本發(fā)明涉及一種利用牛乳檢測(cè)奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的方法。

背景技術(shù)：

乳品質(zhì)主要指乳蛋白率和乳脂率，是牛乳的重要經(jīng)濟(jì)指標(biāo)。優(yōu)良的牛乳具有較高的乳蛋白率和乳脂率，具有更好的乳品加工特性，因此市場(chǎng)價(jià)格也較高。在同樣的飼養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)環(huán)境下，不同品種奶牛和同一品種奶牛的不同個(gè)體所生產(chǎn)的原乳的乳蛋白率和乳脂率卻相差很大，乳腺合成乳蛋白、乳脂肪的能力是反映不同奶牛品種和個(gè)體乳腺的產(chǎn)乳品質(zhì)差異的重要指標(biāo)。乳腺合成乳蛋白、乳脂肪的能力由乳腺泌乳的基本單元乳腺上皮細(xì)胞中調(diào)控乳蛋白和乳脂肪合成的關(guān)鍵基因決定，乳腺細(xì)胞中這些基因表達(dá)的蛋白是重要的信號(hào)分子，能夠響應(yīng)奶牛機(jī)體刺激乳腺泌乳的氨基酸等營(yíng)養(yǎng)信號(hào)、催乳素和雌激素等激素信號(hào)、生長(zhǎng)因子等信號(hào)，調(diào)控乳蛋白和乳脂肪形成。這些功能基因表達(dá)的差異反映了乳腺上皮細(xì)胞合成乳蛋白、乳脂肪能力的差異。

因此篩選乳蛋白率和乳脂率高的奶牛品種和個(gè)體是奶牛營(yíng)養(yǎng)和遺傳育種的重要任務(wù)之一。目前尚沒(méi)有篩選乳蛋白率和乳脂率高的奶牛品種和個(gè)體的有效方法。通過(guò)檢測(cè)原乳的乳蛋白率和乳脂率可以部分反映奶牛品種和個(gè)體生產(chǎn)原乳品質(zhì)的差異，但由于乳蛋白率和乳脂率的差異除與乳腺的合成乳蛋白、乳脂肪等的能力有關(guān)外，還可能與泌乳量的不同、奶牛瘤胃微生物的代謝差異、肝臟生物轉(zhuǎn)化的差異、所取牛乳樣品的差異等有關(guān)，因此單純檢測(cè)原乳的乳蛋白率和乳脂率難以準(zhǔn)確和全面地反映不同奶牛品種和個(gè)體的乳腺的合成乳蛋白和乳脂肪的能力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)階段檢測(cè)原乳的乳蛋白率和乳脂率方法不能準(zhǔn)確和全面地反映不同奶牛品種和個(gè)體的乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的問(wèn)題，提供了一種利用牛乳檢測(cè)奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的方法。

本發(fā)明一種利用牛乳檢測(cè)奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的方法：一、牛乳的預(yù)處理：取牛乳于-80℃凍存?zhèn)溆?，得到牛乳樣品；二、牛乳外泌體的制備：將牛乳樣品于0-4℃、2000-2500rpm的條件下離心25-30min，去除沉淀的細(xì)胞和漂浮的脂肪球，得到脫脂乳；將脫脂乳于0-4℃、12000-13000rpm的條件下離心30-40min，取上清；將上清于0-4℃、100000-110000rpm的條件下離心2-2.5h，取沉淀；將沉淀用0.01-0.02m的pbs溶解，得到外泌體初次溶液；將外泌體初次溶液于0-4℃、100000-110000rpm的條件下離心2-2.5h，取沉淀，將沉淀用0.01-0.02m的pbs溶液溶解，得到外泌體溶液，檢測(cè)外泌體溶液純度，合格后進(jìn)行下一步操作；其中牛乳樣品與0.01-0.02m的pbs溶液的體積比為1:20；三、取外泌體溶液15-20μl用于westernblotting檢測(cè)；檢測(cè)蛋白為：glyrs和cap1，根據(jù)westernblotting的灰度掃描結(jié)果，利用image-proplus圖像分析軟件進(jìn)行分析，得到glyrs含量和cap1含量；四、奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力＝glyrs含量/cap1含量，glyrs含量/cap1含量＞0。

