本發(fā)明屬于農(nóng)產(chǎn)品及其功能成分的質(zhì)量分析領(lǐng)域，具體涉及一種蓮藕多糖二元指紋圖譜及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

蓮藕是我國(guó)栽培最廣、銷售量和銷售范圍最大的水生蔬菜。據(jù)中藥大辭典所述，蓮藕生用可清熱、涼血、散疲、治熱病煩渴，熟用可健脾、開胃、益血、生肌、止瀉。上述功效可能部分與多糖有關(guān)，蓮藕多糖經(jīng)研究證實(shí)具有抗疲勞(周桃英，2011)、降血糖(羅登宏，2011)、抗氧化(羅登宏，2011；嚴(yán)浪，2008；jiang,2011)和免疫調(diào)節(jié)(jiang,2011)等活性。新鮮蓮藕中多糖提取得率可達(dá)5％(孫杰，2016；王瑜，2007)，且藕皮、藕節(jié)和藕渣等傳統(tǒng)加工副產(chǎn)物中也含有豐富的多糖(李正一，2016；嚴(yán)浪，2007)。目前，蓮藕加工科技水平薄弱，產(chǎn)品“同質(zhì)化”現(xiàn)象嚴(yán)重，經(jīng)濟(jì)附加值不高，且加工過(guò)程中產(chǎn)生大量的藕皮、藕節(jié)和藕渣等副產(chǎn)物均未得到有效開發(fā)利用。相應(yīng)地，蓮藕多糖的高值開發(fā)利用有助于完善產(chǎn)品結(jié)構(gòu)和拓展產(chǎn)業(yè)鏈，在功能食品和生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用前景良好，而多糖的質(zhì)量控制極為關(guān)鍵。

多糖的指紋圖譜技術(shù)在多糖及其原料質(zhì)量控制方面有廣泛的應(yīng)用。枸杞多糖(高向東，2014)、猴頭菇多糖(周春暉，2016)、鐵皮石斛多糖(羅建平，2009)、決明子多糖(高新開，2014)、蘆薈多糖(董銀卯，2015)的指紋圖譜技術(shù)不僅可以突破多糖品質(zhì)與真?zhèn)舞b別，還可以實(shí)現(xiàn)原料品種及產(chǎn)地的區(qū)別。然而，蓮藕多糖的指紋圖譜技術(shù)尚未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的蓮藕多糖質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別技術(shù)缺乏等問(wèn)題，本發(fā)明提供一種蓮藕多糖二元指紋圖譜及其構(gòu)建方法。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下：一種蓮藕多糖二元指紋圖譜的構(gòu)建方法，其包括如下步驟：

1)取蓮藕洗凈后切分為藕段和藕節(jié)，藕段刨取皮部，藕節(jié)切除須根，得到藕皮、食用部位和藕節(jié)三個(gè)供試部位，分別粉碎至5～20目待用；

2)將步驟1)中粉碎的藕皮、食用部位和藕節(jié)三個(gè)供試部位分別進(jìn)行多糖提取處理，分別得到相應(yīng)的三份蓮藕多糖樣品；

3)以步驟2)得到的三份蓮藕多糖樣品為測(cè)試對(duì)象，分別進(jìn)行ftir檢測(cè)和hplc檢測(cè)，得到藕皮、食用部位和藕節(jié)三個(gè)供試部位相應(yīng)的多糖紅外圖譜和多糖高效液相色譜圖；

4)多次重復(fù)步驟1)、2)和3)分別得到多個(gè)不同品種蓮藕的藕皮、食用部位和藕節(jié)三個(gè)供試部位的多糖紅外圖譜和多糖高效液相色譜圖，以所有多糖紅外圖譜的平均向量構(gòu)建得蓮藕多糖紅外標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以所有多糖高效液相色譜圖的平均向量構(gòu)建得蓮藕多糖高效液相色譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，則構(gòu)建出所述的蓮藕多糖二元指紋圖譜。

