本發(fā)明屬于食品領(lǐng)域，涉及一種三唑包裹的熒光金納米簇合成方法及檸檬黃測定方法。

背景技術(shù)：

檸檬黃(TZ)，其系統(tǒng)命名為：3-羧基-5-羥基(對苯磺酸)-4-(對苯磺酸偶氮)-吡唑三鈉鹽，其結(jié)構(gòu)式如圖-1所示。是一種人工合成的偶氮有機食用染料，廣泛用于烘焙產(chǎn)品、糖果和飲料等食品工業(yè)。近來研究顯示，當人體攝入過量的檸檬黃，可能會對機體健康造成不利影響，如哮喘、蕁麻疹、染色體損傷、生殖毒性、神經(jīng)行為毒性甚至癌癥。越來越多的研究也證實了檸檬黃潛在的毒性。因此食品中檸檬黃的含量必須得到嚴格的控制。為了食品安全和人類健康，建立一種快速、靈敏、簡單、便宜的檢測檸檬黃的方法是十分有必要的。

目前，越來越多的儀器分析方法已運用到食品中檸檬黃的檢測。主要包括紫外可見分光光度法(UV-vis)、高效液相色譜法(HPLC)、毛細管區(qū)帶電泳法(CZE)、電化學(xué)檢測等。然而其中有些方法由于其樣品前處理復(fù)雜、耗時、靈敏度低或選擇性差，不適合用于常規(guī)檢測。熒光金納米團簇由于其具有獨特的物理化學(xué)特性，如極小的粒徑尺寸、良好的生物相容性、良好的光穩(wěn)定性，使其在傳感檢測、分子成像、癌癥的診斷及治療等方面表現(xiàn)突出，并由此對生物醫(yī)學(xué)和分析化學(xué)領(lǐng)域的科研發(fā)展起到巨大的推動作用。而熒光傳感探針因為簡單、高靈敏度以及快速的優(yōu)點，近來備受關(guān)注。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明專利的目的在于提供一種三唑包裹的熒光金納米簇合成方法及檸檬黃測定方法，將金納米材料與分析檢測技術(shù)相結(jié)合，建立了一種簡單、快速的對飲品中檸檬黃的檢測方法。

三唑包裹的熒光金納米簇合成方法，向盛有80mL三重蒸餾水的三口燒瓶中加入1.0mL、10mM的HAuCl₄水溶液；然后在劇烈攪拌的條件下，加入5.0mL、10mM的3-巰基-1,2,4-三唑水溶液，用1M的HCl調(diào)節(jié)溶液的pH為3左右；90℃條件下反應(yīng)13個小時得無色溶液，按Au原子濃度計算濃度約為0.11mM，置于4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

三唑包裹的熒光金納米簇測定檸檬黃的方法，將濃度為0.0385mM 1.4mL三唑包裹的熒光金納米簇、500uL 30mM pH為3.0的磷酸鹽緩沖溶液，以及檸檬黃溶液或其他干擾物質(zhì)，依次加入5mL的離心管中，并用超純水定容至4mL，然后搖勻在25℃下平衡5分鐘，最后在λ_ex＝315nm時測定其熒光強度，通過光譜分析測定檸檬黃

本發(fā)明合成了3-巰基-1,2,4-三唑(TRO)保護的水溶性熒光金納米團簇(TRO-AuNCs)，將金納米材料與分析檢測技術(shù)相結(jié)合，利用TRO-AuNCs具有強且穩(wěn)定的熒光發(fā)射性質(zhì)，TRO-AuNCs作為熒光分子，檸檬黃作為猝滅劑，二者間通過共振能量轉(zhuǎn)移使熒光分子TRO-AuNCs的熒光被猝滅。本發(fā)明即是基于以上原理，建立了一種簡單、快速的對飲品中檸檬黃的檢測方法。

