本發(fā)明屬于焦性沒食子酸檢測領(lǐng)域，特別涉及一種檢測焦性沒食子酸的比率熒光探針及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

焦性沒食子酸是一類酚類物質(zhì)，常作為抗氧化劑或氧清除劑使用。然而，焦性沒食子酸具有類似于苯酚的毒性，對(duì)皮膚、眼睛、粘膜有強(qiáng)烈的刺激作用，且對(duì)水生生物有害，可能對(duì)水體環(huán)境產(chǎn)生長期不良影響，可能有不可逆后果的危險(xiǎn)。雖然現(xiàn)有的分析技術(shù)展現(xiàn)出好的選擇性和靈敏度，但是要求貴重設(shè)備和檢測過程復(fù)雜等缺點(diǎn)。因此，需要建立一種簡便的檢測方法檢測焦性沒食子酸。

比率熒光分析提供了一種可視化和精確的分析結(jié)果。teng等人建立了基于比率熒光探針的多巴胺檢測方法(yeteng,xiaofangjia,jingli,anderkangwang，analyticalchemistry，2015，87，4897–4902)。多巴胺的酶催化氧化產(chǎn)物能夠使金納米簇?zé)晒忖?，且可以發(fā)出藍(lán)光，能夠精確的檢測多巴胺。zhang等人制備了基于cdte量子點(diǎn)的比率熒光探針，并成功的應(yīng)用檢測tnt(kuizhang,haibozhou,qingsongmei,suhuawang,guijianguan,renyongliu,jianzhang,andzhongpingzhang，2011,133,8424–8427)。

不過目前現(xiàn)有技術(shù)尚未構(gòu)建出具有高精度檢測性能的焦性沒食子酸比率熒光探針。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，旨在提供一種檢測焦性沒食子酸的比率熒光探針的制備方法。

本發(fā)明所述的制備方法，包括以下步驟：

1)藍(lán)色熒光碳量子點(diǎn)合成：將檸檬酸和氨水溶解于去離子水，形成前軀體溶液，對(duì)前軀體溶液進(jìn)行高溫處理，降至室溫后離心分離，取上清液，備用；

2)包埋碳量子點(diǎn)的氧化硅納米粒子合成：將環(huán)己烷、tritonx-100、正己醇混合，攪拌至少1h，形成微乳液；取步驟1)溶液分散于上述微乳液，攪拌至少0.5h；然后，加入氨水和teos，攪拌24h，再加入aptes，繼續(xù)攪拌24h；對(duì)反應(yīng)液離心、洗滌，得到包埋碳量子點(diǎn)的氧化硅納米粒子；

3)紅色熒光谷胱甘肽修飾的碲化鎘量子點(diǎn)合成：在氮?dú)獗Ｗo(hù)和冰浴條件下，將碲粉和nabh4溶解于去離子水，攪拌反應(yīng)，形成nahte溶液；將cdcl2·2.5h2o和谷胱甘肽溶解于去離子水，調(diào)節(jié)ph至堿性，然后加入nahte溶液，進(jìn)行攪拌并加熱回流1-3h；反應(yīng)完畢后，將得到的溶液除雜，得到紅色熒光谷胱甘肽修飾的碲化鎘量子點(diǎn)；

4)比率熒光探針的制備：將步驟2)所得物和步驟3)所得物分散于mes緩沖液；然后，加入edc和nhs，進(jìn)行暗反應(yīng)并攪拌；反應(yīng)完畢后，離心并用去離子水多次清洗，得到所述探針。

優(yōu)選的，步驟1)中，所述高溫為200℃，處理時(shí)間為5h。

優(yōu)選的，步驟2)中，環(huán)己烷、tritonx-100和正己醇的體積比為50:10:8；和/或，氨水和teos的體積比為1:0.35。

優(yōu)選的，步驟2)中，加入步驟1)所得溶液時(shí)，還同時(shí)加入殼聚糖溶液，所述步驟1)所得溶液和殼聚糖溶液的體積比為5:1；優(yōu)選的，所述殼聚糖溶液在1％醋酸中的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.5％。

優(yōu)選的，步驟3)中，碲粉與nabh4的質(zhì)量比為3.19:6；和/或，cdcl2·2.5h2o和谷胱甘肽的質(zhì)量比為11.42:38.41。

