專利名稱：抗原特異性IgM的檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于測定體液中M類免疫球蛋白的抗原-特異性抗體的方法，該方法通過與至少兩種不同的受體R1和R2一起培養(yǎng)所述的樣品，其中的兩種受體都能特異性地結(jié)合到抗體上，R1被結(jié)合或者可以被結(jié)合到固相上、而R2攜帶一個(gè)標(biāo)記，其中R1的基本組成為被待測定的抗體特異性識別的呈多聚體形式的結(jié)合配偶體、而R2也可以選擇地為所述的結(jié)合配偶體，并且使用呈單體形式的特異性相同的結(jié)合配偶體來減少IgG抗體的干擾。
具體地說，本發(fā)明涉及一種在有IgG類免疫球蛋白和干擾因子(諸如類風(fēng)濕因子)存在下，特異性地檢測IgM類免疫球蛋白的方法。
為了對外源物質(zhì)的引入產(chǎn)生響應(yīng)，哺乳動(dòng)物生物體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了亦被稱為免疫球蛋白的抗體。它們防御亦被稱作抗原的外源物質(zhì)。可以把免疫球蛋白劃分為五個(gè)不同的種類。人們在M，G，A，E和D類的免疫球蛋白之間進(jìn)行劃分。這五類免疫球蛋白的每一種都在重鏈的組成上有所不同，被稱作μ、γ、α、ε和δ鏈。
每一類免疫球蛋白在生物體中都具有不同的功能。在與抗原的第一次接觸、即所謂的初次免疫接種之后，出現(xiàn)了M類免疫球蛋白。但是，隨著感染的進(jìn)行，這些免疫球蛋白的濃度迅速降低。G類免疫球蛋白在初次免疫接種之后首先緩慢地形成，并且當(dāng)用同一抗原進(jìn)行第二次感染時(shí)大量地出現(xiàn)。A類免疫球蛋白是在生物體的粘膜表面上發(fā)現(xiàn)的，并且它決定著該處的防御過程。E類免疫球蛋白主要導(dǎo)致過敏反應(yīng)。D類免疫球蛋白的確切功能迄今仍是未知的。
在血液中，各個(gè)種類的免疫球蛋白存在的濃度差別非常大。因此，G類免疫球蛋白(IgG)是正常人血清中的主要種類，其份額約為75％，這對應(yīng)于8至18mg/ml的血清含量。第二種最頻繁出現(xiàn)的免疫球蛋白為IgA，它的平均血清濃度為0.9至4.5mg/ml。M類免疫球蛋白存在的濃度為0.6至2.8mg/ml，D類免疫球蛋白存在的濃度為0.003至0.4mg/ml。IgE抗體的比例是最低的，它在血清中僅以0.02至0.05μg/ml的濃度存在。
為了有區(qū)別地診斷許多的疾病，重要的是檢測對具體的抗原具有特異性的一類或幾類非常具體的免疫球蛋白的抗體。僅僅可以通過種類-特異性抗體測試或者通過排除某些種類的免疫球蛋白的存在(例如，檢測IgG和IgA抗體、而不檢測IgM抗體)來保證對病毒、細(xì)菌和寄生蟲感染的令人滿意的診斷。這對于區(qū)分新近的或者急性的感染和更早些時(shí)候已經(jīng)發(fā)生的感染以及對于臨床監(jiān)測感染的過程來說是特別重要的?？贵w的種類-特異性檢測對HIV、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、弓形體病病毒、風(fēng)疹病毒和衣原體的感染來說尤其重要。當(dāng)測定保護(hù)抗體的滴度以及檢查免疫接種是否成功的時(shí)候，特異于具體抗原的抗體的種類-特異性檢測也是必需的。為了診斷新近的急性感染，特別有興趣的是檢測對抗原具有特異性的IgM類抗體。但是，多種干擾因子(比如特異性相同的IgG抗體的存在)頻繁地干擾著抗原-特異性IgM抗體的檢測。
在現(xiàn)有技術(shù)中，已經(jīng)描述了多種用于檢測對抗原具有特異性的具體種類的抗體的方法。因此，通過把特異性抗體結(jié)合到用特異性的抗原包被的固相上，頻繁地檢測具體種類的抗原-特異性抗體。通過把特異性地針對某類人Ig的抗體結(jié)合到待檢測的Ig分子上，檢測特異于抗原的、目前被結(jié)合到固相上的免疫球蛋白(Ig)。給針對人Ig的抗體提供一個(gè)標(biāo)記，借此進(jìn)行檢測。但是，這樣的一種測試方法僅在下列情況下是可能的，即如果在與針對人Ig的種類-特異性標(biāo)記的抗體反應(yīng)之前，通過洗滌除去所有的非特異性非結(jié)合的Ig。因此，作為通常需要的、用于自動(dòng)系統(tǒng)的一步測試方法是不可能的。此外，對抗原具有特異性的所有種類的抗體都在第一步中結(jié)合到固相上。如果抗原對固相的包被不是足夠充分的話，那么可能會(huì)發(fā)生多種抗體結(jié)合到抗原上的競爭反應(yīng)。這會(huì)削弱測試的靈敏度。
由所謂的橋測驗(yàn)(Bruckentest)提供了以一步測試進(jìn)行抗體檢測的一種可能性。在EP-A-0 280 211中描述了橋測驗(yàn)的概念。在該方法中，把能夠特異性地結(jié)合到待測定的抗體上的第一受體(比如抗原)結(jié)合到固相上。待測定的抗體結(jié)合到固相-結(jié)合的抗原上。此外，在測試混合物中存在另一種提供了標(biāo)記的特異性抗原。通過標(biāo)記來檢測抗體。但在這種測試中，檢測了所有的抗原-特異性抗體、而不僅僅是具體種類的抗體。