附圖說明

圖-1為檸檬黃(TZ)的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖；

圖-2為TRO-AuNCs的紫外-可見吸收光譜圖；

圖-3為TRO-AuNCs熒光激發(fā)(a)和發(fā)射光譜圖(b)；

圖-4為TRO(a)和TRO-金納米團簇(b)的紅外光譜圖；

圖-5(A)為不同反應(yīng)比例合成的TRO-AuNCs的熒光光譜圖；

圖-5(B)為另一比例合成的TRO-AuNCs的熒光光譜圖；

圖-6為不同pH下合成的TRO-AuNCs的熒光強度示意圖；

圖-7(A)為不同時間合成的TRO-AuNCs的熒光光譜圖；

圖-7(B)為另一時間合成的TRO-AuNCs的熒光光譜圖；

圖-8為TRO-AuNCs的合成和傳感檢測檸檬黃示意圖；

圖-9為TRO-AuNCs的熒光發(fā)射光譜(a)與檸檬黃的紫外吸收光譜(b)重疊圖；

圖-10為pH對熒光猝滅的影響圖；

圖-11為TRO-AuNCs濃度對熒光猝滅的影響圖；

圖-12為反應(yīng)溫度對體系熒光猝滅的影響圖；

圖-13反應(yīng)時間對體系熒光猝滅的影響圖；

圖-14為檸檬黃和TRO-AuNCs體系的干擾試驗圖；

圖-15(A)為檸檬黃對體系的熒光猝滅作用曲線；

圖-15(B)為熒光猝滅與檸檬黃濃度的線性關(guān)系圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部實施例，基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員正在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實驗部分

1 儀器

本實驗所用主要儀器見表1：

表1主要儀器

2 試劑

本實驗所用主要試劑見表2：

表2主要試劑

3 試驗方法

3.1 TRO修飾的水溶性金納米團簇的合成

本發(fā)明采用水熱法合成了TRO修飾的具有熒光性能的水溶性金納米團簇。具體制備方法如下：向盛有80mL三重蒸餾水的三口燒瓶中加入1.0mL、10mM的HAuCl₄水溶液；然后在劇烈攪拌的條件下，加入5.0mL、10mM的3-巰基-1,2,4-三唑水溶液，用1M的HCl調(diào)節(jié)溶液的pH為3左右；90℃條件下反應(yīng)13個小時得無色溶液，濃度約為0.11mM(按Au原子濃度計算)，置于4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2 TRO-AuNCs的表征

利用UV-2550紫外可見分光光度計測得物質(zhì)的紫外吸收光譜圖。采用Nicolet 6700型傅立葉變換紅外光譜儀，KBr壓片法分別測定4000-500cm^-1內(nèi)TRO和TRO-AuNCs。采用JSM-6510掃描電子顯微鏡以及配套的EDS對金納米簇元素進行分析。金納米簇?zé)晒夤庾V測定利用Cary Eclipse熒光光度計，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10nm，在315nm的激發(fā)波長下測其發(fā)射譜圖。

3.3 檸檬黃儲備液的配制

準確稱取0.0053g的檸檬黃，用水溶解后定容至100mL容量瓶中，得到檸檬黃儲備液濃度為0.1mM，并置于4℃的冰箱保存，實驗時稀釋到所需濃度。

3.4 熒光檢測方法

檢測檸檬黃的步驟按照如下方法操作：將1.4mL TRO-AuNCs(大概濃度為0.0385mM)、500uL 30mM pH為3.0的磷酸鹽緩沖溶液，以及不同體積的檸檬黃溶液或其他干擾物質(zhì)，依次加入5mL的離心管中，并用超純水定容至4mL，然后搖勻在25℃下平衡5分鐘，最后在λ_ex＝315nm時測定其熒光強度。

4結(jié)果與討論

4.1 TRO修飾的AuNCs的紫外-可見光譜

圖-2為濃度為0.11mM的TRO-金納米團簇的紫外-可見光區(qū)的吸收光譜。由圖可見，在整個掃描的波長范圍內(nèi)，除了315nm處的肩峰以外，沒有觀察到明顯的表面等離子共振吸收峰。文獻報道，當單層保護的金納米簇的粒徑小于2nm時，金納米粒子在520nm處的特征等離子吸收帶將消失，這是由于阻尼效應(yīng)所造成的。側(cè)面表明合成的TRO-金納米團簇的粒徑小于2nm。而紫外區(qū)315nm處出現(xiàn)的肩峰，與研究報道的8原子的金納米簇384nm處的吸收峰的結(jié)果類似，該峰位即熒光金納米團簇的最大激發(fā)峰位。因此對于TRO-AuNCs，315nm處的肩峰值得我們關(guān)注。