優(yōu)選的，步驟3)中，調(diào)節(jié)ph＝9；和/或，加入nahte溶液后，cd²⁺、te^2-和gsh的摩爾比為1.0:0.5:2.5。

優(yōu)選的，步驟4)中，步驟2)所得物和步驟3)所得物的添加比例關(guān)系為20mg·步驟2)所得物/ml·步驟3)所得物。

通過理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)探索，探針中碲化鎘量子點(diǎn)可以被焦性沒食子酸的催化氧化產(chǎn)物破壞，產(chǎn)生熒光猝滅，碳量子點(diǎn)由于有二氧化硅的保護(hù)，熒光保持穩(wěn)定。

本發(fā)明所稱的比率熒光探針，由包埋碳量子點(diǎn)的氧化硅納米粒子共價(jià)偶聯(lián)紅色碲化鎘量子點(diǎn)所形成的比率熒光探針。

本發(fā)明的另外一個(gè)目的在于提供由上述方法制備得到的檢測焦性沒食子酸的比率熒光探針。

本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供利用上述所得比率熒光探針在檢測焦性沒食子酸的應(yīng)用，所述應(yīng)用的方法為：向待測樣品中加入所得比率熒光探針和酶溶液，混勻，反應(yīng)后利用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測。所述酶溶液中的酶包括漆酶、酪氨酸酶或辣根過氧化物酶。

本發(fā)明的有益效果：

1)相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有良好的選擇性和可視化效果，線性范圍為0.05到2.0μm，最低檢測限為0.042μm。

2)本發(fā)明探針操作簡單，無需復(fù)雜設(shè)備。

附圖說明

圖1：圖中，a和b為cqds@sio2的透射電鏡圖,c和d為cqds@sio2@cdteqds的透射電鏡圖；e和f為cqds@sio2@cdteqds的掃描電鏡圖。

圖2：圖中，左圖為碲化鎘量子點(diǎn)(cdteqds)ⅰ、包硅的碳量子點(diǎn)(cqds＠sio2)ⅱ和本發(fā)明發(fā)明探針溶液ⅲ在紫外燈下的效果圖；右圖為碲化鎘量子點(diǎn)(cdteqds)ⅰ、包硅的碳量子點(diǎn)(cqds＠sio2)ⅱ和發(fā)明探針溶液ⅲ的熒光發(fā)射光譜圖，其中wavelength意為“波長”，fluorescenceintensity意為“熒光強(qiáng)度”；其中，右圖中，ⅰ中的顏色為紅色，ⅱ中的顏色為藍(lán)色，ⅲ中的顏色為粉紅色；

圖3：圖中，(a)本發(fā)明探針在不同焦性沒食子酸濃度下的熒光圖譜(λex＝365nm)；(b)為(i433/i629)0/(i433/i629)與焦性沒食子酸濃度的線性結(jié)果圖；

圖4：本發(fā)明探針對(duì)不同干擾物的熒光檢測結(jié)果；

圖5：是否添加酶溶液對(duì)于檢測效果的影響結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要在此指出的是以下實(shí)施例只是用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員根據(jù)上述發(fā)明內(nèi)容所做出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

1)藍(lán)色熒光碳量子點(diǎn)合成：將檸檬酸和氨水溶解于去離子水，形成前軀體溶液，對(duì)前軀體溶液進(jìn)行高溫處理，降至室溫后離心分離，取上清液，備用；

2)包埋碳量子點(diǎn)的氧化硅納米粒子合成：將環(huán)己烷、tritonx-100、正己醇混合，攪拌至少1h，形成微乳液；取步驟1)溶液分散于上述微乳液，攪拌至少0.5h；然后，加入氨水和teos，攪拌24h，再加入aptes，繼續(xù)攪拌24h；對(duì)反應(yīng)液離心、洗滌，得到包埋碳量子點(diǎn)的氧化硅納米粒子；

