本發(fā)明涉及原子力顯微鏡和細(xì)胞力學(xué)領(lǐng)域，利用原子力顯微鏡(AFM)的納米探針對單細(xì)胞進(jìn)行物理穿透，發(fā)明了一種系統(tǒng)分析納米探針和單細(xì)胞作用機(jī)制的10項(xiàng)參數(shù)法。這對全面認(rèn)識(shí)細(xì)胞力學(xué)和細(xì)胞核力學(xué)有重要的發(fā)明意義。

背景技術(shù)：

基于探針技術(shù)的單細(xì)胞力學(xué)研究是目前研究的熱點(diǎn)。通過探針對單個(gè)細(xì)胞作用可以測得細(xì)胞的彈性模量、細(xì)胞與細(xì)胞之間的粘著力、細(xì)胞和胞外基質(zhì)的粘著力。最近，基于原子力顯微鏡的納米探針研究活細(xì)胞細(xì)胞核的力學(xué)性能成為了相關(guān)學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。在測細(xì)胞核力學(xué)性能的過程中，首先納米探針會(huì)穿透細(xì)胞膜，然后繼續(xù)擠壓細(xì)胞核，最后穿透細(xì)胞核被膜。這個(gè)過程可以通過原子力顯微鏡的力曲線來說明。然而，目前研究人員對納米探針穿透細(xì)胞膜和細(xì)胞核的力曲線分析僅集中在測細(xì)胞膜和細(xì)胞核的彈性模量，忽略了探針穿透細(xì)胞膜和細(xì)胞核其他重要數(shù)據(jù)，如探針穿透細(xì)胞膜和細(xì)胞核所要施加的力，探針穿透細(xì)胞膜和細(xì)胞核的壓入深度等，這些數(shù)據(jù)對全面了解探針和活細(xì)胞的相互作用至關(guān)重要。因此，為了全面掌握納米探針和單細(xì)胞作用機(jī)制，

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明通過獲取納米探針穿透單細(xì)胞過程中的受力變化，通過受力變化的過程從而計(jì)算出納米探針與單細(xì)胞之間各個(gè)過程的作用機(jī)制，計(jì)算出能表達(dá)各作用過程的具體參數(shù)。

本發(fā)明一種獲取納米探針與單細(xì)胞作用機(jī)制的方法，該方法包括：

步驟1：采用納米探針緩慢作用于單細(xì)胞，依次穿透細(xì)胞膜和細(xì)胞核被膜，記錄納米探針的進(jìn)針距離與受力變化關(guān)系；

步驟2：根據(jù)步驟1獲得的進(jìn)針距離與受力變化關(guān)系繪制出納米探針的進(jìn)針距離與受力作用曲線圖；

步驟3：按納米探針的進(jìn)針方向在步驟2得到的曲線圖上計(jì)算出曲線斜率突變的5個(gè)點(diǎn)，依次標(biāo)記為A、B、C、D、E，坐標(biāo)依次為(x_a,y_a)，(x_b,y_b)，(x_c,y_c)，(x_d,y_d)，(x_e,y_e)，和曲線首末2個(gè)點(diǎn)U,V,坐標(biāo)依次為(x_u,y_u)，(x_v,y_v)。