4.2 TRO修飾的AuNCs的熒光光譜

TRO作為修飾劑，90℃下反應(yīng)13個小時制備的AuNCs的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜如圖-3所示，掃描得到的熒光激發(fā)和發(fā)射位置分別為315nm和401nm，315nm處的熒光激發(fā)波長與圖-2所觀察到的肩峰315nm一致。將所得的AuNCs溶液在4℃的冰箱中放置6個月后沒有產(chǎn)生沉淀，其熒光強度降低僅約9％，表明合成的熒光金納米團簇能在水溶液中長期穩(wěn)定的存在。將試驗過程中使用到的試劑如氯金酸、3-巰基-1,2,4-三唑、氯金酸和3-巰基-1,2,4-三唑的混合溶液、水等都在相同的熒光測試條件下進行了測定，沒有觀察到熒光現(xiàn)象，輔助說明了具有強且穩(wěn)定的熒光發(fā)射性質(zhì)的TRO修飾的水溶性AuNCs的成功合成。

4.3 TRO-AuNCs的傅立葉變換紅外光譜(FTIR)分析

為證實配體3-巰基-1,2,4-三唑(TRO)與金納米團簇的成功結(jié)合，同時確定其結(jié)合方式，采用了傅立葉變換紅外光譜(FTIR)對AuNCs和TRO配體進行了研究，測定結(jié)果如圖-4(a)和(b)所示。從該圖中可以得到：配體TRO在2620cm^-1處出現(xiàn)-SH的伸縮振動峰。對比TRO保護的AuNCs(TRO-Au NPs)的紅外譜圖，后者峰數(shù)較少，而2620cm^-1處的-SH伸縮振動峰消失，主要是因為反應(yīng)后TRO上的巰基與金原子表面通過Au-S鍵進行了配位結(jié)合。由此可知配體TRO與Au發(fā)生了配位作用，形成穩(wěn)定的Au-S鍵并阻止生成的AuNCs發(fā)生團聚，起到修飾和穩(wěn)定AuNCs的作用。通過TRO-AuNCs的能量分散X射線光譜分析顯示，合成的金納米材料中含有N、C、S、Au元素，輔助說明TRO-AuNCs合成成功。

4.4 TRO-AuNCs合成條件的考察

4.4.1 反應(yīng)物比例的考察

在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，不同的配體與氯金酸的摩爾比會影響合成的金納米材料的熒光性能，為了獲得熒光強度較高的金納米材料，我們分別對1:1、3:1、5:1、7:1、9:1的反應(yīng)比例進行了考察，實驗結(jié)果如圖-5(A)與(B)所示。從圖中可以看出，反應(yīng)比例為1:1時，合成金納米溶液呈淺紅色，在520nm處有特征吸收峰，表明有大顆粒金納米形成，且沒有明顯的熒光性能；隨著反應(yīng)比例的增大，TRO-AuNCs熒光強度逐漸增強，在反應(yīng)比為5:1時TRO-AuNCs的熒光強度達到最大；隨著反應(yīng)比例繼續(xù)增大，熒光強度反而降低，可能是由于修飾在金納米表面的配體已達飽和，過量的配體之間的相互作用引起金納米簇的聚集，導(dǎo)致熒光強度降低。綜上，本試驗中選擇的最佳合成比例為5:1。

4.4.2 反應(yīng)酸度的考察

TRO包裹的熒光金納米簇水溶液對體系酸度的變化十分靈敏，因此對反應(yīng)酸度進行了考察。在pH為1-11范圍內(nèi)TRO-AuNCs溶液熒光強度變化如圖-6所示，在pH＝1.00～3.00的酸度范圍內(nèi)，合成的TRO-AuNCs為透明溶液，且隨體系pH增加熒光強度值逐漸增大；當pH＝3.00左右，TRO-AuNCs溶液熒光強度達到最大；然后隨著pH的繼續(xù)增加，合成的TRO-AuNCs熒光強度反而降低。并在pH>6.00以后，合成的金納米簇溶液開始變渾濁，有團聚現(xiàn)象產(chǎn)生，出現(xiàn)白色沉淀。由此可見合成的TRO-AuNCs溶液不能在堿性條件下穩(wěn)定存在。因此為了制備出穩(wěn)定的、強熒光發(fā)射性能的金納米團簇溶液，試驗最終選擇的體系最佳反應(yīng)酸度為pH＝3.00。

