一種胃可寧片中氨基酸類成分指紋圖譜的檢測(cè)方法及其應(yīng)用與流程

本發(fā)明屬于中藥成分分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種胃可寧片中氨基酸類成分指紋圖譜的檢測(cè)方法及其應(yīng)用，具體涉及一種胃可寧片及胃可寧片中氨基酸類成分指紋圖譜的檢測(cè)方法及其在質(zhì)量檢測(cè)中應(yīng)用。

背景技術(shù)：

胃可寧片是在傳統(tǒng)古方“烏貝散”的基礎(chǔ)上，由上海中藥制藥一廠(現(xiàn)為上海和黃藥業(yè)有限公司)與上海市一、香山、仁濟(jì)、中山、華山等家醫(yī)院協(xié)作，經(jīng)臨床驗(yàn)證、對(duì)照、研制成功的一種治療胃部疾病的藥物。經(jīng)臨床證實(shí)，胃可寧片具有收斂、制酸、止痛作用，可用于胃病泛酸、胃及十二指腸潰瘍。它是治療慢性胃炎及消化性潰瘍的理想藥物，既能中和胃酸、抑制胃蛋白酶，又能收斂生肌、保護(hù)胃粘膜、促進(jìn)胃上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，有利于炎癥消失和潰瘍愈合。經(jīng)臨床驗(yàn)證，75％患者服藥后，在3-7天疼痛就能得到緩解。疼痛消失最快的天數(shù)為1-3天，總有效率可達(dá)80％左右；二組藥物治療中泛酸緩解率在1周己達(dá)70-80％。

胃可寧片中的主要有兩味藥材，珍珠層粉和浙貝母。其中，珍珠層粉為蚌科動(dòng)物三角帆蚌Hyriopsis cumingii(Lea)、褶紋冠蚌Cristaria plicata(Leach)或珍珠貝科動(dòng)物馬氏珍珠貝Pteria martensii(Dunker)的貝殼內(nèi)壁磨成粉，性味咸寒，其主要成分為鈣，多種氨基酸和少量微量元素，其中所含有的角殼蛋白有人體不能合成的單元氨基酸。浙貝母為百合科植物浙貝母Fritillaria thunbergii Miq.的干燥鱗莖，性味苦寒，其主要成分為生物堿，皂苷類和多種氨基酸等。氨基酸是人體主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及生命物質(zhì)，在珍珠層粉和浙貝母中均含有豐富的氨基酸，且是珍珠層粉最主要的成分，而珍珠層粉為胃可寧的主要藥材。為了更好的控制胃可寧質(zhì)量，因而需要檢測(cè)氨基酸這類成分。

中藥指紋圖譜具有整體、宏觀、模糊分析等特點(diǎn)，可通過(guò)對(duì)中藥整體特征的描述，采用適當(dāng)模糊處理方式，達(dá)到整體質(zhì)量控制的目的，因此成為中藥質(zhì)量控制的有效手段。其中色譜指紋圖譜分析可以使中藥所含多種化學(xué)組分的整體特征可視化，從而披露出常規(guī)檢驗(yàn)難以發(fā)現(xiàn)的質(zhì)量問(wèn)題。目前缺乏對(duì)胃可寧片系統(tǒng)的定性、定量研究。氨基酸類成分作為人體營(yíng)養(yǎng)所需蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)，在胃可寧片中廣泛存在，因此，有必要建立胃可寧片中氨基酸類成分的指紋圖譜，同時(shí)也可用此指紋圖譜方法建立成分含量測(cè)定方法，實(shí)現(xiàn)以一次樣品制備、一次進(jìn)樣分析，同時(shí)完成定性和定量分析，用于對(duì)胃可寧片中氨基酸類成分進(jìn)行有效的質(zhì)量控制，防止生產(chǎn)過(guò)程中摻假、摻雜現(xiàn)象，使指紋圖譜在胃可寧片的質(zhì)量控制中更具意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種胃可寧片中氨基酸類成分指紋圖譜的檢測(cè)方法及其應(yīng)用，采用優(yōu)化條件的前處理及高效液相色譜方法建立了胃可寧片及胃可寧片中氨基酸類成分指紋圖譜的檢測(cè)方法，并且同時(shí)可以利用此方法一次對(duì)5種成分(甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸)進(jìn)行定量分析。本發(fā)明中方法主要通過(guò)指紋圖譜來(lái)反映胃可寧片中氨基酸類成分，且利用該方法實(shí)現(xiàn)多成分定量控制胃可寧片的質(zhì)量，提高胃可寧片的質(zhì)控水平。