步驟4：計(jì)算出能表示作用機(jī)制的參數(shù)；

計(jì)算探針從開始接觸細(xì)胞膜到穿透細(xì)胞膜的壓入深度D₁：D₁＝|x_a-x_b|；

計(jì)算探針穿透細(xì)胞膜后力下降的斜率k₁：

計(jì)算探針穿透細(xì)胞膜后探針與細(xì)胞作用力的跳變值F_d1：F_d1＝|y_b-y_c|；

計(jì)算探針穿透細(xì)胞膜需要的力F₁：F₁＝y(tǒng)_b-y_u；

計(jì)算探針與細(xì)胞膜接觸后的最大壓入深度D_m：D_m＝x_v-x_a；

計(jì)算探針穿透細(xì)胞核被膜的壓入深度D₂：D₂＝|x_a-x_d|；

計(jì)算探針穿透細(xì)胞核被膜后力下降的斜率k₂：

計(jì)算探針穿透細(xì)胞核被膜后探針與細(xì)胞作用力的跳變值F_d2：F_d2＝|y_d-y_e|；

計(jì)算探針刺入細(xì)胞核被膜需要的力F₂：F₂＝y(tǒng)_d-y_u；

計(jì)算探針穿透細(xì)胞膜后的最大壓入深度D_n：D_n＝x_v-x_c；

進(jìn)一步的，所述步驟3中計(jì)算曲線斜率突變的5個(gè)點(diǎn)的具體方法為：

當(dāng)曲線斜率小于-0.2nN/μm時(shí)，認(rèn)定細(xì)胞開始與探針接觸，曲線第一個(gè)斜率小于-0.2nN/μm為A點(diǎn)；當(dāng)曲線產(chǎn)生跳變時(shí)，必定會(huì)產(chǎn)生一個(gè)局部極大點(diǎn)和一個(gè)局部極小點(diǎn)，如果一個(gè)點(diǎn)的y值大于其前20個(gè)與后20個(gè)點(diǎn)，那么它就為局部極大點(diǎn)，同理，如果一個(gè)點(diǎn)的y值小于其前20個(gè)與后20個(gè)點(diǎn)，那么它就為局部極小點(diǎn)，我們認(rèn)為第一個(gè)局部極大點(diǎn)為B點(diǎn)，第一個(gè)局部極小點(diǎn)為C點(diǎn)；第二個(gè)局部極大點(diǎn)為D點(diǎn)，第二個(gè)局部極小點(diǎn)為E點(diǎn)。

目前基于探針穿透細(xì)胞的研究，主要關(guān)注探針穿透細(xì)胞膜的概率，探針穿透細(xì)胞的作用機(jī)制還不得而知。該發(fā)明不僅可以通過探針-細(xì)胞作用的力曲線統(tǒng)計(jì)出細(xì)胞膜乃至其細(xì)胞核的刺入概率，還可以對整個(gè)刺入過程進(jìn)行量化的分析和討論，揭示細(xì)胞更多有價(jià)值的信息：細(xì)胞膜刺入力(F1)和細(xì)胞核被膜刺入力(F2)可以反映細(xì)胞所能承受的外力，量化反映細(xì)胞膜和細(xì)胞核被膜被刺入至少需要的外力大小；細(xì)胞膜的刺入力跳變(Fd1,k1))和細(xì)胞核被膜刺入力的跳變(Fd2,k2)可以反映細(xì)胞膜內(nèi)外物質(zhì)和細(xì)胞核被膜內(nèi)外物質(zhì)的差異，F(xiàn)d和k越大表明膜內(nèi)外物質(zhì)的特性差異越大，差異大于一定值才能表明針尖刺入細(xì)胞膜或細(xì)胞核被膜，通過本次大量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，我們設(shè)定Fd應(yīng)大于0.07Nn，k大于0.5Nn/μm，這樣的量化統(tǒng)計(jì)，可以作為未來智能化判斷細(xì)胞膜和細(xì)胞膜核的刺入依據(jù)。對于壓入深度的測量(D1，D2，Dm，Dn)可以形象的描述探針壓入細(xì)胞的過程，量化的這些壓入值將對未來智能控制下針位移有重要參考作用。

附圖說明

圖1左邊為培養(yǎng)皿中人成纖維細(xì)胞，右邊為單個(gè)成纖維細(xì)胞；

圖2左邊為培養(yǎng)皿中乳腺癌細(xì)胞，右邊為單個(gè)乳腺癌細(xì)胞；

圖3中(a)為商業(yè)化的金字塔氮化硅針尖顯微圖，(b)為FIB加工的氮化硅納米細(xì)針顯微圖，(c)為光學(xué)顯微鏡下探針與單細(xì)胞作用顯微圖；

圖4為探針與單細(xì)胞作用的力曲線及探針與單細(xì)胞作用的示意圖；

圖5為金字塔形氮化硅針尖與成纖維細(xì)胞作用的力曲線圖；

圖6為金字塔形氮化硅針尖MCF-7相互作用力曲線分析示意圖；

圖7為FIB加工的氮化硅納米細(xì)針與成纖維細(xì)胞作用的力曲線圖。

具體實(shí)施方式

1.人皮膚成纖維細(xì)胞(Fibroblasts簡稱“FB”)和乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)的培養(yǎng)方法

FB和MCF-7各自培養(yǎng)在35mm直徑的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液為DMEM/HIGH GIUCOSE和10％的胎牛血清(FBS)，細(xì)胞培養(yǎng)在37℃,5％CO₂的孵箱中，至少培育24小時(shí)。圖1為培養(yǎng)皿中的人皮膚成纖維細(xì)胞和原子力顯微鏡得到的單個(gè)成纖維細(xì)胞形貌圖。圖2為培養(yǎng)皿中的乳腺癌細(xì)胞和原子力顯微鏡得到的單個(gè)乳腺癌細(xì)胞形貌圖。

2.AFM實(shí)驗(yàn)以及參數(shù)設(shè)計(jì)

