本發(fā)明涉及檢測(cè)，具體涉及一種維生素k1及其異構(gòu)體檢測(cè)和含量測(cè)定方法。

背景技術(shù)：

1、維生素k1為2-甲基-1,4-萘醌的衍生物，化學(xué)式為c31h46o2，其為脂溶性維生素，呈黃色至橙色透明黏稠液體，無(wú)臭，易溶于氯仿、乙醚及植物油，微溶于乙醇，不溶于水。加熱至120℃才會(huì)分解，但易受紫外線照射而破壞，故要避光保存。維生素k1主要存在于蔬菜中，如綠葉蔬菜，菠菜、羽衣甘藍(lán)、花椰菜和卷心菜，攝入后，維生素k1可增加腸道蠕動(dòng)和分泌功能，同時(shí),它還可影響一些激素的代謝，如延緩糖皮質(zhì)激素在肝中的分解。維生素k1主要作食品強(qiáng)化劑，多用于嬰幼兒食品，使用量在420～475μg/kg之間，它也作維生素類藥，用于維生素k1缺乏癥、凝血酶過低癥、新生兒自然出血癥的防治等。維生素k1溶于線粒體膜的類脂中，起電子轉(zhuǎn)移作用，可增加腸道蠕動(dòng)和分泌功能，還可影響一些激素的代謝，如延緩糖皮質(zhì)激素在肝中的分解，同時(shí)具有類似氫化可的松作用，長(zhǎng)期注射可增加甲狀腺的內(nèi)分泌活性等。

2、現(xiàn)有國(guó)標(biāo)液相色譜法測(cè)試技術(shù)是通過甲醇溶解后，使用含甲醇、四氫呋喃、冰醋酸、氯化鋅、乙酸鈉的流動(dòng)相，通過c18柱和鋅還原柱，在激發(fā)波長(zhǎng)為243nm，發(fā)射波長(zhǎng)為430nm的熒光檢測(cè)器下測(cè)定維生素k1的含量，以色譜峰的保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量，但該分析方法使用四氫呋喃，容易損壞儀器管路，降低儀器配件使用壽命，造成儀器故障。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供一種維生素k1及其異構(gòu)體檢測(cè)和含量測(cè)定方法，本發(fā)明控制液相色譜法的色譜條件，采用以甲醇為流動(dòng)相a，以水為流動(dòng)相b，摒棄了測(cè)試過程中鋅還原柱的使用步驟，進(jìn)而降低了流動(dòng)相配制的復(fù)雜程度，使該測(cè)試僅依靠甲醇水的等度洗脫即可實(shí)現(xiàn)vk1和cis-vk1的快速分離，有利于提高測(cè)試效率，降低了含強(qiáng)溶解性有機(jī)試劑的流動(dòng)相對(duì)儀器管路和色譜柱的損傷，具有廣泛的應(yīng)用前景。

2、本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用以下技術(shù)方案：

3、一種維生素k1及其異構(gòu)體檢測(cè)和含量測(cè)定方法，采用液相色譜法定性和/或定量檢測(cè)待測(cè)樣品中的維生素k1及其異構(gòu)體，所述液相色譜法的色譜條件為：色譜柱為三十烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱；柱溫為25~40℃；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器；以甲醇為流動(dòng)相a，以水為流動(dòng)相b進(jìn)行等度洗脫，流速為0.5ml/min~1.0ml/min；

4、維生素k1的異構(gòu)體為維生素k1順式異構(gòu)體。

5、本發(fā)明創(chuàng)造性的控制液相色譜法的色譜條件，采用以甲醇為流動(dòng)相a，以水為流動(dòng)相b，摒棄了測(cè)試過程中鋅還原柱的使用步驟，進(jìn)而降低了流動(dòng)相配制的復(fù)雜程度，使該測(cè)試僅依靠甲醇水的等度洗脫即可實(shí)現(xiàn)vk1和cis-vk1的快速分離，有利于提高測(cè)試效率，降低了含強(qiáng)溶解性有機(jī)試劑的流動(dòng)相對(duì)儀器管路和色譜柱的損傷，具有廣泛的應(yīng)用前景。

6、作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述色譜柱的規(guī)格為150mm×3.0mm×2.7μm，粒徑為2~3μm。

7、作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述等度洗脫時(shí)，甲醇和水的體積比為（90~99）：（1~10）。

8、作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述色譜條件還包括：進(jìn)樣量為5~20μl。

9、作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述色譜條件還包括：檢測(cè)波長(zhǎng)為220~280nm。

10、作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述待測(cè)樣品為合生元奶粉。

11、作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述液相色譜法定性和/或定量檢測(cè)具體為：

12、（1）將維生素k1與維生素k1順式異構(gòu)體用溶劑配制成對(duì)照品溶液，將對(duì)照品溶液用液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，得到色譜圖；

13、（2）將待測(cè)樣品制備成供試品溶液，將供試品液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，得到對(duì)比色譜圖；

14、（3）對(duì)比色譜圖與色譜圖進(jìn)行比對(duì)進(jìn)行定性分析；

15、（4）根據(jù)峰面積，采用面積歸一法定量計(jì)算維生素k1與維生素k1順式異構(gòu)體的含量。

16、其中面積歸一法計(jì)算方法具體為：

17、

18、其中：ω為樣品中vk1或cis-vk1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，單位為%；