為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供一種胃可寧片指紋圖譜的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

1)供試品溶液的制備：稱取胃可寧片樣品，加入5-7mol/L濃鹽酸溶解，再進(jìn)行水解后冷卻，取水溶液濃縮至干，再加0.05-0.2mol/L稀鹽酸溶解后過(guò)濾，取清液，即得供試品溶液；

優(yōu)選地，所述胃可寧片為將原料珍珠層粉、浙貝母粉碎后過(guò)篩、混合，加入糊精和淀粉制粒，再加入陳皮油、潤(rùn)滑劑混合均勻后壓片，制得。

優(yōu)選地，所述胃可寧片樣品為將胃可寧片粉碎后獲得的粉末樣品。

優(yōu)選地，所述胃可寧片樣品加入的重量與所述濃鹽酸加入的體積之比為1:10-15(g/ml)。

更優(yōu)選地，所述胃可寧片樣品加入的重量與所述濃鹽酸加入的體積之比為2:25(g/ml)。

優(yōu)選地，所述濃鹽酸的濃度為6mol/L。

優(yōu)選地，所述稀鹽酸的濃度為0.1mol/L。

優(yōu)選地，所述水解條件為：水解設(shè)備：水浴；水解溫度：100±5℃；水解時(shí)間：7-9h。

更優(yōu)選地，所述水解條件為：水解設(shè)備：水??；水解溫度：100±1℃；水解時(shí)間：8h。

優(yōu)選地，所述水溶液與濃鹽酸加入的體積比為1:2-3。更優(yōu)選地，所述水溶液與濃鹽酸加入的體積比為2:5。

優(yōu)選地，所述濃縮條件為：濃縮設(shè)備：水?。粷饪s溫度：100±5℃。

更優(yōu)選地，所述濃縮條件為：濃縮設(shè)備：水?。粷饪s溫度：100±1℃。

優(yōu)選地，所述稀鹽酸與濃鹽酸加入的體積比為1:1-3。更優(yōu)選地，所述稀鹽酸與濃鹽酸加入的體積比為1:2。

優(yōu)選地，所述過(guò)濾的方式為采用針式過(guò)濾器的濾膜過(guò)濾方式。更優(yōu)選地，所述濾膜的孔徑為0.45μm。

2)衍生化：在步驟1)中的供試品溶液中分別加入三乙胺的乙腈溶液和異硫氰酸苯酯的乙腈溶液，搖勻后進(jìn)行衍生，再加入有機(jī)溶劑搖勻后靜置分層，取下層溶液過(guò)濾后，待用；

優(yōu)選地，所述三乙胺的乙腈溶液的濃度為0.5-2.0mol/L。更優(yōu)選地，所述三乙胺的乙腈溶液的濃度為1mol/L。

優(yōu)選地，所述異硫氰酸苯酯的乙腈溶液的濃度為0.05-0.2mol/L。更優(yōu)選地，所述異硫氰酸苯酯的乙腈溶液的濃度為0.1mol/L。

優(yōu)選地，所述三乙胺的乙腈溶液與供試品溶液加入的體積比為1:4-3:4。更優(yōu)選地，所述三乙胺的乙腈溶液與供試品溶液加入的體積比為1:2。

優(yōu)選地，所述異硫氰酸苯酯的乙腈溶液與供試品溶液加入的體積比為1:4-3:4。更優(yōu)選地，所述異硫氰酸苯酯的乙腈溶液與供試品溶液加入的體積比為1:2。

優(yōu)選地，所述衍生條件為：衍生溫度：室溫；衍生時(shí)間：0.5-2h。

更優(yōu)選地，所述衍生條件為：衍生溫度：20-25℃；衍生靜置時(shí)間：1h。

優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑為正己烷。

更優(yōu)選地，所述正己烷與供試品溶液加入的體積比為1-3:1。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述正己烷與供試品溶液加入的體積比為2:1。