外泌體(exosome)是活細(xì)胞分泌的來(lái)源于晚期核內(nèi)體(也稱(chēng)為多囊泡體)的膜性囊泡，直徑約為30-150nm。外泌體可通過(guò)其攜帶的蛋白質(zhì)、核酸、脂類(lèi)等來(lái)調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生物學(xué)活性，已發(fā)現(xiàn)不同外泌體中共計(jì)4萬(wàn)多種蛋白質(zhì)、超3千種microrna、超3千種mrna。乳腺上皮細(xì)胞能夠分泌外泌體到乳中，甘氨酰trna合成酶(glyrs)和camp結(jié)合蛋白1(cap1)在乳外泌體中存在，且和乳腺上皮細(xì)胞中的水平正向相關(guān)。通過(guò)檢測(cè)乳中外泌體glyrs和cap1含量，結(jié)合對(duì)原乳的乳蛋白率和乳脂率的分析，可以反映乳腺合成乳蛋白和乳脂肪的能力。

目前外泌體提取最常用的方法是超速離心法，此種方法得到的外泌體量多，但是純度不足。本發(fā)明利用超速離心法制備乳中外泌體，并利用腫瘤易感性基因101(tumorsusceptibilitygene，tsg101)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulatedprotein78，grp78)、血管性血友病因子(vonwillebrandfactor，vwf)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，gapdh)進(jìn)行外泌體純度檢測(cè)。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了甘氨酰trna合成酶(glyrs)和camp結(jié)合蛋白1(cap1)分別是乳腺調(diào)控乳蛋白和乳脂肪合成的正向和負(fù)向關(guān)鍵調(diào)控因子。乳腺上皮細(xì)胞中g(shù)lyrs含量代表合成乳蛋白、乳脂肪能力，而cap1含量代表抑制合成乳蛋白、乳脂肪的能力。通過(guò)對(duì)乳腺上皮細(xì)胞中g(shù)lyrs、cap1等關(guān)鍵分子的檢測(cè)以評(píng)價(jià)乳腺合成乳蛋白和乳脂肪的功能，可以科學(xué)、準(zhǔn)確地反映奶牛乳腺的產(chǎn)乳品質(zhì)潛力。westernblotting檢測(cè)glyrs和cap1含量，建立了奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的計(jì)算方法：glyrs含量/cap1含量；本方法利用glyrs含量/cap1含量的比值，避免了乳中外泌體純度不足和制備量對(duì)結(jié)果的影響，將乳指標(biāo)和乳腺基因表達(dá)能力結(jié)合在一起，全面反映了不同奶牛品種和個(gè)體合成乳蛋白和乳脂肪的能力。通過(guò)試驗(yàn)可知，對(duì)乳腺上皮細(xì)胞中g(shù)lyrs和cap1關(guān)鍵分子的檢測(cè)以評(píng)價(jià)乳腺合成乳蛋白和乳脂肪的功能，glyrs含量/cap1含量可以反映乳腺合成乳蛋白和乳脂肪的能力，同時(shí)可以排除泌乳量的不同、奶牛瘤胃微生物的代謝差異、肝臟生物轉(zhuǎn)化的差異、所取牛乳樣品的差異等因素的影響。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中westernblotting檢測(cè)外泌體溶液純度結(jié)果圖；a為細(xì)胞裂解液；b為細(xì)胞培養(yǎng)液上清；c為制備的牛乳外泌體；