19、ai為樣品各組分峰面積。

20、作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述對(duì)照品溶液中維生素k1的濃度為0.05~5μg/ml，所述對(duì)照品溶液中維生素k1順式異構(gòu)體的濃度為0.05~5μg/ml。

21、作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述供試品溶液的制備方法為：（1）準(zhǔn)確稱取經(jīng)均質(zhì)的試樣1g~5g于50ml離心管中，加入同位素內(nèi)標(biāo)使用液（1μg/ml）0.25ml，加入5ml溫水溶解(液體樣品直接吸取5ml，植物油不需加水稀釋)，加入磷酸鹽緩沖液（ph8.0）5ml，混勻，加入0.2g脂肪酶和0.2g淀粉酶（不含淀粉的樣品可以不加淀粉酶），加蓋，渦旋2min~3min，混勻后，置于35~39℃恒溫水浴振蕩器中振蕩2h以上，使其充分酶解；

22、（2）取出酶解好的試樣，分別加入10?ml?乙醇及1g碳酸鉀，混勻后加入10?ml?正己烷,渦旋提取10min，6000r/min離心3min，轉(zhuǎn)移上清液至另一50ml離心管中，向下層液再加入10ml正己烷，渦旋5min，6000r/min離心3min，合并上清液，正己烷定容至25ml，在上述提取液中加入20ml水，振搖0.5min，靜置分層后，分取5ml上清液于10ml的玻璃試管中，氮吹至干，加入1ml甲醇溶解，用0.22μm?濾膜過濾，得到供試品溶液。

23、作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述溶劑為甲醇、乙醇中的至少一種。

24、本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明控制液相色譜法的色譜條件，采用以甲醇為流動(dòng)相a，以水為流動(dòng)相b，摒棄了鋅還原柱這一色譜柱的使用，進(jìn)而降低了流動(dòng)相配制的復(fù)雜程度，使該測(cè)試僅依靠甲醇水的等度洗脫即可實(shí)現(xiàn)vk1和cis-vk1的快速分離，有利于提高測(cè)試效率，降低了含強(qiáng)溶解性有機(jī)試劑的流動(dòng)相對(duì)儀器管路和色譜柱的損傷，具有廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種維生素k1及其異構(gòu)體檢測(cè)和含量測(cè)定方法，其特征在于，采用液相色譜法定性和/或定量檢測(cè)待測(cè)樣品中的維生素k1及其異構(gòu)體，所述液相色譜法的色譜條件為：色譜柱為三十烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱；柱溫為25~40℃；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器；以甲醇為流動(dòng)相a，以水為流動(dòng)相b進(jìn)行等度洗脫，流速為0.5ml/min~1.0ml/min；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的維生素k1及其異構(gòu)體檢測(cè)和含量測(cè)定方法，其特征在于，所述色譜柱的規(guī)格為150mm×3.0mm×2.7μm，粒徑為2~3μm。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的維生素k1及其異構(gòu)體檢測(cè)和含量測(cè)定方法，其特征在于，所述等度洗脫時(shí)，甲醇和水的體積比為（90~99）：（1~10）。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的維生素k1及其異構(gòu)體檢測(cè)和含量測(cè)定方法，其特征在于，所述色譜條件還包括：進(jìn)樣量為5~20μl。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的維生素k1及其異構(gòu)體檢測(cè)和含量測(cè)定方法，其特征在于，所述色譜條件還包括：檢測(cè)波長(zhǎng)為220~280nm。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的維生素k1及其異構(gòu)體檢測(cè)和含量測(cè)定方法，其特征在于，所述待測(cè)樣品為合生元奶粉。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的維生素k1及其異構(gòu)體檢測(cè)和含量測(cè)定方法，其特征在于，所述液相色譜法定性和/或定量檢測(cè)具體為：

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的維生素k1及其異構(gòu)體檢測(cè)和含量測(cè)定方法，其特征在于，所述對(duì)照品溶液中維生素k1的濃度為0.05~5μg/ml，所述對(duì)照品溶液中維生素k1順式異構(gòu)體的濃度為0.05~5μg/ml。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的維生素k1及其異構(gòu)體檢測(cè)和含量測(cè)定方法，其特征在于，所述供試品溶液的制備方法為：

10.根據(jù)權(quán)利要求7~9任一所述的維生素k1及其異構(gòu)體檢測(cè)和含量測(cè)定方法，其特征在于，所述溶劑為甲醇、乙醇中的至少一種。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明具體公開了一種維生素K1及其異構(gòu)體檢測(cè)和含量測(cè)定方法，所述的維生素K1及其異構(gòu)體檢測(cè)和含量測(cè)定方法，采用液相色譜法定性和/或定量檢測(cè)待測(cè)樣品中的維生素K1及其異構(gòu)體，所述液相色譜法的色譜條件為：色譜柱為三十烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱；柱溫為25~40℃；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器；以甲醇為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B進(jìn)行等度洗脫。本發(fā)明采用以甲醇為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，降低了流動(dòng)相配制的復(fù)雜程度，使該測(cè)試僅依靠甲醇水的等度洗脫即可實(shí)現(xiàn)VK1和cis?VK1的快速分離，有利于提高測(cè)試效率，降低了含強(qiáng)溶解性有機(jī)試劑的流動(dòng)相對(duì)儀器管路和色譜柱的損傷，具有廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：曾偉杰,李國(guó)強(qiáng),李心悅,王世站,何澤
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣州太瑋生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6