上述技術(shù)方案可以有如下更進(jìn)一步的具體選擇。

具體的，步驟2)中的多糖提取處理的具體內(nèi)容為：將供試部位按料液比1g:15ml加入蒸餾水，在12000r/min的轉(zhuǎn)速下均質(zhì)處理5min后轉(zhuǎn)入90℃水浴恒溫浸提2h；浸提結(jié)束后，采用4500r/min離心10min，過(guò)濾分離多糖提取液；調(diào)節(jié)多糖提取液ph至6.5，加入α-淀粉酶在70℃水浴中酶解至碘液反應(yīng)呈陰性，冷卻至室溫后調(diào)節(jié)至ph4.5，加入糖化酶在55℃水浴中酶解至還原糖含量不再增加，升溫至95℃并保持10min滅酶；酶解提取液在70℃下真空濃縮至原體積1/4，采用sevage法脫蛋白后加入無(wú)水乙醇至80％乙醇體積濃度，于4℃靜置過(guò)夜；采用4500r/min離心10min分離沉淀多糖；多糖經(jīng)80％乙醇洗滌后揮發(fā)乙醇，以少量水復(fù)溶后冷凍干燥得到蓮藕多糖樣品。

具體的，步驟3)中ftir檢測(cè)的具體內(nèi)容為：將步驟2)得到的蓮藕多糖樣品與kbr粉末按質(zhì)量比1:100在研缽中混勻研磨，置于模具內(nèi)壓成透明薄片，在4000～400cm^-1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描獲得多糖紅外圖譜。

具體的，步驟3)中hplc檢測(cè)的具體內(nèi)容為：將步驟2)得到的蓮藕多糖樣品加蒸餾水配置成5mg/ml的多糖溶液，取100μl多糖溶液于安瓿瓶中，加入100μl的三氟乙酸水溶液，充氮?dú)夥夤埽⒅糜?10℃烘箱中水解8h；水解結(jié)束后，將冷卻的水解液轉(zhuǎn)移至離心管，分兩次用150μl甲醇洗滌安瓿瓶，且一并移入離心管；水解液用n2吹干，重復(fù)加甲醇吹干2次，去除三氟乙酸，加入100-150μl超純水溶解后得到水解液樣品；取50μl水解液樣品與50μl的naoh溶液混勻，加入100μl的pmp甲醇溶液后于70℃烘箱中避光反應(yīng)100min；反應(yīng)結(jié)束后室溫避光冷卻10min，加入100μl的hcl溶液中和，補(bǔ)水至2ml；加入等體積氯仿，漩渦混勻，靜置分層后棄去氯仿相，重復(fù)操作3次；取水相，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后供hplc定性、定量分析，得多糖高效液相色譜圖。

具體的，所述三氟乙酸水溶液的濃度為4mol/l，所述naoh溶液的濃度為0.6mol/l，所述pmp甲醇溶液的濃度為0.5mol/l,所述hcl溶液的濃度為0.3mol/l。

具體的，所述蓮藕多糖紅外標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜包括5個(gè)共有特征峰，依次為：1076cm^-1、1420cm^-1、1630cm^-1、2930cm^-1、3410cm^-1。

具體的，所述蓮藕多糖高效液相色譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜包括7個(gè)共有特征峰，其保留時(shí)間依次為：12.94min、18.39min、20.35min、23.03min、27.90min、31.49min、33.67min。

具體的，步驟4)中多個(gè)不同品種蓮藕的數(shù)量為13個(gè)以上。

此外，本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)通過(guò)以上方法得到的蓮藕多糖二元指紋圖譜。

本發(fā)明的有益效果為：

1)以不同品種蓮藕的藕皮、藕節(jié)及食用部位為供試部位分別提取了蓮藕多糖并獲得相應(yīng)的蓮藕多糖紅外指紋圖譜，并以多個(gè)蓮藕多糖紅外指紋圖譜的平均向量構(gòu)建了蓮藕多糖紅外標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以此為參照?qǐng)D譜，采用相關(guān)系數(shù)(r)和夾角余弦(cosθ)分析不同品種及不同部位多糖ftir指紋圖譜相似性，發(fā)現(xiàn)不同品種蓮藕及不同部位多糖的紅外指紋圖譜極為相似，可作為蓮藕來(lái)源多糖的鑒別和質(zhì)量控制的依據(jù)，也可用于蓮藕類食品的真實(shí)性鑒別；