圖2為實(shí)施例1中westernblotting檢測(cè)飼喂秸稈型粗飼料奶牛和苜蓿型粗飼料奶牛外泌體中g(shù)lyrs和cap1含量的結(jié)果圖；a為細(xì)胞裂解液；d為飼喂秸稈型粗飼料奶牛外泌體；e為苜蓿型粗飼料奶牛外泌體；

圖3為實(shí)施例1中飼喂秸稈型粗飼料奶牛和苜蓿型粗飼料奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力示意圖；其中f為飼喂秸稈型粗飼料奶牛，g為飼喂苜蓿型粗飼料奶牛；

圖4為實(shí)施例1中利用乳成分分析儀檢測(cè)飼喂秸稈型粗飼料奶牛和苜蓿型粗飼料奶牛乳蛋白率的結(jié)果示意圖；其中f為飼喂秸稈型粗飼料奶牛，g為飼喂苜蓿型粗飼料奶牛；

圖5為實(shí)施例1中利用乳成分分析儀檢測(cè)飼喂秸稈型粗飼料奶牛和苜蓿型粗飼料奶牛乳脂率結(jié)果示意圖；其中f為飼喂秸稈型粗飼料奶牛，g為飼喂苜蓿型粗飼料奶牛。

具體實(shí)施方式

具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式一種利用牛乳檢測(cè)奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的方法：一、牛乳的預(yù)處理：取牛乳于-80℃凍存?zhèn)溆茫玫脚Ｈ闃悠罚欢?、牛乳外泌體的制備：將牛乳樣品于0-4℃、2000-2500rpm的條件下離心25-30min，去除沉淀的細(xì)胞和漂浮的脂肪球，得到脫脂乳；將脫脂乳于0-4℃、12000-13000rpm的條件下離心30-40min，取上清；將上清于0-4℃、100000-110000rpm的條件下離心2-2.5h，取沉淀；將沉淀用0.01-0.02m的pbs溶解，得到外泌體初次溶液；將外泌體初次溶液于0-4℃、

100000-110000rpm的條件下離心2-2.5h，取沉淀，將沉淀用0.01-0.02m的pbs溶液溶解，得到外泌體溶液，檢測(cè)外泌體溶液純度，合格后進(jìn)行下一步操作；其中牛乳樣品與0.01-0.02m的pbs溶液的體積比為1:20；三、取外泌體溶液15-20μl用于westernblotting檢測(cè)；檢測(cè)蛋白為：glyrs和cap1，根據(jù)westernblotting的灰度掃描結(jié)果，利用image-proplus圖像分析軟件進(jìn)行分析，得到glyrs含量和cap1含量；四、奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力＝glyrs含量/cap1含量，glyrs含量/cap1含量＞0。

外泌體(exosome)是活細(xì)胞分泌的來(lái)源于晚期核內(nèi)體(也稱(chēng)為多囊泡體)的膜性囊泡，直徑約為30-150nm。外泌體可通過(guò)其攜帶的蛋白質(zhì)、核酸、脂類(lèi)等來(lái)調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生物學(xué)活性，已發(fā)現(xiàn)不同外泌體中共計(jì)4萬(wàn)多種蛋白質(zhì)、超3千種microrna、超3千種mrna。乳腺上皮細(xì)胞能夠分泌外泌體到乳中，甘氨酰trna合成酶(glyrs)和camp結(jié)合蛋白1(cap1)在乳外泌體中存在，且和乳腺上皮細(xì)胞中的水平正向相關(guān)。通過(guò)檢測(cè)乳中外泌體glyrs和cap1含量，結(jié)合對(duì)原乳的乳蛋白率和乳脂率的分析，可以反映乳腺合成乳蛋白和乳脂肪的能力。