當(dāng)測定抗原-特異性IgM抗體時(shí)，其它的干擾是由類風(fēng)濕因子造成的。類風(fēng)濕因子自身常為IgM類抗體，它通常對IgG抗體的Fc片段具有高的親和力。結(jié)果，類風(fēng)濕因子看來似乎提供了IgG抗體，從而在免疫測定中對于特異性的IgM抗體而言，結(jié)合了類風(fēng)濕因子。如果類風(fēng)濕因子已經(jīng)結(jié)合了具有待檢測的特異性的IgG分子的話，這會(huì)導(dǎo)致假-陽性的測量結(jié)果。
在抗原-特異性抗體的種類-特異性檢測中，這一問題是DE 3303793的主題。該文獻(xiàn)描述了一種用于檢測某類Ig(“IgX”)的抗原-特異性抗體的方法，其中通過加入抗-IgG抗體來消除類風(fēng)濕因子的干擾。在該方法中，把特異性抗原(諸如病毒抗原)施加到固體載體上。使結(jié)合到固相上的病毒抗原與樣品接觸。在下一步中，除去未結(jié)合的樣品，并用抗-IgX抗體檢測結(jié)合到固相上的抗原-IgX的復(fù)合物。為了尤其在IgM測試中避免類風(fēng)濕因子的干擾，在測試前用抗-IgG抗體處理樣品。因此，以這種方式復(fù)合的IgG抗體不再適合于類風(fēng)濕因子的進(jìn)攻，從而類風(fēng)濕因子不能結(jié)合抗原-特異性IgG分子，其中所述的IgG分子又能導(dǎo)致假-陽性的結(jié)果。但是，無論其特異性如何，所有的IgG抗體都被結(jié)合。抗IgG抗體對IgG抗體的干擾而發(fā)生的沉淀會(huì)導(dǎo)致不希望有的沉淀物和渾濁，而這對整個(gè)的測試具有不利的影響。此外，用抗IgG抗體預(yù)處理樣品也是很復(fù)雜的。
在WO 96/14337中公開了另一種通過特異性相同的其它種類的抗體來消除干擾的方法。在這種情況下，使用與IgG重鏈的Fd部分特異性反應(yīng)的抗體或抗體片段來消除IgG抗體的干擾。結(jié)果，IgGs的抗原結(jié)合能力被掩飾得如此之強(qiáng)，以致于它們不再能識別特異性的抗原。類似的概念在WO 96/14338中也有所描述。
在這種情況下，使用抗-Fd抗體或其片段作為消除干擾的試劑，以便減少類風(fēng)濕因子的干擾。但是，通過高度特異性的抗-Fd試劑來減少干擾是復(fù)雜和昂貴的。
在不必加入精心制造的和昂貴的消除干擾的試劑和/或幾種特異性抗體的情況下，現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法不能使得以一步法來檢測IgM類免疫球蛋白的抗原-特異性抗體。從現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)已知的、以橋測驗(yàn)概念為基礎(chǔ)的檢測的免疫學(xué)方法(其中使用了能夠結(jié)合到固相上的標(biāo)記的抗原和抗原)的確能夠進(jìn)行一步測試。但是迄今為止利用這一簡單的原理，僅僅已經(jīng)可能同時(shí)檢測出IgG和IgM類抗體。
因此，所述的目的為提供一種用于檢測針對抗特異性抗原的IgM類抗體的改進(jìn)的方法。該方法不應(yīng)當(dāng)需要精心制造的和昂貴的消除干擾的試劑，并且為了在自動(dòng)系統(tǒng)中有利地使用，該方法應(yīng)當(dāng)優(yōu)選地由一步試驗(yàn)的原理組成。
這一目的是通過根據(jù)本發(fā)明用于測定M類免疫球蛋白的抗原-特異性抗體的方法來實(shí)現(xiàn)的，該方法通過與至少兩種不同的受體R1和R2一起培養(yǎng)所述的樣品(其中的兩種受體都能特異性地結(jié)合到抗體上，R1被結(jié)合或者可以結(jié)合到固相上，而R2攜帶一個(gè)標(biāo)記)來實(shí)現(xiàn)，其中R1的基本組成為被待測定的抗體特異性識別的呈多聚體形式的結(jié)合配偶體，并且通過加入呈單體形式的結(jié)合配偶體來消除存在于樣品中的特異性相同的IgG分子的干擾。
與IgG抗體相比，存在于樣品中的與待檢測的IgM抗體具有相同特異性的IgA，IgD和IgE抗體以非常低的濃度存在，從而預(yù)計(jì)沒有IgA，IgD和IgE類的干擾。IgA，IgD和IgE類抗體-象IgG分子那樣，與以五聚物-抗體存在的IgM抗體相比，上述抗體都是以單個(gè)分子的形式存在的，而且每種抗體都有兩個(gè)針對抗原的結(jié)合位點(diǎn)。由于IgG，IgA，IgD和IgE抗體結(jié)構(gòu)的相似，因此通過下述用于抗原-特異性IgM檢測的方法，除了由IgG抗體造成的以外，估計(jì)可能還減少了IgD，IgA和IgE抗體的干擾。
本發(fā)明的方法可以進(jìn)行樣品中M類免疫球蛋白的抗原-特異性抗體的測定，其中存在具有相同的抗原特異性的IgG類抗體。此外，本發(fā)明的方法還可以在有類風(fēng)濕因子存在的情況下進(jìn)行。而細(xì)致地預(yù)處理樣品不是必需的。