優(yōu)選地，所述靜置分層時(shí)間為5-15min。更優(yōu)選地，所述靜置分層時(shí)間為10min。

優(yōu)選地，所述下層溶液與供試品溶液加入的體積比為1:1。

優(yōu)選地，所述下層溶液要用水稀釋定容。

3)測(cè)定：采用高效液相色譜法測(cè)定經(jīng)步驟2)衍生化的供試品溶液，獲得供試品溶液的指紋圖譜。

優(yōu)選地，所述高效液相色譜法的色譜條件為：

色譜柱：Venusil AA色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)；柱溫：30-45℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：250-260nm；流速：0.8-1.2mL/min；進(jìn)樣量：5-20μL；流動(dòng)相：乙腈水溶液-醋酸鈉水溶液，其中，A相為乙腈水溶液(乙腈與水的體積之比為80:15-25)，B相為40-100mmol/L醋酸鈉水溶液(醋酸調(diào)pH＝6.0-7.5)；分析時(shí)間：50min；梯度洗脫。

更優(yōu)選地，所述高效液相色譜法的色譜條件為：

色譜柱：Venusil AA色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)；柱溫：40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：10μL；流動(dòng)相：乙腈水溶液-醋酸鈉水溶液，其中，A相為乙腈水溶液(乙腈與水的體積之比為80:20)，B相為100mmol/L醋酸鈉水溶液(醋酸調(diào)pH＝6.5)；分析時(shí)間：50min；梯度洗脫。

最優(yōu)選地，所述梯度洗脫的具體程序?yàn)?見(jiàn)表1)：

0-15min，A相：B相體積比為0:100-8:92；

15-25min，A相：B相體積比為8:92-22:78；

25-36min，A相：B相體積比為22:78-36:64；

36-38min，A相：B相體積比為36:64-100:0；

38-43min，A相：B相體積比為100:0-100:0；

43-43.1min，A相：B相體積比為100:0-0:100；

43.1-50min，A相：B相體積比為0:100-0:100。

表1梯度洗脫程序

上述胃可寧片指紋圖譜的檢測(cè)方法可用于胃可寧片的質(zhì)量檢測(cè)。

本發(fā)明還提供一種胃可寧片中氨基酸類成分指紋圖譜的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

A1)供試品溶液的制備：與胃可寧片指紋圖譜的檢測(cè)方法的步驟1)相同；

A2)對(duì)照品溶液的制備：分別稱取胃可寧片中氨基酸類成分對(duì)照品，加0.05-0.2mol/L稀鹽酸溶解并定容，搖勻，得到對(duì)照品溶液；

優(yōu)選地，所述胃可寧片中氨基酸類成分選自甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸中一種或多種。

更優(yōu)選地，所述對(duì)照品溶液中甘氨酸的CAS號(hào)為56-40-6；精氨酸的CAS號(hào)為74-79-3；丙氨酸的CAS號(hào)為56-41-7；亮氨酸的CAS號(hào)為61-90-5；苯丙氨酸的CAS號(hào)為63-91-2。

更優(yōu)選地，所述對(duì)照品溶液中各成分的含量范圍為：甘氨酸10-200μg/ml、精氨酸10-200μg/ml、丙氨酸10-200μg/ml、亮氨酸10-200μg/ml、苯丙氨酸10-200μg/ml。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述對(duì)照品溶液中甘氨酸，精氨酸，丙氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸的含量均為100μg/ml。

優(yōu)選地，所述對(duì)照品溶液是將對(duì)照品逐級(jí)稀釋后配制。

更優(yōu)選地，所述逐級(jí)稀釋，包括以下步驟：

Ⅰ、分別稱取甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸對(duì)照品，加0.05-0.2mol/L稀鹽酸溶解、稀釋并定容，配成對(duì)照品儲(chǔ)備液；