目前外泌體提取最常用的方法是超速離心法，此種方法得到的外泌體量多，但是純度不足。本發(fā)明利用超速離心法制備乳中外泌體，并利用腫瘤易感性基因101(tumorsusceptibilitygene，tsg101)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulatedprotein78，grp78)、血管性血友病因子(vonwillebrandfactor，vwf)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，gapdh)進(jìn)行外泌體純度檢測(cè)。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了甘氨酰trna合成酶(glyrs)和camp結(jié)合蛋白1(cap1)分別是乳腺調(diào)控乳蛋白和乳脂肪合成的正向和負(fù)向關(guān)鍵調(diào)控因子。乳腺上皮細(xì)胞中g(shù)lyrs含量代表合成乳蛋白、乳脂肪能力，而cap1含量代表抑制合成乳蛋白、乳脂肪的能力。通過(guò)檢測(cè)原乳的乳蛋白率和乳脂率，進(jìn)一步結(jié)合對(duì)乳腺上皮細(xì)胞中g(shù)lyrs、cap1等關(guān)鍵分子的檢測(cè)以綜合評(píng)價(jià)乳腺合成乳蛋白和乳脂肪的功能，可以科學(xué)、準(zhǔn)確地反映奶牛乳腺的產(chǎn)乳品質(zhì)潛力。westernblotting檢測(cè)glyrs和cap1含量，建立了奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的計(jì)算方法：glyrs含量/cap1含量；本方法利用glyrs含量/cap1含量的比值，避免了乳中外泌體純度不足和制備量對(duì)結(jié)果的影響，將乳指標(biāo)和乳腺基因表達(dá)能力結(jié)合在一起，全面反映了不同奶牛品種和個(gè)體合成乳蛋白和乳脂肪的能力。通過(guò)試驗(yàn)可知，對(duì)乳腺上皮細(xì)胞中g(shù)lyrs和cap1關(guān)鍵分子的檢測(cè)以評(píng)價(jià)乳腺合成乳蛋白和乳脂肪的功能，glyrs含量/cap1含量可以反映乳腺合成乳蛋白和乳脂肪的能力，同時(shí)可以排除泌乳量的不同、奶牛瘤胃微生物的代謝差異、肝臟生物轉(zhuǎn)化的差異、所取牛乳樣品的差異等因素的影響。

本實(shí)施方式westernblotting檢測(cè)glyrs和cap1含量的步驟為：

一、樣品的制備：取外泌體溶液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，加入2×上樣緩沖液或5×上樣緩沖液，然后進(jìn)行沸水浴10min；將細(xì)胞裂解液進(jìn)行超聲破碎3次，每次15s；分裝，于-80℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆茫?/p>

二、分離膠的制備：制備10％的分離膠溶液，temed加入到分離膠溶液后混勻并注入至兩個(gè)玻璃板之間，用膠7ml，用200ul移液槍加水以隔絕空氣，并使膠面平整，靜置20min后，倒掉上層水，用濾紙吸干；

三、濃縮膠的制備：制備5％的濃縮膠溶液，temed加入后混勻注入玻璃板之間，將齒梳插入至玻璃板間的溶液中，在室溫下將凝膠垂直放置在水平桌面上，50min后濃縮膠聚合，將齒梳勻力拔出，得凝膠板；

四、上樣：將制備好的凝膠板垂直固定到電泳槽中，上樣，彩色預(yù)染marker上樣量為5μl/孔，樣品上樣量為20μl/孔，并用上樣緩沖液將空點(diǎn)樣孔補(bǔ)齊；

五、電泳：4℃環(huán)境下接通電源，濃縮膠在80v恒壓下電泳，25min后調(diào)節(jié)電壓至120v，繼續(xù)電泳，待溴酚藍(lán)遷移至分離膠底部時(shí)停止電泳，取出凝膠；

六、轉(zhuǎn)膜：使用濕轉(zhuǎn)電泳儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，由正極至負(fù)極的順序?yàn)椋簽V膜、nc膜、凝膠、濾膜，趕盡每層之間的氣泡，依蛋白大小和膜面積不同確定轉(zhuǎn)膜時(shí)間；