結(jié)果已經(jīng)令人吃驚地弄清楚的是根據(jù)本發(fā)明呈單體形式的結(jié)合配偶體在用于檢測抗原-特異性IgM抗體的免疫測定中的用途使得能夠有效地消除由抗原特異性相同的IgG抗體造成的干擾。在該方法中，呈單體形式的結(jié)合配偶體特異性地結(jié)合到IgG抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)上。存在于同一樣品中特異性相同的待檢測的IgM抗體令人吃驚地不與呈單體形式的結(jié)合配偶體反應(yīng)或者僅在可忽略不計(jì)的微弱的程度上反應(yīng)。術(shù)語“可忽略不計(jì)的微弱的”是指IgM抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)不被呈單體形式的結(jié)合配偶體封閉。推測起來這是由于與以單個(gè)分子形式存在的對單體表位具有實(shí)質(zhì)上較高親和力的IgG抗體相比，五聚的IgM抗體與單體表位的親和力要低許多。這就意味著盡管存在呈單體形式的結(jié)合配偶體，但仍不削弱IgM測試的靈敏度。被呈單體形式的結(jié)合配偶體掩飾的IgG抗體不干擾IgM的測試。
結(jié)果還令人吃驚地弄清楚的是通過結(jié)合到IgGs的抗原結(jié)合位點(diǎn)上的呈單體形式的結(jié)合配偶體還可以有效地消除已經(jīng)結(jié)合了IgG抗體的類風(fēng)濕因子的干擾。由于封閉了IgG抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，因此在事先沒有分離IgG抗體或類風(fēng)濕因子的情況下，可以檢測出抗原-特異性IgM抗體。呈單體形式使用的結(jié)合配偶體不能引起被掩飾的IgG抗體或類風(fēng)濕因子的凝集反應(yīng)。這就防止了由于沉淀物造成的不希望有的渾濁，這種渾濁會(huì)不利地影響著整個(gè)的測試方法。
由于IgM抗體不干擾，因此在本發(fā)明的方法中，用于分離IgG抗體的連續(xù)測試步驟就不是絕對必需的。因而，所述方法的特殊的優(yōu)點(diǎn)為簡化了測試步驟。
除了其中的測試試劑存在于液相中的所謂的濕法測試以外，還可以使用適于蛋白或抗體檢測的所有標(biāo)準(zhǔn)的干法測試形式。在這些干法測試或者例如在EP-A-0 186 799中所述的測試帶(Teststreifen)中，將測試組分施加到載體上。因此如果以測試帶的形式來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法的話，就不需要洗滌步驟。但是，本發(fā)明的方法優(yōu)選是以濕法測試進(jìn)行的。
在一起培養(yǎng)所有的受體和呈單體形式的結(jié)合配偶體以及樣品并且在一個(gè)步驟中實(shí)現(xiàn)所述的方法是可能的。在培養(yǎng)之后，該方法可以選擇地僅需要一個(gè)洗滌的步驟。
一般使用兩種不同的受體R1和R2以及呈單體形式的結(jié)合配偶體來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。如果使用了濕法測試的話，受體R2存在于液相中。R1可以存在于液相中或者已經(jīng)被結(jié)合到固相上。呈單體形式的結(jié)合配偶體優(yōu)選存在于液相中。
如果把能夠結(jié)合到固相上、但是仍然沒有結(jié)合到固相上的受體用作R1的話，那么與受體R1和R2以及呈單體形式的結(jié)合配偶體一起培養(yǎng)樣品。在該過程中，樣品抗體結(jié)合到R1和R2上。這一培養(yǎng)可以在有固相存在的條件下進(jìn)行。在該過程中形成了一種復(fù)合物，它由固相-R1-樣品抗體-R2組成。隨后從液相中分離出固相，可以選擇地洗滌并測量R2的標(biāo)記。通常是在固相中測量所述標(biāo)記的，但是也可以在液相中進(jìn)行測定。
如果與R1和R2以及呈單體形式的結(jié)合配偶體一起培養(yǎng)樣品是在沒有固相的條件下進(jìn)行的話，那么隨后必須使整個(gè)的測試混合物與固相接觸，可以選擇地進(jìn)行洗滌并且測量標(biāo)記。
如果受體R1已呈固相-結(jié)合的形式，那么把樣品和受體R2加入固相-結(jié)合的受體R1中并一起培養(yǎng)。在該測試方法中，在把測試混合物加入固相-結(jié)合的受體R1中之前，優(yōu)選與呈單體形式的結(jié)合配偶體和R2一起預(yù)培養(yǎng)樣品。另外的步驟對應(yīng)于以上所述的方法。
也可能通過幾個(gè)步驟來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。在這種情況下，優(yōu)選與呈單體形式的結(jié)合配偶體一起培養(yǎng)樣品、然后再與受體R1和R2一起培養(yǎng)。隨后可以與其它的受體一起培養(yǎng)測試混合物，由此該方法可以通過幾個(gè)步驟來實(shí)現(xiàn)。另外的測試步驟對應(yīng)于前面描述的方法。