Ⅱ、將對(duì)照品儲(chǔ)備液再加0.05-0.2mol/L稀鹽酸溶解、稀釋并定容，配成對(duì)照品溶液。

A3)空白對(duì)照溶液的制備：取0.05-0.2mol/L稀鹽酸作為空白對(duì)照溶液；

A4)衍生化：將步驟A1)中的供試品溶液、步驟A2)中的對(duì)照品溶液、步驟A3)中的空白對(duì)照溶液，分別加入三乙胺的乙腈溶液和異硫氰酸苯酯的乙腈溶液，搖勻后進(jìn)行衍生，再加入有機(jī)溶劑搖勻后靜置分層，取下層溶液過(guò)濾后，待用；

優(yōu)選地，所述三乙胺的乙腈溶液的濃度為0.5-2.0mol/L。更優(yōu)選地，所述三乙胺的乙腈溶液的濃度為1mol/L。

優(yōu)選地，所述異硫氰酸苯酯的乙腈溶液的濃度為0.05-0.2mol/L。更優(yōu)選地，所述異硫氰酸苯酯的乙腈溶液的濃度為0.1mol/L。

優(yōu)選地，所述三乙胺的乙腈溶液與供試品溶液加入的體積比為1:4-3:4。更優(yōu)選地，所述三乙胺的乙腈溶液與供試品溶液加入的體積比為1:2。

優(yōu)選地，所述異硫氰酸苯酯的乙腈溶液與供試品溶液加入的體積比為1:4-3:4。更優(yōu)選地，所述異硫氰酸苯酯的乙腈溶液與供試品溶液加入的體積比為1:2。

更優(yōu)選地，所述供試品溶液、對(duì)照品溶液、空白對(duì)照溶液加入的體積比為1:1:1。

優(yōu)選地，所述衍生條件為：衍生溫度：室溫；衍生時(shí)間：0.5-2h。

更優(yōu)選地，所述衍生條件為：衍生溫度：20-25℃；衍生靜置時(shí)間：1h。

優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑為正己烷。

更優(yōu)選地，所述正己烷與供試品溶液加入的體積比為1-3:1。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述正己烷與供試品溶液加入的體積比為2:1。

優(yōu)選地，所述靜置分層時(shí)間為5-15min。

更優(yōu)選地，所述靜置分層時(shí)間為10min。

優(yōu)選地，所述下層溶液與供試品溶液加入的體積比為1:1。

優(yōu)選地，所述下層溶液要用水稀釋定容。

上述所用水為超純水。

A5)測(cè)定：采用與胃可寧片指紋圖譜的檢測(cè)方法中相同色譜條件的高效液相色譜法，分別測(cè)定經(jīng)步驟A4)衍生化的供試品溶液、對(duì)照品溶液和空白對(duì)照溶液，將獲得的供試品溶液的液相色譜圖，與對(duì)照品溶液和空白對(duì)照溶液的液相色譜圖進(jìn)行比較，根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間，指認(rèn)出共有特征峰，從而獲得供試品溶液中氨基酸類成分的指紋圖譜。

上述胃可寧片中氨基酸類成分指紋圖譜的檢測(cè)方法可用于胃可寧片的質(zhì)量檢測(cè)或胃可寧片中氨基酸類成分的含量測(cè)定。

本發(fā)明還提供了一種胃可寧片中氨基酸類成分含量的測(cè)定方法，包括以下步驟：

B1)供試品溶液的制備：與胃可寧片中氨基酸類成分指紋圖譜的檢測(cè)方法的步驟A1)相同；

B2)對(duì)照品溶液的制備：與胃可寧片中氨基酸類成分指紋圖譜的檢測(cè)方法的步驟A2)相同；

B3)衍生化：與胃可寧片中氨基酸類成分指紋圖譜的檢測(cè)方法的步驟A4)相同；

B4)測(cè)定：采用與胃可寧片中氨基酸類成分指紋圖譜的檢測(cè)方法中相同色譜條件的高效液相色譜法，分別測(cè)定經(jīng)步驟B3)衍生化的供試品溶液和對(duì)照品溶液，并采用外標(biāo)法計(jì)算供試品溶液中氨基酸類成分的含量。