2)同樣的，本發(fā)明還以多個(gè)蓮藕多糖高效液相色譜指紋圖譜的平均向量構(gòu)建了蓮藕多糖高效液相色譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以其為參照，經(jīng)相似度分析發(fā)現(xiàn)不同品種不同部位的蓮藕多糖的高效液相色譜指紋特征較為相似，故蓮藕多糖高效液相色譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜也可作為蓮藕來(lái)源多糖的鑒別和質(zhì)量控制的依據(jù)，以及應(yīng)用于蓮藕類食品的真實(shí)性鑒別；

3)本發(fā)明以從多個(gè)品種蓮藕的藕皮、藕節(jié)和食用部位提取的多糖為研究對(duì)象，整合蓮藕資源中多糖的多維數(shù)據(jù)體系，增加了指紋圖譜信息的全面性和可靠性；

4)構(gòu)建了蓮藕多糖紅外標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜和高效液相色譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以此二元指紋圖譜進(jìn)行蓮藕來(lái)源多糖的鑒別和質(zhì)量控制，相比于單一指紋圖譜，準(zhǔn)確度更高。

附圖說(shuō)明

圖1為蓮藕多糖的ftir指紋圖譜，其中a為蓮藕食用部位多糖ftir指紋圖譜、b為藕皮多糖ftir指紋圖譜、c為藕節(jié)多糖ftir指紋圖譜、d為蓮藕多糖ftir標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，圖中標(biāo)號(hào)1至13代表13個(gè)品種的相應(yīng)部位提取多糖進(jìn)行測(cè)試得到的對(duì)應(yīng)圖譜，在圖中曲線從上至下依次對(duì)應(yīng)1至13個(gè)品種的圖譜；

圖2為單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品的hplc色譜圖；

圖3為蓮藕多糖中單糖組成分析hplc色譜圖，其中a和b分別為為蓮藕食用部位多糖hplc指紋圖譜及其標(biāo)準(zhǔn)圖譜、c和d分別為藕皮多糖hplc指紋圖譜及其標(biāo)準(zhǔn)圖譜、e和f分別為藕節(jié)多糖hplc指紋圖譜及其標(biāo)準(zhǔn)圖譜；g為39個(gè)蓮藕多糖樣品的hplc標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明提供一種蓮藕多糖二元指紋圖譜構(gòu)建方法，該方法包括如下具體內(nèi)容：

1.蓮藕供試樣品的制備

鄂蓮5號(hào)、鄂蓮6號(hào)、鄂蓮7號(hào)、鄂蓮8號(hào)、應(yīng)城白蓮、走馬羊、貴溪浮藕、巴河藕、白泡子、博白藕、武植2號(hào)、8143、常州漂江，共計(jì)13個(gè)品種蓮藕由國(guó)家種質(zhì)武漢水生蔬菜資源圃提供，取樣時(shí)間為2015年10月。

取蓮藕洗凈后切分為藕段和藕節(jié)；藕段刨取皮部，藕節(jié)切除須根，得到藕皮、食用部位和藕節(jié)三個(gè)供試部位；供試部位分別粉碎至5～20目待用。2.蓮藕多糖的制備

稱取步驟1)中蓮藕供試樣品100g，按料液比(g/ml)1:15加入蒸餾水，在12000r/min的轉(zhuǎn)速下均質(zhì)處理5min后轉(zhuǎn)入90℃水浴恒溫浸提2h；浸提結(jié)束后，采用4500r/min離心10min，過(guò)濾分離多糖提取液；調(diào)節(jié)多糖提取液ph至6.5，加入α-淀粉酶在70℃水浴中酶解至碘液反應(yīng)呈陰性，冷卻至室溫后調(diào)節(jié)至ph4.5，加入糖化酶在55℃水浴中酶解至還原糖含量不再增加，升溫至95℃并保持10min滅酶；酶解提取液在70℃下真空濃縮至原體積1/4，采用sevage法脫蛋白后加入無(wú)水乙醇至80％乙醇體積濃度，于4℃靜置過(guò)夜；采用4500r/min離心10min分離沉淀多糖；多糖經(jīng)80％乙醇洗滌后揮發(fā)乙醇，以少量水復(fù)溶后冷凍干燥得到蓮藕多糖。