R1的重要組成為被待測定的IgM抗體特異性識別的呈多聚體形式的結(jié)合配偶體，它也可以被稱作聚半抗原(polyhapten)。認(rèn)為本發(fā)明的呈多聚體形式的結(jié)合配偶體的結(jié)構(gòu)如下，其中把幾個(gè)優(yōu)選相同的或者類似的、相當(dāng)?shù)谋砦粎^(qū)偶聯(lián)到與待測定的抗體特異性反應(yīng)的載體上。術(shù)語“類似的”或者“相當(dāng)?shù)摹笔侵冈诔识嗑垠w形式的結(jié)合配偶體中存在的結(jié)構(gòu)不必所有的都必須是相同的。唯一的條件是待測定的IgM抗體特異性地結(jié)合到這些表位區(qū)上。表位區(qū)例如可以從抗原或者抗-獨(dú)特型抗體得到。表位區(qū)還可以從糖鏈得到，象那些例如在糖化蛋白中出現(xiàn)的糖鏈。它也可以由脂類結(jié)構(gòu)得到，象那些例如在磷脂或脂蛋白中出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)。因此，聚半抗原或呈多聚體形式的結(jié)合配偶體是由許多相同的或者類似的表位區(qū)組成的，因而針對上面已經(jīng)提及的樣品抗體來說具有許多類似的結(jié)合位點(diǎn)。在以蛋白作為抗原的情況下，結(jié)合位點(diǎn)被認(rèn)為是一種肽，它的序列為蛋白抗原(分析物)的蛋白序列的一部分，并且抗該蛋白的抗體特異性地結(jié)合到其上。在含有糖結(jié)構(gòu)的抗原的情況下，結(jié)合位點(diǎn)將為糖分子的區(qū)域，其中樣品抗體特異性地結(jié)合到糖分子上。在脂類結(jié)構(gòu)的情況下，脂類分子可以是針對樣品抗體的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合位點(diǎn)還可以由肽的區(qū)域與糖和/或脂類的組合組成。但是，優(yōu)選使用以肽為基礎(chǔ)的聚半抗原作為呈多聚體形式的結(jié)合配偶體。在本發(fā)明呈多聚體形式的結(jié)合配偶體的情況下，高表位密度的重要性是第一位的，從而五聚的IgM樣品抗體能夠通過高親和力特異性地結(jié)合到呈多聚體形式的結(jié)合配偶體上。本發(fā)明呈多聚體形式的結(jié)合配偶體的個(gè)別肽組成的其它標(biāo)準(zhǔn)對應(yīng)于下述呈單體形式的結(jié)合配偶體的要求。
例如，乳膠、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯或者金的顆?？梢杂米骶郯肟乖妮d體物質(zhì)。聚合物、比如葡聚糖或多肽(如聚賴氨酸)、牛血清白蛋白、β-半乳糖苷酶、非特異性免疫球蛋白或其片段也可以用作聚半抗原的載體物質(zhì)。在選擇載體的過程中，唯一的條件是在樣品液體中與抗體沒有交叉反應(yīng)性。另一個(gè)條件為把半抗原偶聯(lián)到載體上必須是可能的。通過例如在EP-A-0 650 053和WO96/03652中所述的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法，把表位區(qū)或半抗原偶聯(lián)到載體物質(zhì)上。此外，在表位區(qū)和載體物質(zhì)之間可以插入間隔區(qū)，這一內(nèi)容在前述未審查的延遲公開的專利申請中也進(jìn)行了描述?？梢允褂帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的所有的間隔區(qū)。一個(gè)要求是在免疫學(xué)上它們是沒有活性的，即它們與樣品中的抗體不發(fā)生交叉反應(yīng)。
R1或者可以被直接結(jié)合到固相上，或者通過特異性結(jié)合系統(tǒng)間接地結(jié)合到固相上。通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法來實(shí)現(xiàn)R1與固相的直接結(jié)合。如果通過特異性結(jié)合系統(tǒng)將R1間接地結(jié)合到固相上的話，那么R1是一種由本發(fā)明呈多聚體形式的結(jié)合配偶體和特異性結(jié)合系統(tǒng)的反應(yīng)配偶體組成的綴合物。在這種情況下，認(rèn)為特異性結(jié)合系統(tǒng)是兩個(gè)可以彼此特異性地反應(yīng)的配偶體。在該情況下，結(jié)合能力可以以免疫反應(yīng)或者另一種特異性的反應(yīng)為基礎(chǔ)。優(yōu)選地使用生物素和親和素的組合或者生物素和鏈霉抗生物素蛋白的組合作為特異性結(jié)合系統(tǒng)。其它優(yōu)選的組合為生物素和抗生物素、半抗原和抗-半抗原、抗體的Fc片段和抗該Fc片段的抗體、或者糖和凝集素。那么，這種可以特異性結(jié)合配對的反應(yīng)配偶體之一即為形成受體R1的綴合物的一部分。
此外，特異性結(jié)合系統(tǒng)的其它反應(yīng)配偶體存在于固相中。通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的常規(guī)方法，可以將特異性結(jié)合系統(tǒng)的其它反應(yīng)配偶體結(jié)合到不溶的載體物質(zhì)上。在這種情況下，共價(jià)結(jié)合以及吸附結(jié)合是適宜的。特別合適的固相為由聚苯乙烯或類似的塑料制成的試管或微量滴定板，其內(nèi)表面被特異性結(jié)合系統(tǒng)的反應(yīng)配偶體所包被。顆粒狀物質(zhì)，諸如乳膠顆粒、分子篩物質(zhì)、玻璃珠、塑料管等也是合適的并且是特別優(yōu)選的。多孔的層狀載體、比如紙也可以用作載體。