優(yōu)選地，所述外標(biāo)法選自外標(biāo)一點(diǎn)法或標(biāo)準(zhǔn)曲線法中的一種。

所述外標(biāo)一點(diǎn)法是指：移取一個(gè)一定體積的步驟B2)所述對(duì)照品，配成一個(gè)一定濃度的對(duì)照品溶液，采用高效液相色譜儀進(jìn)樣分析，獲得對(duì)照品溶液中氨基酸類成分含量與峰面積的線性關(guān)系，以每一種氨基酸類成分色譜峰面積對(duì)應(yīng)其相應(yīng)的含量，繪制相應(yīng)的工作曲線，計(jì)算得到各工作曲線的回歸方程。再將供試品溶液采用高效液相色譜儀檢測(cè)，將獲得的供試品溶液中氨基酸類成分的色譜峰面積，分別代入所述各工作曲線的回歸方程中，可得到相應(yīng)氨基酸類成分的含量。

所述標(biāo)準(zhǔn)曲線法是指：分別移取一系列不同體積的步驟B2)所述對(duì)照品，配成一系列不同濃度的對(duì)照品溶液，采用高效液相色譜儀進(jìn)樣分析，獲得對(duì)照品溶液中氨基酸類成分含量與峰面積的線性關(guān)系，以每一種氨基酸類成分色譜峰面積對(duì)應(yīng)其相應(yīng)的含量，繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算得到各標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程。再將供試品溶液采用高效液相色譜儀檢測(cè)，將獲得的供試品溶液中氨基酸類成分的色譜峰面積，分別代入所述各標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程中，可得到相應(yīng)氨基酸類成分的含量。

本發(fā)明還提供一種胃可寧片的質(zhì)量檢測(cè)方法，包括采用前述指紋圖譜的檢測(cè)方法獲得供試品的指紋圖譜，將得到的供試品的指紋圖譜與相同指紋圖譜檢測(cè)條件下獲得的胃可寧片的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行特征峰的比對(duì)、指紋圖譜相似度計(jì)算。

優(yōu)選地，所述指紋圖譜選自胃可寧片指紋圖譜、胃可寧片中氨基酸類成分指紋圖譜中的一種或多種組合。

更優(yōu)選地，所述指紋圖譜為胃可寧片中氨基酸類成分指紋圖譜。

優(yōu)選地，所述胃可寧片的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜是指，將同一種至少10個(gè)批次的胃可寧片，按照相同指紋圖譜檢測(cè)條件下獲得的指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(國(guó)家藥典委員會(huì)，版本2009)，生成對(duì)照指紋圖譜，從而確定胃可寧片的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

所述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜以12號(hào)峰為內(nèi)參比峰，包括符合下列特征的12個(gè)共有指紋峰：

優(yōu)選地，所述特征峰的比對(duì)所獲得的共有特征峰共12個(gè)(見(jiàn)圖5)。其中1號(hào)峰和4號(hào)峰來(lái)源于浙貝母，5號(hào)峰來(lái)源于珍珠層粉，而其余9個(gè)峰共同來(lái)源了浙貝母和珍珠層粉(見(jiàn)圖3-4)。其中，2號(hào)峰為甘氨酸(Glu)、3號(hào)峰為精氨酸(Arg)，6號(hào)峰為丙氨酸(Ala)，11號(hào)峰為亮氨酸(Leu)，12號(hào)峰為苯丙氨酸(Phe)(見(jiàn)圖2、5)。

優(yōu)選地，所述指紋圖譜相似度≥0.95。即在實(shí)際檢測(cè)時(shí)，當(dāng)被檢樣品與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行相似度比較，當(dāng)相似度≥0.95，即為合格質(zhì)量的胃可寧片。

如上所述，本發(fā)明提供的一種胃可寧片中氨基酸類成分指紋圖譜的檢測(cè)方法及其應(yīng)用，采用優(yōu)化反應(yīng)條件的前處理及儀器分析方法，建立了胃可寧片及其胃可寧片中氨基酸類成分指紋圖譜，同時(shí)此方法又可以對(duì)胃可寧片中氨基酸類成分進(jìn)行定量分析，實(shí)現(xiàn)一次樣品分析，同時(shí)完成定性和定量分析。該方法的精密度和重復(fù)性試驗(yàn)的峰面積和保留時(shí)間RSD值均小于3％，精密度、重復(fù)性良好。并能保持供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定，穩(wěn)定性的峰面積和保留時(shí)間RSD值均小于3％，穩(wěn)定性良好。因此，本發(fā)明中方法測(cè)定胃可寧片中氨基酸類成分結(jié)果可靠，樣品測(cè)定方法簡(jiǎn)便易行，可作為胃可寧片的質(zhì)控方法，實(shí)現(xiàn)多成分定量控制胃可寧片質(zhì)量，提高胃可寧片質(zhì)控水平。