4.4.3 反應(yīng)時間的選擇

為研究反應(yīng)時間對合成TRO-AuNCs的光譜性能的影響，試驗測定了合成TRO-AuNCs過程中1-15h間溶液的熒光光譜，結(jié)果如圖-7所示。圖-7(A)為不同時間合成的TRO-AuNCs的熒光光譜圖，圖-7(B)為另一時間合成的TRO-AuNCs的熒光光譜圖；從圖中可以看出隨著反應(yīng)，時間的增加，TRO-AuNCs的熒光發(fā)射峰強度逐漸增強，到13h左右熒光強度達到最大，然后隨著時間的增加熒光強度基本保持穩(wěn)定，且熒光發(fā)射峰的位置基本不移動。因此，為獲得穩(wěn)定的強熒光發(fā)射性質(zhì)的金納米團簇，實驗中選擇的最佳反應(yīng)時間為13h。

4.5 水溶性TRO-AuNCs作為檢測檸檬黃的熒光探針

水溶性TRO保護的金納米團簇的制備過程及熒光傳感檢測檸檬黃的示意圖如圖-8所示。以TRO與氯金酸為原材料，以1M的HCl調(diào)節(jié)溶液pH制備出的金納米簇溶液在激發(fā)波長315nm下具有強的熒光發(fā)射。向體系加入檸檬黃后，金納米團簇溶液的熒光發(fā)生明顯猝滅現(xiàn)象。

圖-9為TRO包裹金納米簇的熒光發(fā)射光譜與檸檬黃的紫外-可見光譜的重疊譜圖?？梢杂^察到二者譜圖發(fā)生了很大程度的重疊，以此推測檸檬黃與金納米簇之間是通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)導(dǎo)致熒光分子TRO-AuNCs的熒光被猝滅。為證實這一猜想我們作了以下研究。根據(jù)Foster的非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，能量轉(zhuǎn)移在以下幾種條件下才會發(fā)生；(a)贈體與受體之間的間隔在2-8nm之間；(b)贈體的熒光峰與受體的吸收峰之間的有效重疊；(c)贈體和受體的偶極子間的適當取向。贈體和受體之間的距離和能量轉(zhuǎn)移效率可由方程式(4-1)、(4-2)、(4-3)計算得出：

$E=1-\frac{F}{F_0}=\frac{R_0^6}{R_0^6+r^6}---(4-1)$

R₀⁶＝8.8×10^-25K²N^-4φJ (4-2)

$J=\frac{{\∫}_0^{\mathrm{\∞}}F\left(\mathrm{\λ}\right)\mathrm{\ϵ}\left(\mathrm{\λ}\right){\mathrm{\λ}}^{4}d\mathrm{\λ}}{{\∫}_0^{\mathrm{\∞}}F\left(\mathrm{\λ}\right)d\mathrm{\λ}}---(4-3)$

其中，r代表贈體和受體間的間隔；R₀表示當能量轉(zhuǎn)移率為50％時由以上方程計算得到的距離；K²是贈體-受體偶極子間的取向因子；n是介質(zhì)的折射率；φ是贈體的熒光量子產(chǎn)率；J代表贈體的熒光發(fā)射峰與受體的吸收峰間的重疊程度；F(λ)是贈體在波長λ處的熒光強度；ε(λ)是受體在波長λ處的摩爾吸光系數(shù)。在以上方程中，K²＝2/3，n＝1.36，φ＝0.13，將其代入方程(4-1)、(4-2)、(4-3)，得出J＝5.83×10^-15cm³·L·mol^-1，E＝0.3287，R₀＝3.38nm，r＝4.83nm。得出的r值小于8nm，說明TRO-AuNCs與檸檬黃之間確實存在相互作用，并且極有可能發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移。結(jié)合二者熒光發(fā)射和紫外光譜明顯重疊，表明TRO-AuNCs作為能量供體，檸檬黃作為能量受體，二者間發(fā)生了共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，從而導(dǎo)致檸檬黃對TRO-AuNCs的熒光猝滅。并且實驗發(fā)現(xiàn)檸檬黃濃度與金納米團簇的熒光猝滅程度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，基于此我們將水溶性的TRO-AuNCs作為檢測檸檬黃的熒光探針。為獲得更為靈敏的檢測信號，并對一系列如pH、金納米簇用量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間等實驗條件進行了優(yōu)化。