受體R2是由與樣品抗體特異性反應(yīng)的分子和標(biāo)記組成的。與樣品抗體特異性反應(yīng)的分子例如可以為特異性地結(jié)合到樣品抗體上的抗體、抗體片段、蛋白、抗原或者半抗原。對作為R2的組成的分子來說，唯一的條件是它與待檢測的樣品抗體特異性地反應(yīng)。該分子優(yōu)選為特異性地結(jié)合樣品抗體的本發(fā)明的呈多聚體形式的結(jié)合配偶體。通過與針對R1的呈多聚體形式的結(jié)合配偶體同樣的方法，制備R2中包含的呈多聚體形式的結(jié)合配偶體。
受體R2的另一個(gè)組分為標(biāo)記。可以直接檢測到的物質(zhì)優(yōu)選用作標(biāo)記，例如化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、熒光物質(zhì)或放射性物質(zhì)或者金溶膠、乳膠或金粒子。酶或其它生物分子也優(yōu)選作標(biāo)記、比如半抗原。在半抗原中，洋地黃毒苷是一種特別優(yōu)選的標(biāo)記。用于標(biāo)記的方法為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟悉并且在此不必進(jìn)一步加以說明。通過測量化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、熒光物質(zhì)或放射性物質(zhì)或者金溶膠、乳膠或金粒子或者通過測量由所述酶轉(zhuǎn)化的底物，以眾所周知的方式直接檢測標(biāo)記。
還可以間接地檢測所述的標(biāo)記。在這種情況下，另一個(gè)受體(其自身又被偶聯(lián)到一個(gè)產(chǎn)生信號的基團(tuán)上)特異性地結(jié)合到R2的標(biāo)記(比如洋地黃毒苷這樣的半抗原)上。通過為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟悉的方法來檢測產(chǎn)生信號的基團(tuán)，例如化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、熒光物質(zhì)或放射性物質(zhì)或者酶或金粒子。例如，抗體或抗體的片段可以用作特異性地結(jié)合到R2的標(biāo)記上的另一種受體。如果使用了標(biāo)記的這種間接檢測的話，那么R2標(biāo)記優(yōu)選為洋地黃毒苷或者另一種半抗原，并且通過偶聯(lián)到過氧化物酶上的抗體進(jìn)行檢測，所述抗體針對洋地黃毒苷或者抗半抗原。
為了減少抗原特異性相同的IgG抗體的干擾，根據(jù)本發(fā)明把呈單體形式的結(jié)合配偶體加入測試混合物中。術(shù)語“單體”是指本發(fā)明呈單體形式的結(jié)合配偶體僅含有針對待減少干擾的抗體的一個(gè)表位區(qū)或者僅有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，即與IgG抗體進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)的結(jié)構(gòu)。為了保證僅有待減少干擾的抗原-特異性IgG抗體結(jié)合到呈單體形式的結(jié)合配偶體上、而待檢測的IgM抗體不結(jié)合，這些結(jié)合配偶體的單體結(jié)構(gòu)是很重要的。
表位區(qū)-如上所述針對于呈多聚體形式的結(jié)合配偶體-例如可以從抗原或者抗-獨(dú)特型抗體得到。根據(jù)針對呈多聚體形式的結(jié)合配偶體的前提條件，呈單體形式的結(jié)合配偶體的表位區(qū)也可以由糖和/或脂類結(jié)構(gòu)或者肽、脂類和/或糖組分組合的結(jié)構(gòu)得到?？梢允褂每捎杀砦粎^(qū)得到的所有結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)具有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，而在有特異性相同的IgM抗體存在的條件下待減少干擾的IgG類抗體特異地結(jié)合到所述結(jié)合位點(diǎn)上。對結(jié)合位點(diǎn)、即對以單體形式使用的結(jié)合配偶體而言，唯一的前提條件是保留結(jié)合到IgG上的特異的能力。這一條件也適用于在結(jié)合位點(diǎn)中存在糖或脂類結(jié)構(gòu)的情況。
根據(jù)本發(fā)明，還可能使用位于結(jié)合位點(diǎn)兩側(cè)或者與結(jié)合位點(diǎn)重疊的呈單體形式的結(jié)合配偶體，其中待消除干擾的IgG抗體特異性地結(jié)合到所述結(jié)合位點(diǎn)上。因而還可能消除IgG抗體的干擾，該抗體的結(jié)合位點(diǎn)包括一個(gè)與被待檢測的IgM抗體識別的表位不完全相同的表位。這些IgG抗體可以與待檢測的IgM抗體之間具有或多或少的交叉反應(yīng)性。對應(yīng)于這些交叉反應(yīng)性抗體的表位并從而對這些表位具有高度親和力的呈單體形式的結(jié)合配偶體的加入也消除了這些IgG抗體的干擾。在或多或少的程度上與待測IgM抗體表位重疊的呈單體形式的結(jié)合配偶體的混合物優(yōu)選用于消除IgG抗體的干擾。