七、染色：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用1×麗春紅s染轉(zhuǎn)有目的蛋白的nc膜1min，然后用去離子水沖洗，檢驗(yàn)被染為紅色的蛋白條帶，比對(duì)蛋白marker剪下目的條帶所在范圍膜，并將所剪下含目的蛋白的nc膜放入1×tbs/t中進(jìn)行清洗至膜上看不出有麗春紅為止；

八、抗體結(jié)合：將nc膜放入5％脫脂乳趕盡氣泡，37℃搖床封閉1.5h，然后放入配好的含一抗的5％脫脂乳溶液中，4℃搖床過(guò)夜，取出nc膜，于1×tbs/t中進(jìn)行清洗，3次，每次5min，將nc膜放入含二抗的5％脫脂乳溶液中，37℃搖床中搖1h，取出nc膜，于1×tbs/t中進(jìn)行清洗，3次，每次5min；其中用于曝光：按照1:1比例混合化學(xué)發(fā)光液a液與b液，利用化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行曝光；

九、灰度掃描：利用image-proplus圖像分析軟件對(duì)westernblotting目的條帶進(jìn)行灰度值分析。

具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一不同的是：采用westernblotting檢測(cè)外泌體溶液純度。其他與具體實(shí)施方式一相同。

本實(shí)施方式westernblotting檢測(cè)外泌體溶液純度的步驟為：

一、樣品的制備：取外泌體溶液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，加入2×上樣緩沖液或5×上樣緩沖液，然后進(jìn)行沸水浴10min；將細(xì)胞裂解液進(jìn)行超聲破碎3次，每次15s；分裝，于-80℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆茫?/p>

二、分離膠的制備：制備10％的分離膠溶液，temed加入到分離膠溶液后混勻并注入至兩個(gè)玻璃板之間，用膠7ml，用200ul移液槍加水以隔絕空氣，并使膠面平整，靜置20min后，倒掉上層水，用濾紙吸干；

三、濃縮膠的制備：制備5％的濃縮膠溶液，temed加入后混勻注入玻璃板之間，將齒梳插入至玻璃板間的溶液中，在室溫下將凝膠垂直放置在水平桌面上，50min后濃縮膠聚合，將齒梳勻力拔出，得凝膠板；

四、上樣：將制備好的凝膠板垂直固定到電泳槽中，上樣，彩色預(yù)染marker上樣量為5μl/孔，樣品上樣量為20μl/孔，并用上樣緩沖液將空點(diǎn)樣孔補(bǔ)齊；

五、電泳：4℃環(huán)境下接通電源，濃縮膠在80v恒壓下電泳，25min后調(diào)節(jié)電壓至120v，繼續(xù)電泳，待溴酚藍(lán)遷移至分離膠底部時(shí)停止電泳，取出凝膠；

六、轉(zhuǎn)膜：使用濕轉(zhuǎn)電泳儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，由正極至負(fù)極的順序?yàn)椋簽V膜、nc膜、凝膠、濾膜，趕盡每層之間的氣泡，依蛋白大小和膜面積不同確定轉(zhuǎn)膜時(shí)間；

七、染色：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用1×麗春紅s染轉(zhuǎn)有目的蛋白的nc膜1min，然后用去離子水沖洗，檢驗(yàn)被染為紅色的蛋白條帶，比對(duì)蛋白marker剪下目的條帶所在范圍膜，并將所剪下含目的蛋白的nc膜放入1×tbs/t中進(jìn)行清洗至膜上看不出有麗春紅為止；

八、抗體結(jié)合：將nc膜放入5％脫脂乳趕盡氣泡，37℃搖床封閉1.5h，然后放入配好的含一抗的5％脫脂乳溶液中，4℃搖床過(guò)夜，取出nc膜，于1×tbs/t中進(jìn)行清洗，3次，每次5min，將nc膜放入含二抗的5％脫脂乳溶液中，37℃搖床中搖1h，取出nc膜，于1×tbs/t中進(jìn)行清洗，3次，每次5min；其中用于曝光：按照1:1比例混合化學(xué)發(fā)光液a液與b液，利用化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行曝光；