為了說明該方法的普適性，實(shí)驗(yàn)中分別選用了兩種細(xì)胞,成纖維細(xì)胞(圖1)和乳腺癌細(xì)胞(圖2)；選用了兩種形狀的探針，商業(yè)化的金字塔形氮化硅針尖(圖3(a))和聚焦離子束(FIB)加工的氮化硅納米細(xì)針(圖3(b))。兩種細(xì)胞和兩種探針分別進(jìn)行了三組實(shí)驗(yàn)。第一組為商業(yè)化的氮化硅探針和成纖維細(xì)胞相互作用，第二組為商業(yè)化的氮化硅探針和乳腺癌細(xì)胞相互作用，第三組為FIB加工的納米細(xì)針和成纖維細(xì)胞相互作用。探針的彈性模量為0.01N/m～0.3N/m,圖3(c)為實(shí)驗(yàn)中光學(xué)顯微鏡中探針與細(xì)胞的作用圖。實(shí)驗(yàn)設(shè)置的加載條件為1nN～10nN，下針?biāo)俣葹?μm/s。

圖3(a)商業(yè)化的金字塔氮化硅針尖，(b)FIB加工的氮化硅納米細(xì)針，(c)光學(xué)顯微鏡下探針與單細(xì)胞作用

3.探針與單細(xì)胞的作用過程

圖4為探針與單細(xì)胞作用的力曲線以及探針與細(xì)胞作用的示意圖。紅色表示進(jìn)針曲線，藍(lán)色表示回針曲線。在進(jìn)針曲線中，探針與細(xì)胞相互作用分為4個(gè)階段：

第一個(gè)階段(AB)：針尖與細(xì)胞接觸后，探針對細(xì)胞施加壓力，細(xì)胞發(fā)生變形；

第二個(gè)階段(BC)：當(dāng)探針施加的壓力達(dá)到一定值以后，細(xì)胞膜被刺破，此時(shí)力曲線會(huì)出現(xiàn)一個(gè)明顯的跳變，力從B點(diǎn)下降到C點(diǎn)，這是探針穿透細(xì)胞膜的標(biāo)志。探針進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，此時(shí)針尖所受到的力主要是細(xì)胞質(zhì)與針尖的摩擦力。

第三個(gè)階段(CD)：這個(gè)階段探針會(huì)繼續(xù)往下壓，直到壓到細(xì)胞核，隨著探針的作用力逐漸增大，細(xì)胞核被壓變形。

第四個(gè)階段(DE)：當(dāng)探針施加的壓力達(dá)到一定值以后，細(xì)胞核被膜被刺破，此時(shí)力曲線會(huì)出現(xiàn)第二個(gè)跳變，力從D點(diǎn)下降到E點(diǎn)，這是探針穿透細(xì)胞核被膜的標(biāo)志，探針進(jìn)入細(xì)胞核中，此時(shí)針尖所受到的力主要是細(xì)胞核中物質(zhì)與針尖的摩擦力。

探針與單細(xì)胞作用的10項(xiàng)參數(shù)分析法

探針穿透細(xì)胞的過程中，會(huì)出現(xiàn)兩次跳變。圖5為商業(yè)化的金字塔形氮化硅針尖與成纖維細(xì)胞作用的力曲線圖，圖6為商業(yè)化的金字塔形氮化硅針尖與癌細(xì)胞作用的力曲線圖，圖7為FIB加工的氮化硅納米細(xì)針與成纖維細(xì)胞作用的力曲線圖。這些力曲線圖中都包含了2次跳變，在兩次跳變中共有10個(gè)重要參數(shù)。第一次跳變包含了5個(gè)參數(shù)，D₁、F₁、D_m、k₁、F_d1；第二次跳變包含了5個(gè)參數(shù)，D₂、F₂、D_n、k₂、F_d2。

這些參數(shù)分別表示：

D₁：探針從開始接觸細(xì)胞膜到穿透細(xì)胞膜的壓入深度；

F₁：探針穿透細(xì)胞膜需要的力；

D_m：探針與細(xì)胞膜接觸后的最大壓入深度；

k₁:探針穿透細(xì)胞膜后力下降的斜率；

F_d1:探針穿透細(xì)胞膜后探針與細(xì)胞作用力的跳變值；

D₂：探針穿透細(xì)胞核被膜的壓入深度；

F₂：探針刺入細(xì)胞核被膜需要的力；

D_n:探針穿透細(xì)胞膜后的最大壓入深度；

k₂:探針穿透細(xì)胞核被膜后力下降的斜率；

F_d2:探針穿透細(xì)胞核被膜后探針與細(xì)胞作用力的跳變值。