優(yōu)選使用肽作為呈單體形式的結(jié)合配偶體。在以蛋白作為分析物的情況下，結(jié)合位點(diǎn)被認(rèn)為是一種肽-類似于針對呈多聚體形式的結(jié)合配偶體的定義，它的序列為蛋白抗原的蛋白序列的一部分，并且針對該蛋白的抗體(在本發(fā)明的情況下為IgG抗體)特異性地結(jié)合到它的上面。除了這些肽以外，還認(rèn)為結(jié)合位點(diǎn)包括具有氨基酸序列的肽，它具有與前述的肽基本上相當(dāng)?shù)奶禺愋院?或結(jié)合到待檢測的IgG抗體上的親和力。這些肽優(yōu)選地可以由前述的肽通過取代、缺失或插入個(gè)別的氨基酸殘基得到。
還認(rèn)為本發(fā)明的對應(yīng)于特異性結(jié)合位點(diǎn)的肽包括肽的衍生物，其中通過化學(xué)反應(yīng)已經(jīng)使一個(gè)或幾個(gè)氨基酸衍生化。具體說來，本發(fā)明的肽的衍生物的例子為那些其中的主鏈或/和活性氨基酸側(cè)基(例如游離的氨基、游離的羧基或/和游離的羥基)已被衍生化的分子。氨基衍生物的具體實(shí)例為氨磺?；虬奔柞！⒘虼被姿嵋阴サ难苌镆约颁@鹽(例如鹽酸化物)。羧基衍生物為鹽、酯和酰胺。羥基衍生物的例子為O-?；騉-烷基衍生物。所述的肽優(yōu)選是根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法通過化學(xué)合成生產(chǎn)的，并且在此不必進(jìn)行特別的說明。
此外，術(shù)語肽的衍生物還包括這樣的一些肽，其中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被20種“標(biāo)準(zhǔn)”氨基酸的天然存在的或者非天然存在的氨基酸同系物取代。上述同系物的實(shí)例為4-羥脯氨酸、5-羥賴氨酸、3-甲基組氨酸、高絲氨酸、鳥氨酸、β-丙氨酸和4-氨基丁酸。肽的衍生物必須具有與所述的肽基本上相當(dāng)?shù)奶禺愋曰?和結(jié)合到待減少干擾的IgG抗體上的親和力，其中所述衍生物是由所述的肽得到的。
本發(fā)明的對應(yīng)于特異性結(jié)合位點(diǎn)的肽也被稱為肽-模擬物質(zhì)、即下文中的肽-模擬物，該物質(zhì)具有與前述的肽或肽的衍生物基本上相當(dāng)?shù)奶禺愋曰?和結(jié)合到待減少干擾的IgG抗體上的親和力。肽-模擬物是化合物，就其與待測定的抗體的相互作用而論，肽-模擬物可以代替肽，并且尤其是對蛋白酶和肽酶來說，所述的模擬物可以比天然的肽具有更高的穩(wěn)定性。在下列文獻(xiàn)中描述了用于生產(chǎn)肽-模擬物的方法Giannis和Kolter，“Angew.Chem.”105(1993)，1303-1326以及Lee等人，《日本化學(xué)協(xié)會(huì)會(huì)刊》66(1993)，2006-2010。
本發(fā)明的結(jié)合位點(diǎn)的長度、即單體肽的長度通常至少為4個(gè)氨基酸。所述長度優(yōu)選介于4至20個(gè)、6至15個(gè)或者特別優(yōu)選介于9至12個(gè)氨基酸之間。就肽-模擬物或肽的衍生物而言，考慮到分子的大小，類似的長度是必須的。
本發(fā)明的作為呈單體形式的結(jié)合配偶體的單體肽含有表位，其中待減少干擾的IgG抗體特異性地聚合到該表位上。但是，不再對應(yīng)于特異性表位的其它側(cè)翼肽序列可以存在于所述肽的N-末端和/或C-末端。這一措施對于改善所述肽的溶解性可能是必須的。唯一的前提條件是作為呈單體形式的結(jié)合配偶體的肽實(shí)際上是作為單體存在的并且保留了強(qiáng)烈地結(jié)合到待減少干擾的IgG抗體上的能力。
針對呈單體形式的結(jié)合配偶體(在該情況下為肽)的用途而言，一個(gè)前提條件是與存在于呈多聚體形式的結(jié)合配偶體或呈多聚體形式的聚半抗原上的表位相同的表位是以單體形式存在的。這就意味著為了有效地消除干擾，結(jié)合到呈單體形式的結(jié)合配偶體上的IgG抗體必須與待檢測的IgM抗體具有相同的免疫特異性。在IgM抗體的測試中，總是應(yīng)當(dāng)消除抗原特異性相同的IgG抗體的干擾。
與在呈多聚體形式的結(jié)合配偶體上的表位的濃度相比，優(yōu)選以過剩10倍至10,000倍的量來使用呈單體形式的結(jié)合配偶體。呈單體形式的結(jié)合配偶體優(yōu)選以過剩10倍至1000倍的量來使用，特別優(yōu)選地以過剩100倍的量加以使用。呈單體形式的結(jié)合配偶體的濃度僅僅限制到呈單體形式的結(jié)合配偶體在某濃度以上不再溶解的程度。在呈多聚體形式的結(jié)合配偶體上的表位的濃度取決于載體物質(zhì)的尺寸，并且針對任何的測試方法和任何的檢測參數(shù)可以容易地由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員單獨(dú)加以確定。在肽型表位(長度6至20個(gè)氨基酸)的情況下，對在呈多聚體形式的結(jié)合配偶體上的表位的濃度而言，指導(dǎo)值為每毫升載體物質(zhì)5至500ng的肽是合適的。