3.蓮藕多糖二元標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的構(gòu)建及分析

3-1.蓮藕多糖的ftir指紋圖譜分析

取多糖樣品與kbr粉末按質(zhì)量比1:100在研缽中混勻研磨，置于模具內(nèi)壓成透明薄片，在4000～400cm^-1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描獲得ftir圖譜。

13個(gè)品種蓮藕的食用部位、皮部、節(jié)部制備所得多糖的ftir指紋圖譜及以39個(gè)多糖樣品ftir指紋圖譜的平均向量構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)ftir指紋圖譜，如圖1所示。以構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)ftir指紋圖譜為參照?qǐng)D譜，采用相關(guān)系數(shù)(r)和夾角余弦(cosθ)分析不同品種及不同部位多糖ftir指紋圖譜相似性，相關(guān)數(shù)據(jù)如表1所示。39個(gè)多糖樣品的相關(guān)系數(shù)值為0.9856±0.2049(n＝39)，而夾角余弦值為0.9991±0.0014(n＝39)，由此說(shuō)明不同品種蓮藕及不同部位多糖的ftir指紋圖譜極為相似，可作為藕源性多糖的鑒別依據(jù)。

表1.蓮藕多糖ftir指紋圖譜的相似度分析

3-2.蓮藕多糖的hplc指紋圖譜分析

(1)單糖組成分析的pcd-hplc法的構(gòu)建

分別配制濃度均為5mmol/l的甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液；配制濃度分別為1、2、3、4、5mmol/l的單糖混合標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取50μl的單糖標(biāo)準(zhǔn)液及不同濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，各加50μl的naoh溶液(0.6mol/l)置于5ml具塞試管中，漩渦混勻；加100μl的pmp(0.5mol/l)甲醇溶液，漩渦混勻，在70℃烘箱中避光反應(yīng)100min，取出避光冷卻10min至室溫，加入100μl的hcl溶液(0.3mol/l)中和，補(bǔ)水至2ml；加入等體積氯仿漩渦混勻，靜置分層后棄去氯仿相，如此萃取3次；將水相用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后供hplc進(jìn)行分析，作為定性定量的依據(jù)。采用hplc法檢測(cè)單糖組成及含量，色譜分析條件為：uv檢測(cè)器波長(zhǎng)為250nm，色譜柱為agilentextend-c18色譜柱(4.6×250mm，5μm)，柱溫為30℃，流動(dòng)相a(0.1mol/l的磷酸鈉鹽緩沖液，ph6.7)與流動(dòng)相b(乙腈)采用梯度洗脫(0～25min，流動(dòng)相a和b的體積比維持84:16；25～36min，流動(dòng)相a和b的體積比降至80:20；36～40min，流動(dòng)相a和b的體積比升至84:16)，洗脫流速為1.0ml/min，進(jìn)樣體積為20μl。得到的單糖標(biāo)準(zhǔn)品的hplc色譜圖如圖2所示。

由圖2可見，8種單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品在色譜圖中得到較好的分離，各單糖(1→8)對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間依次為：甘露糖(man)12.87min、核糖(rib)16.99min、鼠李糖(rha)18.32min、葡萄糖醛(glcua)20.13min、半乳糖醛酸(galua)22.85min、葡萄糖(glc)27.62min、半乳糖(gal)31.19min、阿拉伯糖(ara)33.45min。8種單糖的濃度與峰面積的線性相關(guān)系數(shù)介于0.9925～0.9951。

(2)蓮藕多糖的單糖組成分析及方法學(xué)評(píng)價(jià)