3)紅色熒光谷胱甘肽修飾的碲化鎘量子點(diǎn)合成：在氮?dú)獗Ｗo(hù)和冰浴條件下，將碲粉和nabh4溶解于去離子水，攪拌反應(yīng)，形成nahte溶液；將cdcl2·2.5h2o和谷胱甘肽溶解于去離子水，調(diào)節(jié)ph至堿性，然后加入nahte溶液，進(jìn)行攪拌并加熱回流1-3h；反應(yīng)完畢后，將得到的溶液除雜，得到紅色熒光谷胱甘肽修飾的碲化鎘量子點(diǎn)；

4)比率熒光探針的制備：將步驟2)所得物和步驟3)所得物分散于mes緩沖液；然后，加入edc和nhs，進(jìn)行暗反應(yīng)并攪拌；反應(yīng)完畢后，離心并用去離子水多次清洗，得到所述探針。

步驟1)中，所述高溫為200℃，處理時(shí)間為5h。

步驟2)中，環(huán)己烷、tritonx-100和正己醇的體積比為50:10:8；和/或，氨水和teos的體積比為1:0.35。

步驟3)中，碲粉與nabh4的質(zhì)量比為3.19:6；cdcl2·2.5h2o和谷胱甘肽的質(zhì)量比為11.42:38.41。

步驟3)中，調(diào)節(jié)ph＝9；加入nahte溶液后，cd²⁺、te^2-和gsh的摩爾比為1.0:0.5:2.5。

步驟4)中，步驟2)所得物和步驟3)所得物的添加比例關(guān)系為20mg·步驟2)所得物/ml·步驟3)所得物。

如圖1可知，本實(shí)施例成功的合成了比率熒光探針。

實(shí)施例2

步驟2)中，加入步驟1)所得溶液時(shí)，還同時(shí)加入殼聚糖溶液，所述步驟1)所得溶液和殼聚糖溶液的體積比為5:1；所述殼聚糖溶液在1％醋酸中的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.5％。其余與實(shí)施例1一致。

實(shí)驗(yàn)例1

焦性沒食子酸檢測：

將實(shí)施例1所述的探針分散在緩沖液，取多組反應(yīng)試管，分別加入適當(dāng)體積的探針溶液及已知濃度的焦性沒食子酸溶液和漆酶，混勻，反應(yīng)一段時(shí)間。將反應(yīng)液加入石英皿，用熒光分光光度法進(jìn)行檢測(λex＝365nm)。根據(jù)測試結(jié)果計(jì)算出工作曲線。如圖3所示，探針對(duì)焦性沒食子酸的響應(yīng)范圍為0.05-2μm，檢測結(jié)果的線性系數(shù)為0.993。

對(duì)于未知樣品，先進(jìn)行樣品預(yù)處理，得到未知濃度的焦性沒食子酸溶液。取相同體積的探針溶液和漆酶，加入樣品溶液，混勻，反應(yīng)一段時(shí)間。將反應(yīng)液加入石英皿，用熒光分光光度法進(jìn)行檢測(λex＝365nm)。將所得值代入上述得到的線性方程中，計(jì)算出未知焦性沒食子酸溶液的濃度，從而達(dá)到檢測焦性沒食子酸的目的。

為檢測本發(fā)明探針對(duì)焦性沒食子酸的檢測專一性，將干擾物與探針混合反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4，探針表現(xiàn)出良好的選擇性。

實(shí)驗(yàn)例2

將本發(fā)明探針實(shí)際水體中焦性沒食子酸檢測，檢測結(jié)果如表1。取河水中上層澄清液，然后加入適量的edta，使河水中大量鈣、鎂離子絡(luò)合，通過過濾除去鈣，鎂離子。在處理后的水樣中分別加入不同濃度的焦性沒食子酸，再加入比率熒光探針和漆酶，反應(yīng)一段時(shí)間。在熒光分析儀上分析其熒光強(qiáng)度，通關(guān)線性方程計(jì)算其焦性沒食子酸濃度。

表1

^a樣品取自雅安自來水

^b樣品取自雅安濆江

實(shí)驗(yàn)例3

除了不添加漆酶之外，其余與實(shí)驗(yàn)例1一致。如圖5所示，將焦性沒食子酸和比率探針混合，在漆酶的存在下，熒光強(qiáng)度急劇下降，并在10分鐘內(nèi)的熒光猝滅變得穩(wěn)定；無酶情況下，熒光下降緩慢。