為了另外再減少IgG抗體的干擾，除了呈單體形式的結(jié)合配偶體以外，還可以使用其它的消除干擾的試劑、比如在介紹中所述的抗-Fd抗體。
對于抗原-特異性IgM的測試而言，可以采用多相以及均相方法作為測試方法。在均相測試方法中，不把由R1、樣品-IgM和R2組成的復(fù)合物結(jié)合到固相上。而幾種上述復(fù)合物彼此的凝集造成了渾濁，這對IgM的濃度是一種測量。減少了IgG干擾的呈單體形式的結(jié)合配偶體并不抑制凝集作用。
但是，優(yōu)選實(shí)施多相方法。特別優(yōu)選地實(shí)施一種根據(jù)橋測驗(yàn)原理的方法(參見EP-A-0 280 211)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，采用本發(fā)明的聚半抗原和特異性結(jié)合系統(tǒng)的結(jié)合配偶體(優(yōu)選生物素)的綴合物作為R1。R2由本發(fā)明的聚半抗原或呈多聚體形式的結(jié)合配偶體和標(biāo)記(優(yōu)選洋地黃毒苷)組成。在R1和R2中，特別優(yōu)選使用相同的聚半抗原。在這一優(yōu)選的實(shí)施方案中，在有用在該情況下優(yōu)選的親和素或鏈霉抗生物素蛋白包被的固相存在的條件下，將受體R1和R2與樣品以及呈單體形式的結(jié)合配偶體(優(yōu)選肽)同時(shí)培養(yǎng)。在該方法中，R1和R2的呈多聚體形式的結(jié)合配偶體與待測定的IgM抗體特異性地反應(yīng)，而特異性相同的IgG抗體被肽、即被呈單體形式的結(jié)合配偶體掩飾、從而它們便不能結(jié)合到呈多聚體形式的結(jié)合配偶體上。因此，親和素/鏈霉抗生物素蛋白-R1-IgM-樣品抗體-R2的完整的復(fù)合物被結(jié)合到固相上。在從液相中分離出固相并且任選地洗滌固相之后，與特異性識別R2的標(biāo)記的其它受體(在這種情況下與抗洋地黃毒苷的抗體)一起培養(yǎng)結(jié)合到固相上的復(fù)合物。把另一種受體偶聯(lián)到產(chǎn)生信號的基團(tuán)(優(yōu)選用過氧化物酶)上。在經(jīng)歷了另一任選的洗滌步驟之后，通過產(chǎn)生信號的基團(tuán)來檢測樣品抗體，在這種情況下通過由酶轉(zhuǎn)化的底物進(jìn)行檢測。在該測試方法中，與R1、R2、呈單體形式的結(jié)合配偶體以及其它受體一起培養(yǎng)樣品也可以同時(shí)進(jìn)行。這更加簡化了測試方法。
上述測試方法還非常適于應(yīng)用到自動(dòng)系統(tǒng)中。還可能檢測出幾種抗原-特異性IgM抗體，比如抗多種HIV抗原的HIV抗體。在這種情況下，所述的其它受體還可以用作通用的標(biāo)記，這是因?yàn)檫@種其它受體特異性地識別R2標(biāo)記。如果同時(shí)檢測出抗原特異性不同的幾種IgM抗體的話，R1和R2的聚半抗原的組成以及用于減少干擾的呈單體形式的結(jié)合配偶體必須具有合適的特異性。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的所有生物液體都可以用作樣品。體液(諸如全血、血清、血漿、尿、唾液等)優(yōu)選用作樣品。
除了上述樣品以外，固相和前述的受體、取決于應(yīng)用而可能需要的其它添加劑(諸如緩沖液，鹽，洗滌劑，蛋白添加劑、比如BSA)可以存在于測試混合物中。必需的添加劑是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，并且可以由所述的技術(shù)人員通過簡單的方式加以確定。
此外，本發(fā)明的一個(gè)主題為一種用于測定M類免疫球蛋白的抗原-特異性抗體的試劑，其中除了用于免疫測定的常用的測試添加劑以外，所述試劑還包含呈單體形式的結(jié)合配偶體(即優(yōu)選肽)和能夠結(jié)合到待測定的抗體上的受體R1，其中R1能夠結(jié)合到固相上并且它的基本組成為被待測定的抗體特異性識別的呈多聚體形式的結(jié)合配偶體。
本發(fā)明的另一個(gè)主題為一種用于測定M類免疫球蛋白的抗原-特異性抗體的試劑，其中除了用于免疫測定的常用的測試添加劑以外，所述試劑還包含呈單體形式的結(jié)合配偶體(即優(yōu)選肽)和能夠結(jié)合到待測定的抗體上的兩種受體R1和R2，其中的R1能夠結(jié)合到固相上、而R2攜帶一個(gè)標(biāo)記，其中受體R1和R2各自的基本組成均為被待測定的抗體特異性識別的呈多聚體形式的結(jié)合配偶體。
本發(fā)明的另一個(gè)主題為呈多聚體形式的結(jié)合配偶體通過本發(fā)明前述方法之一用于IgM抗體的抗原-特異性測定的用途。
本發(fā)明的再一個(gè)主題為呈單體形式的結(jié)合配偶體(即優(yōu)選肽)用于在抗原-特異性IgM抗體的測定中減少IgG抗體和/或類風(fēng)濕因子干擾的用途。
本發(fā)明通過下面的實(shí)施例加以解釋。