4.5.1 pH對猝滅效率的影響

本發(fā)明合成的TRO-AuNCs在堿性的環(huán)境下不穩(wěn)定，有沉淀產(chǎn)生且熒光發(fā)射強度極低，因此實驗主要考察了酸性范圍內(nèi)pH對體系熒光強度的影響。實驗操作如下：向8支5mL離心管中分別加入1.4mL TRO-AuNCs(大概濃度為0.0385mM)、500μL 30mM pH在1-6的磷酸鹽緩沖溶液，以及0.5mL 100μM的檸檬黃儲備溶，定容到4.0mL，混合均勻。在25℃下平衡5min后，測定其熒光強度。結(jié)果如圖-10所示，當pH≤3.0時，體系的熒光猝滅效率隨著pH值的增大而逐漸增強；當pH≥3.0時，體系的熒光猝滅效率隨著pH值的增大而急劇降低；當pH＝3.0時，體系的熒光強度和熒光猝滅效率均達到最大值，反應(yīng)最為靈敏，并且此時獲得的線性關(guān)系良好。因此，本實驗選取3.0作為最佳的檢測檸檬黃的pH值。

4.5.2 TRO-AuNCs用量的選擇

TRO-AuNCs的濃度不僅會影響體系的熒光發(fā)射強度，還會對檢測目標物的靈敏度及線性工作范圍造成嚴重的影響，故在其它實驗測試條件同上情況下，本實驗對TRO-AuNCs的濃度在0.0055-0.0550mM范圍內(nèi)進行了考察。結(jié)果如圖-11所示，隨著TRO-AuNCs濃度的增加，熒光猝滅效率呈增大趨勢；在0.0385mM時達到最大值，然后隨著TRO-AuNCs濃度的增加，體系的熒光猝滅效率逐漸降低。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能是由于TRO-AuNCs濃度過高時，產(chǎn)生了TRO-AuNCs的自猝滅。因此，為了獲得比較滿意的檢測信號，最后實驗選擇金納米簇的濃度為0.0385mM。

4.5.3 反應(yīng)溫度的考察

由于在熒光光度法的測定中，反應(yīng)溫度對TRO-AuNCs-TZ體系熒光強度會產(chǎn)生影響，因此，在其它實驗測試條件同上情況下，本發(fā)明考察了溫度對體系熒光猝滅效率的影響。如圖-12所示，當溫度為25℃時，體系熒光猝滅效率最強。當反應(yīng)溫度低于25℃或者是高于25℃時，熒光猝滅效率都較低。這說明低溫和高溫都不利于反應(yīng)的進行。因此，根據(jù)實驗結(jié)果，本發(fā)明選擇最佳反應(yīng)溫度為25℃。

4.5.4 反應(yīng)時間的考察

在室溫25℃條件下，考察了反應(yīng)時間對TRO-AuNCs-TZ體系的熒光猝滅效率的影響。實驗結(jié)果如圖-13所示，從0-5min，熒光猝滅效率增強比較明顯；在5min的時候，體系熒光猝滅程度達到最大；5min以后，熒光猝滅效率趨于穩(wěn)定且熒光強度變化不大。這說明整個反應(yīng)在5min內(nèi)完成，能夠?qū)崿F(xiàn)實際樣品中檸檬黃的快速檢測。因此本實驗選擇在室溫25℃下反應(yīng)5min后進行檢測。

4.5.5 共存物質(zhì)的干擾試驗

為了進一步研究本發(fā)明基于TRO-AuNCs與檸檬黃之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致熒光猝滅原理所制備的熒光探針對檢測實際樣品中檸檬黃的選擇性情況，本發(fā)明對飲品如果汁、橙汁中可能與檸檬黃共存的干擾物質(zhì)進行了考察。結(jié)果見圖14，發(fā)現(xiàn)當Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Cl^-、NO₃^-、SO₄^2-、CO₃^2-、CH₃COO^-、葡萄糖、果糖等濃度為檸檬黃濃度的150倍時，不會對檢測檸檬黃產(chǎn)生影響；當Cr³⁺、維生素C、羅丹明B、亞甲基藍濃度為檸檬黃30倍時，不會對檸檬黃檢測造成太大的干擾。

圖-14檸檬黃和TRO-AuNCs體系的干擾試驗，磷酸鹽緩沖液pH＝3.0，TZ的濃度為5.93μM；Na+、K+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Cl-、NO3-、SO42-、CO32-、CH3COO-、葡萄糖、果糖的濃度為0.89mM；Cr3+、維生素C、羅丹明B、亞甲基藍的濃度為0.18mM。