九、灰度掃描：利用image-proplus圖像分析軟件對(duì)westernblotting目的條帶進(jìn)行灰度值分析。

具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一或二不同的是：用于外泌體純度檢測(cè)的蛋白有：tsg101、grp78、vwf和gapdh。其他與具體實(shí)施方式一或二不同。

具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至三之一不同的是：westernblotting檢測(cè)外泌體溶液純度中所用的一抗為：anti-tsg101，anti-grp78，anti-vwf和anti-gapdh；二抗為hrp標(biāo)記山羊抗兔、hrp標(biāo)記山羊抗鼠或hrp標(biāo)記兔抗山羊igg。其他與具體實(shí)施方式一至三之一相同。

具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至四之一不同的是：westernblotting檢測(cè)奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力所用一抗為：anti-glyrs和anti-cap1；二抗為hrp標(biāo)記山羊抗兔、hrp標(biāo)記山羊抗鼠或hrp標(biāo)記兔抗山羊igg。其他與具體實(shí)施方式一至四之一相同。

為驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)：

實(shí)施例一：本實(shí)施例一種利用牛乳檢測(cè)奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的方法：一、牛乳的預(yù)處理：取牛乳于-80℃凍存?zhèn)溆茫玫脚Ｈ闃悠?；二、牛乳外泌體的制備：將牛乳樣品于4℃、2000rpm的條件下離心30min，去除沉淀的細(xì)胞和漂浮的脂肪球，得到脫脂乳；將脫脂乳于4℃、12000rpm的條件下離心30min，取上清；將上清于4℃、110000rpm的條件下離心2h，取沉淀；將沉淀用0.01m的pbs溶解，得到外泌體初次溶液；將外泌體初次溶液于4℃、110000rpm的條件下離心2h，取沉淀，將沉淀用0.01m的pbs溶液溶解，得到外泌體溶液，檢測(cè)外泌體溶液純度，合格后進(jìn)行下一步操作；其中牛乳樣品與0.01m的pbs溶液的體積比為1:20；三、取外泌體溶液20μl用于westernblotting檢測(cè)；檢測(cè)蛋白為：glyrs和cap1，根據(jù)westernblotting的灰度掃描結(jié)果，利用image-proplus圖像分析軟件進(jìn)行分析，得到glyrs含量和cap1含量；四、奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力＝glyrs含量/cap1含量，glyrs含量/cap1含量＞0。

本實(shí)施例westernblotting檢測(cè)glyrs和cap1含量的步驟為：

一、樣品的制備：取外泌體溶液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，加入2×上樣緩沖液或5×上樣緩沖液，然后進(jìn)行沸水浴10min；將細(xì)胞裂解液進(jìn)行超聲破碎3次，每次15s；分裝，于-80℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆茫?/p>

二、分離膠的制備：制備10％的分離膠溶液，temed加入到分離膠溶液后混勻并注入至兩個(gè)玻璃板之間，用膠7ml，用200ul移液槍加水以隔絕空氣，并使膠面平整，靜置20min后，倒掉上層水，用濾紙吸干；

三、濃縮膠的制備：制備5％的濃縮膠溶液，temed加入后混勻注入玻璃板之間，將齒梳插入至玻璃板間的溶液中，在室溫下將凝膠垂直放置在水平桌面上，50min后濃縮膠聚合，將齒梳勻力拔出，得凝膠板；

四、上樣：將制備好的凝膠板垂直固定到電泳槽中，上樣，彩色預(yù)染marker上樣量為5μl/孔，樣品上樣量為20μl/孔，并用上樣緩沖液將空點(diǎn)樣孔補(bǔ)齊；