實(shí)施例抗原-特異性IgM的測試抗-HIV 2-IgM將生物素-標(biāo)記的和洋地黃毒苷-標(biāo)記的多聚體抗原(HIV2)與樣品抗體和鏈霉抗生物素蛋白-包被的固相一同培養(yǎng)(在25℃或37℃下培養(yǎng)大約60至180分鐘，在本實(shí)施例中120分鐘，25℃)。在洗滌步驟之后，結(jié)合到壁上的免疫復(fù)合物與抗-洋地黃毒苷-過氧化物酶的綴合物反應(yīng)(在25℃或37℃下培養(yǎng)大約30至120分鐘，在本實(shí)施例中60分鐘，25℃)。在另一洗滌步驟之后，通過底物的反應(yīng)來檢測過氧化物酶綴合物-標(biāo)記的免疫復(fù)合物(在25℃或37℃下培養(yǎng)大約30至120分鐘，在本實(shí)施例中60分鐘，25℃)。
反應(yīng)步驟(除了底物的反應(yīng)之外)在Tris/HCl緩沖液(pH7.5，50至150mM，在本實(shí)施例中為100mM)中發(fā)生，所述緩沖液包含約0.05至0.4％的洗滌劑(此處為0.2％的聚多卡醇)以及約0.5％的蛋白/蛋白衍生物的添加劑(此處尤其為來自乳白蛋白和BSA的胨)。
這種情況下的樣品抗體為抗HIV2表位的單克隆小鼠抗體(IgM與IgG)，將該抗體在抗-HIV陰性人血清中稀釋到大約2-10μg/ml。
與在聚半抗原上的肽表位的濃度相比，同過剩了10倍或100倍的游離的未標(biāo)記的HIV2肽抗原發(fā)生了競爭。
測試信號的單位為mA
單體肽的加入使得可以進(jìn)行特異于IgM的HIV2抗體的測試。在不加入肽的情況下，一些樣品給出了假-陽性的測試結(jié)果。
權(quán)利要求
1.用于測定M類免疫球蛋白的抗原-特異性抗體的方法，該方法通過與至少兩種不同的受體R1和R2一起培養(yǎng)所述的樣品，其中的兩種受體都能特異性地結(jié)合到所述抗體上，R1被結(jié)合到或者可以被結(jié)合到固相上、而R2攜帶一個(gè)標(biāo)記，其特征在于R1的基本組成為被待測定的抗體特異性識別的呈多聚體形式的結(jié)合配偶體，并且通過加入呈單體形式的結(jié)合配偶體來減少樣品中存在的特異性相同的IgG分子的干擾。
2.如權(quán)利要求1所要求保護(hù)的方法，其特征在于R1和R2的基本組成為被待測定的抗體特異性識別的呈多聚體形式的結(jié)合配偶體，并且通過加入呈單體形式的結(jié)合配偶體來減少樣品中存在的特異性相同的IgG分子的干擾。
3.如權(quán)利要求1或2所要求保護(hù)的方法，其特征在于使用生物素/親和素、生物素/鏈霉抗生物素蛋白、生物素/抗生物素、半抗原/抗半抗原、抗體的Fc片段/抗該Fc片段的抗體或糖/凝集素作為特異性結(jié)合系統(tǒng)，以便將R1結(jié)合到所述固相上。
4.如權(quán)利要求1至3之一所要求保護(hù)的方法，其特征在于所述的受體R2是用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、熒光物質(zhì)或放射性物質(zhì)、或者用酶或另一種生物分子標(biāo)記的。
5.如權(quán)利要求1至4之一所要求保護(hù)的方法，其特征在于所述的樣品與R1和R2以及用于減少干擾的呈單體形式的結(jié)合配偶體同時(shí)培養(yǎng)。
6.如權(quán)利要求1至5之一所要求保護(hù)的方法，其特征在于所述的測試混合物與特異性地結(jié)合到所述受體R2的所述標(biāo)記上的其它受體一起培養(yǎng)，其中所述的其它受體為一種針對R2的標(biāo)記的特異性受體和標(biāo)記組成的綴合物，隨后測定所述的標(biāo)記。
7.如權(quán)利要求1至6之一所要求保護(hù)的方法，其特征在于與在所述R1和R2的呈多聚體形式的結(jié)合配偶體上的表位濃度相比，以過剩10倍至10,000倍的量加入所述用于減少干擾的呈單體形式的結(jié)合配偶體。
8.用于測定根據(jù)前述權(quán)利要求之一的M類免疫球蛋白的抗原-特異性抗體的試劑，其特征在于除了用于免疫測定的常用的測試添加劑以外，所述試劑包含呈單體形式的結(jié)合配偶體以及能夠結(jié)合到所述待測定的抗體上的受體R1，所述受體能夠結(jié)合到固相上并且其基本組成為呈多聚體形式的結(jié)合配偶體。
9.用于測定根據(jù)前述權(quán)利要求之一的M類免疫球蛋白的抗原-特異性抗體的試劑，其特征在于除了用于免疫測定的常用的測試添加劑以外，所述試劑包含呈單體形式的結(jié)合配偶體以及能夠結(jié)合到所述待測定的抗體上的兩種受體R1和R2，所述兩種受體的基本組成均為呈多聚體形式的結(jié)合配偶體，并且其中R1能夠結(jié)合到固相上、而R2攜帶一個(gè)標(biāo)記。
10.呈單體形式的結(jié)合配偶體用于在抗原-特異性IgM抗體的測定中減少IgG抗體和/或類風(fēng)濕因子干擾的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在有G類免疫球蛋白和/或類風(fēng)濕因子存在的情況下,用于測定體液中M類免疫球蛋白的抗原特異性抗體的方法,該方法通過與至少兩種不同的受體R
文檔編號G01N33/68GK1245560SQ97181480
公開日2000年2月23日 申請日期1997年11月26日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月29日
發(fā)明者E·法茨, U·施米特, B·奧芬羅赫－黑恩勒 申請人:羅赫診斷器材股份有限公司