綜上，一些常見的食品添加劑及常見的無機鹽離子在一定濃度范圍內(nèi)對于檸檬黃的定量檢測均沒有顯著影響。證實該方法可以選擇性檢測實際飲品中檸檬黃。

4.6 方法學(xué)考察

4.6.1 標準曲線的繪制

體系在選擇的最佳條件即pH為3.0的磷酸鹽緩沖溶液，濃度為0.0385mM的TRO-AuNCs溶液，作用時間為5.0min，反應(yīng)溫度為25℃下，加入不同體積的檸檬黃儲備液，使其最終濃度分別為0.00，0.08，0.90，1.50，2.50，5.00，7.50，10.00、12.50、17.50、22.50、27.50、32.50和37.50μM，測定其熒光強度。得到加入不同濃度檸檬黃體系的熒光光譜如圖-15(A)所示，可以看出隨著檸檬黃的加入，TRO-AuNCs的熒光強度逐漸降低；以TZ濃度為橫坐標，熒光強度猝滅程度(F₀/F)為縱坐標繪制標準曲線，如圖-15(B)所示。實驗得到的線性回歸方程為F₀/F＝0.9817+0.0514C(R²＝0.9993)。表明，檸檬黃濃度在0.08～37.50μM范圍內(nèi)與體系熒光強度的猝滅程度呈良好的線性關(guān)系，檢測12.50μM的檸檬黃11次平行實驗的相對標準偏差(RSD)為2.7％，檢測限(3σ/K)為0.028μM。

4.6.2 飲品實樣加標回收率和精密度試驗

為了考察該熒光探針的實樣分析能力，將其應(yīng)用于實際飲品果汁、橙汁、蜂蜜中檸檬黃的測定。樣品的處理：開瓶前搖勻以確保樣品均勻，準確移取樣品1mL于15mL的離心管中，用超純水稀釋至10mL，超聲波超聲15min，過0.45um的濾膜以待檢測。

回收率實驗：通過對飲品果汁、橙汁、蜂蜜的分析測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，果汁和蜂蜜中沒有發(fā)現(xiàn)檸檬黃的存在；橙汁中檢測到0.21μΜ檸檬黃存在。為了考證該方法的準確度和精密度，本實驗將檸檬黃的標準樣品加入到果汁、橙汁、蜂蜜樣品中，對其進行回收率實驗。

精密度試驗：0.0385mM TRO-AuNCs溶液，0.5mL pH為3.0的磷酸鹽緩沖溶液，和一定量的實際樣品，再加入不同體積的檸檬黃儲備液，定容至4mL，使果汁和蜂蜜加入的檸檬黃低、中、高三個水平的最終濃度分別為0.40，4.00，8.00uM；使橙汁加入的檸檬黃的濃度為實際檢測含量的0.5-2.0倍即最終濃度分別為0.20，0.30，0.40uM。每個濃度平行3份，25℃恒溫水槽中平衡5min后測定。沒有加實際樣品和檸檬黃儲備液的作為空白組。將上述樣品日內(nèi)、日間重復(fù)測定3次，計算日內(nèi)、日間的相對標準偏差(RSD)，實驗結(jié)果見表3。

本實驗得到日內(nèi)和日間回收率范圍分別為果汁949％-95.53％和88.8％0-99.27％、橙汁92.60％-102.15％和89.25％-92.65％、蜂蜜92.38％-105.02％和90.24％-103.40％，回收率結(jié)果較好。RSD分別為果汁2.81％-4.48％和3.16％-5.91％、橙汁2.90％-6.25％和2.27％-5.63％、蜂蜜2.50％-5.54％和3.36％-5.92％。綜上，該方法具有很好的可靠性，表明本發(fā)明建立的方法可應(yīng)用于實際飲品中檸檬黃含量的測定。

表3實際飲品中對檸檬黃的回收率和精密度試驗結(jié)果(n＝3)

4.7 方法比較

通過與文獻報道的方法比較發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提出的方法得到的線性相關(guān)系數(shù)r值是比較理想的；精密度雖不是最好的，但可以滿足實際檢測檸檬黃的需求；本發(fā)明的方法得到的檢測限(LOD)能達到28nM(0.015ppm)與文獻報道的相近甚至更好，遠低于我國食品添加劑檸檬黃的衛(wèi)生標準規(guī)定值，即人體日攝入量的最高限定標準(0.75ppm)，因此本發(fā)明所提出的方法能夠滿足實際樣品中檸檬黃測定的需要。