五、電泳：4℃環(huán)境下接通電源，濃縮膠在80v恒壓下電泳，25min后調(diào)節(jié)電壓至120v，繼續(xù)電泳，待溴酚藍(lán)遷移至分離膠底部時(shí)停止電泳，取出凝膠；

六、轉(zhuǎn)膜：使用濕轉(zhuǎn)電泳儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，由正極至負(fù)極的順序?yàn)椋簽V膜、nc膜、凝膠、濾膜，趕盡每層之間的氣泡，依蛋白大小和膜面積不同確定轉(zhuǎn)膜時(shí)間；

七、染色：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用1×麗春紅s染轉(zhuǎn)有目的蛋白的nc膜1min，然后用去離子水沖洗，檢驗(yàn)被染為紅色的蛋白條帶，比對(duì)蛋白marker剪下目的條帶所在范圍膜，并將所剪下含目的蛋白的nc膜放入1×tbs/t中進(jìn)行清洗至膜上看不出有麗春紅為止；

八、抗體結(jié)合：將nc膜放入5％脫脂乳趕盡氣泡，37℃搖床封閉1.5h，然后放入配好的含一抗的5％脫脂乳溶液中，4℃搖床過(guò)夜，取出nc膜，于1×tbs/t中進(jìn)行清洗，3次，每次5min，將nc膜放入含二抗的5％脫脂乳溶液中，37℃搖床中搖1h，取出nc膜，于1×tbs/t中進(jìn)行清洗，3次，每次5min；其中用于曝光：按照1:1比例混合化學(xué)發(fā)光液a液與b液，利用化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行曝光；所用一抗為：anti-glyrs和anti-cap1；二抗為hrp標(biāo)記山羊抗兔；

九、灰度掃描：利用image-proplus圖像分析軟件對(duì)westernblotting目的條帶進(jìn)行灰度值分析。

本實(shí)施例westernblotting檢測(cè)外泌體溶液純度的步驟為：

一、樣品的制備：取外泌體溶液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，加入2×上樣緩沖液或5×上樣緩沖液，然后進(jìn)行沸水浴10min；將細(xì)胞裂解液進(jìn)行超聲破碎3次，每次15s；分裝，于-80℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆茫?/p>

二、分離膠的制備：制備10％的分離膠溶液，temed加入到分離膠溶液后混勻并注入至兩個(gè)玻璃板之間，用膠7ml，用200ul移液槍加水以隔絕空氣，并使膠面平整，靜置20min后，倒掉上層水，用濾紙吸干；

三、濃縮膠的制備：制備5％的濃縮膠溶液，temed加入后混勻注入玻璃板之間，將齒梳插入至玻璃板間的溶液中，在室溫下將凝膠垂直放置在水平桌面上，50min后濃縮膠聚合，將齒梳勻力拔出，得凝膠板；

四、上樣：將制備好的凝膠板垂直固定到電泳槽中，上樣，彩色預(yù)染marker上樣量為5μl/孔，樣品上樣量為20μl/孔，并用上樣緩沖液將空點(diǎn)樣孔補(bǔ)齊；

五、電泳：4℃環(huán)境下接通電源，濃縮膠在80v恒壓下電泳，25min后調(diào)節(jié)電壓至120v，繼續(xù)電泳，待溴酚藍(lán)遷移至分離膠底部時(shí)停止電泳，取出凝膠；

六、轉(zhuǎn)膜：使用濕轉(zhuǎn)電泳儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，由正極至負(fù)極的順序?yàn)椋簽V膜、nc膜、凝膠、濾膜，趕盡每層之間的氣泡，依蛋白大小和膜面積不同確定轉(zhuǎn)膜時(shí)間；

七、染色：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用1×麗春紅s染轉(zhuǎn)有目的蛋白的nc膜1min，然后用去離子水沖洗，檢驗(yàn)被染為紅色的蛋白條帶，比對(duì)蛋白marker剪下目的條帶所在范圍膜，并將所剪下含目的蛋白的nc膜放入1×tbs/t中進(jìn)行清洗至膜上看不出有麗春紅為止；

