián)劑經(jīng)偶聯(lián)反應(yīng)將這些特征基因或其引物固定在芯片上；即得到本發(fā)明的性病集成診斷芯片。
基因或其引物固定時(shí)偶聯(lián)反應(yīng)條件為偶聯(lián)劑(0.5～1.5％)+2-[N-嗎啉]乙磺酸溶液，室溫下12～36小時(shí)。
所用的偶聯(lián)劑可為水溶性碳二亞胺、N-羥基瑚珀酰亞胺、或WOODWARD試劑等。
所得到的性病集成診斷芯片可采用電化學(xué)標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、熒光標(biāo)記等方法加以檢驗(yàn)，標(biāo)記試劑可為芐基紫晶、水溶性卟林、溴化乙啶、丫啶橙、熒光素。用電化學(xué)方法、激光誘導(dǎo)熒光/電荷耦合器件(CCD)配套診斷芯片的臨床檢測(cè)。
采用本發(fā)明的上述技術(shù)方案具有如下特點(diǎn)利用本發(fā)明的性病集成診斷芯片可通過一種材料、一次反應(yīng)就能完成上述八種性病的檢測(cè)診斷。而傳統(tǒng)方法檢測(cè)一種性病需要多次不同的反應(yīng)才能確定。
利用本發(fā)明的性病集成診斷芯片進(jìn)行性病診斷的準(zhǔn)確率、符合率可達(dá)到98％以上，既可做到定性檢測(cè)，也可做到定量檢測(cè)。
本發(fā)明的性病集成診斷芯片的制造成本低，診斷時(shí)每檢測(cè)的費(fèi)用不高于傳統(tǒng)方法的單項(xiàng)檢測(cè)的費(fèi)用。
近年來，性病在我國的流行已成為一個(gè)突出的社會(huì)問題，發(fā)病人數(shù)年年上升，發(fā)病地區(qū)也在不斷擴(kuò)大，對(duì)這類疾病的及時(shí)監(jiān)控、預(yù)防和診斷極其重要，因此本發(fā)明應(yīng)用前景廣闊，具有極大的社會(huì)效率和經(jīng)濟(jì)效率。
以下結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明實(shí)施例一種性病集成診斷芯片，它是在玻璃或硅片上光刻有微坑陣列，這些陣列分為八個(gè)區(qū)域，依次在這些微坑中固定有淋病、梅毒、尖銳濕疣、軟下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器皰疹、性病性淋巴肉芽腫、愛滋病等性病病原的具診斷意義的特征基因。
制備上述性病集成診斷芯片的方法先將玻璃或硅片采用微電子光刻成微坑陣列；用表面鍵合耦聯(lián)活化劑對(duì)其進(jìn)行活化處理，活化條件為用親水性硅烷化試劑常溫下處理2小時(shí)。依次將淋病、梅毒、尖銳濕疣、軟下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器皰疹、性病性淋巴肉芽腫、愛滋病等性病病原的具診斷意義的特征基因轉(zhuǎn)移到八個(gè)不同區(qū)域的微坑陣列中，用交聯(lián)劑經(jīng)耦聯(lián)反應(yīng)將這些特征基因或其引物固定在芯片上即得到本發(fā)明的性病集成診斷芯片。
所用的交聯(lián)劑為1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽。
偶聯(lián)反應(yīng)條件為1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(1％)+2-[N-嗎啉]乙磺酸溶液(pH6.5)，室溫下24小時(shí)。
權(quán)利要求
1.一種性病集成診斷芯片，其特征在于它是在玻璃或硅片上光刻有微坑陣列，這些點(diǎn)陣分為八個(gè)區(qū)域，依次在這些微坑中固定有淋病、梅毒、尖銳濕疣、軟下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器皰疹、性病性淋巴肉芽腫、愛滋病等性病病原的具診斷意義的特征基因或其引物。
2.一種制備權(quán)利要求1所述的性病集成診斷芯片的方法，其特征在于先將玻璃或硅片采用微電子光刻成微坑陣列；用表面鍵合偶聯(lián)活化劑對(duì)其進(jìn)行活化處理，活化條件為依次將淋病、梅毒、尖銳濕疣、軟下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器皰疹、性病性淋巴肉芽腫、愛滋病等性病病原的具診斷意義的特征基因或其引物轉(zhuǎn)移到八個(gè)區(qū)域的微坑陣列中，用偶聯(lián)劑經(jīng)偶聯(lián)反應(yīng)將這些特征基因或其引物固定在芯片上，即得到本發(fā)明的性病集成診斷芯片。
3.按權(quán)利要求2所述的性病集成診斷芯片的方法，其特征在于所述的偶聯(lián)反應(yīng)條件為0.5～1.5％偶聯(lián)劑+2-[N-嗎啉]乙磺酸溶液，室溫下12～36小時(shí)。
4.按權(quán)利要求2所述的性病集成診斷芯片的方法，其特征在于所述的偶聯(lián)劑為水溶性碳二亞胺、N-羥基瑚珀酰亞胺或WOODWARD試劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種性病的集成診斷芯片以及這種芯片的制備方法,它是在玻璃或硅片上光刻有微坑陣列,這些陣列分為八個(gè)區(qū)域,依次在這些微坑中固定有淋病、梅素、尖銳濕疣、軟下疳、非淋菌性尿道炎、生殖器皰疹、性病性淋巴肉芽腫、愛滋病等性病病原的具診斷意義的特征基因或其引物。這種芯片對(duì)性病的及時(shí)監(jiān)控、預(yù)防和診斷極其重要,診斷操作簡(jiǎn)單、快速,而且準(zhǔn)確率高,因此應(yīng)用前景廣闊,具有極大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效率。
文檔編號(hào)G01N33/48GK1271098SQ9911644
公開日2000年10月25日 申請(qǐng)日期1999年4月20日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月20日
發(fā)明者王業(yè)富, 龐代文 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)