取100μl多糖溶液(5mg/ml)于安瓿瓶中，加入100μl的三氟乙酸(tfa，4mol/l)溶液，充氮?dú)夥夤?，并置?10℃烘箱中水解8h；水解結(jié)束后，將冷卻的水解液轉(zhuǎn)移至離心管，分兩次用150μl甲醇洗滌安瓿瓶，且一并移入離心管；水解液用n2吹干，重復(fù)加甲醇吹干2次，去除tfa，加入超純水溶解后得到水解液樣品；取50μl水解液與50μl的naoh溶液(0.6mol/l)混勻，加入100μl的pmp甲醇溶液(0.5mol/l)后于70℃烘箱中避光反應(yīng)100min；反應(yīng)結(jié)束后室溫避光冷卻10min，加入100μl的hcl溶液(0.3mol/l)中和，補(bǔ)水至2ml；加入等體積氯仿，漩渦混勻，靜置分層后棄去氯仿相，重復(fù)操作3次；取水相，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后供hplc定性、定量分析。

取混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品的pmp衍生物，重復(fù)進(jìn)樣5次，8種單糖峰面積和保留時(shí)間的rsd值均小于5％，說(shuō)明檢測(cè)方法精密度較良好。

將水解、衍生化和中和萃取后的蓮藕多糖樣品分別放置0、4、8和12h后測(cè)定單糖組成及含量，結(jié)果表明樣品各色譜峰的峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差rsd介于2.11％～2.98％，保留時(shí)間rsd值介于1.32％～2.03％，檢測(cè)方法在12h內(nèi)具有良好穩(wěn)定性。

對(duì)5份蓮藕多糖樣品溶液，分別進(jìn)行水解、衍生化、中和萃取操作制備得到平行的蓮藕多糖hplc供試液5份。測(cè)定單糖組成及含量發(fā)現(xiàn)，各色譜峰的峰面積rsd值介于1.35％～3.56％，保留時(shí)間rsd值介于1.13％～3.31％，表明檢測(cè)方法的重復(fù)性良好。

(3)蓮藕多糖的pcd-hplc指紋圖譜構(gòu)建

按照(2)的方法進(jìn)行蓮藕多糖的單糖組成分析，得到的蓮藕不同部位的pcd-hplc指紋圖譜如圖3所示，由圖3a至圖3e可見，不同部位蓮藕多糖的pcd-hplc指紋圖譜較為相似，但亦略有差異。以最小共有峰值1％分析其共有模式的指紋特征，具體分析數(shù)據(jù)如表2所示，由表2可見不同部位的相似之處在于均含有man、galua、glc、gal和ara的共有峰，且glc和gal對(duì)應(yīng)特征峰的峰面積百分比均超過(guò)91％。而微弱的差異之處在于：食用部位多糖還含有rha的共有峰；皮部多糖還含有rib的共有峰；而藕節(jié)多糖同時(shí)含有rha、rib和glcua的共有峰。

對(duì)39個(gè)多糖樣品pcd-hplc圖譜的平均向量構(gòu)建蓮藕多糖標(biāo)準(zhǔn)hplc指紋圖譜(圖3f所示)，以此為參照?qǐng)D譜，采用相關(guān)系數(shù)(r)和夾角余弦(cosθ)分析不同品種及不同部位多糖的pcd-hplc指紋圖譜相似性，具體分析數(shù)據(jù)如表3所示，兩種相似度值之間的pearon相關(guān)性極顯著(p<0.001)。除貴溪浮藕食用部位多糖和博白藕皮部多糖外，其余37個(gè)多糖樣品的相關(guān)系數(shù)值和夾角余弦值均高于0.9。由此說(shuō)明，不同品種及不同部位多糖的hplc指紋特征較為相似，其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜可以作為蓮藕多糖真?zhèn)舞b別的重要依據(jù)，而貴溪浮藕食用部位多糖的hplc指紋圖譜特異性可以用于品種鑒別參考。

表2.蓮藕多糖的pcd-hplc指紋圖譜的共有峰信息

注：“nd”表示取最小共有峰值為1％時(shí)，在共有模式中該單糖未檢出。

表3.蓮藕多糖pcd-hplc指紋圖譜的相似度分析

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。