八、抗體結(jié)合：將nc膜放入5％脫脂乳趕盡氣泡，37℃搖床封閉1.5h，然后放入配好的含一抗的5％脫脂乳溶液中，4℃搖床過(guò)夜，取出nc膜，于1×tbs/t中進(jìn)行清洗，3次，每次5min，將nc膜放入含二抗的5％脫脂乳溶液中，37℃搖床中搖1h，取出nc膜，于1×tbs/t中進(jìn)行清洗，3次，每次5min；其中用于曝光：按照1:1比例混合化學(xué)發(fā)光液a液與b液，利用化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行曝光；

九、灰度掃描：利用image-proplus圖像分析軟件對(duì)westernblotting目的條帶進(jìn)行灰度值分析。外泌體純度檢測(cè)的蛋白有：tsg101、grp78、vwf和gapdh。所用的一抗為：anti-tsg101，anti-grp78，anti-vwf和anti-gapdh；二抗為hrp標(biāo)記山羊抗兔。

westernblotting檢測(cè)外泌體溶液純度結(jié)果如圖1所示，由圖1可知tsg101蛋白呈陽(yáng)性結(jié)果說(shuō)明所得產(chǎn)物含有外泌體成分；而grp78呈陰性結(jié)果說(shuō)明所得產(chǎn)物不含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)成分；vwf呈陰性結(jié)果說(shuō)明所得產(chǎn)物不含有高爾基體成分；gapdh呈陰性結(jié)果說(shuō)明所得產(chǎn)物不含有胞漿蛋白成分，結(jié)果表明制備的外泌體未有其它細(xì)胞成分污染。

利用本實(shí)施例的方法分別檢測(cè)飼喂秸稈型粗飼料奶牛和苜蓿型粗飼料奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力，westernblotting檢測(cè)glyrs和cap1含量的結(jié)果如圖2所示，由圖2可知秸稈型粗飼料奶牛乳中外泌體中g(shù)lyrs含量同苜蓿型粗飼料奶牛乳中外泌體相比顯著降低，而cap1含量則顯著高于苜蓿型粗飼料奶牛乳中外泌體的含量。用image-proplus圖像分析軟件對(duì)圖2進(jìn)行分析，結(jié)果為飼喂秸稈型粗飼料奶牛的glyrs含量為0.376，cap1含量為1.648，比值為0.228；苜蓿型粗飼料奶牛的glyrs含量為1.025，cap1含量為0.843，比值為1.216(圖3)。

利用乳成分分析儀檢測(cè)飼喂秸稈型粗飼料奶牛和苜蓿型粗飼料奶牛乳蛋白率和乳脂率，結(jié)果如圖4和圖5所示，由圖4和圖5可知飼喂秸稈型粗飼料奶牛的乳蛋白率(2.827％)和乳脂率(3.187％)顯著低于苜蓿型粗飼料奶牛的乳蛋白率(3.256％)和乳脂率(3.564％)。和本發(fā)明方法作對(duì)比，本發(fā)明方法以奶牛乳外泌體中g(shù)lyrs含量/cap1含量代表乳腺的合成乳蛋白和乳脂肪的能力與檢測(cè)奶牛的乳蛋白率和乳脂率是一致的，說(shuō)明通過(guò)對(duì)乳腺上皮細(xì)胞中g(shù)lyrs和cap1關(guān)鍵分子的檢測(cè)以評(píng)價(jià)乳腺合成乳蛋白和乳脂肪的功能，glyrs含量/cap1含量可以反映乳腺合成乳蛋白和乳脂肪的能力，同時(shí)可以排除泌乳量的不同、奶牛瘤胃微生物的代謝差異、肝臟生物轉(zhuǎn)化的差異、所取牛乳樣品的差異等因素的影響。