附圖說(shuō)明

圖1顯示為本發(fā)明中的空白對(duì)照溶液的液相色譜圖。

圖2顯示為本發(fā)明中的對(duì)照品溶液的液相色譜圖，其中，a，甘氨酸(Glu)；b，精氨酸(Arg)；c，丙氨酸(Ala)；d，亮氨酸(Leu)；e，苯丙氨酸(Phe)。

圖3顯示為本發(fā)明中的未添加珍珠層粉的胃可寧片供試品溶液的液相色譜圖。

圖4顯示為本發(fā)明中的未添加浙貝母的胃可寧片供試品溶液的液相色譜圖。

圖5顯示為本發(fā)明中的胃可寧片供試品溶液的液相色譜圖，其中，2(a)，甘氨酸(Glu)；3(b)，精氨酸(Arg)；6(c)，丙氨酸(Ala)；11(d)，亮氨酸(Leu)；12(e)，苯丙氨酸(Phe)。

圖6顯示為本發(fā)明中的10批胃可寧片供試品溶液的對(duì)照液相色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

以下通過(guò)特定的具體實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說(shuō)明書(shū)所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過(guò)另外不同的具體實(shí)施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說(shuō)明書(shū)中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒(méi)有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。

以下實(shí)施例使用的試劑和儀器如下：

1、試劑

胃可寧片(市售，批號(hào)：151109、160112、160118、160220、160303、160314、160325、160407、160425、160509，上海和黃藥業(yè)有限公司)；甘氨酸(Gly)、精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)(純度均＞99％，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；乙腈(色譜純，美國(guó)TEDIA公司)；醋酸(色譜純，德國(guó)CNW公司)；三乙胺(TEA，色譜純，德國(guó)CNW公司)；異硫氰酸苯酯(PITC，純度98％，中國(guó)上海阿拉丁試劑公司)；鹽酸(HCl，純度36％～38％，上海豪申化學(xué)試劑有限公司)；無(wú)水醋酸鈉(分析純，上海豪申化學(xué)試劑有限公司)；超純水(Millipore超純水發(fā)生器自制)；正己烷(分析純，上海豪申化學(xué)試劑有限公司)。

2、儀器

Agilent1100高效液相色譜儀(配DAD檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司)；SB-5200超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Milli-Q超純水發(fā)生器(美國(guó)Millipore公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司)。

實(shí)施例1

1、實(shí)驗(yàn)部分

1.1樣品前處理

供試品溶液的制備：準(zhǔn)確稱取胃可寧片2g，置于100mL錐形瓶中，加入6mol/L鹽酸25mL溶解，然后置于100±1℃水浴中水解8小時(shí)，取出冷卻，取水溶液10mL，置于蒸發(fā)皿中，100±1℃水浴濃縮至干，加入5mL的0.1mol/L稀鹽酸溶解，用0.45μm濾膜的針式過(guò)濾器過(guò)濾后，取清液，供衍生待用。

1.2衍生化

準(zhǔn)確量取供試品溶液400μL，置于2mL離心管中，加入1mol/L三乙胺的乙腈溶液200μL和0.1mol/L異硫氰酸苯酯的乙腈溶液200μL，搖勻室溫靜置衍生1小時(shí)。衍生結(jié)束后加入800μL正己烷，振搖并靜置10min，取下層溶液400μL并用水稀釋到1mL，混合均勻后用0.22μm濾膜的針式過(guò)濾器過(guò)濾，即得所需待測(cè)溶液。

1.3色譜條件

高效液相色譜法的色譜條件為：色譜柱：Venusil AA色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)；柱溫：40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：10μL；流動(dòng)相：乙腈水溶液-醋酸鈉水溶液，其中，A相為乙腈水溶液(乙腈與水的體積之比為80：20)，B相為100mmol/L醋酸鈉水溶液(醋酸調(diào)pH＝6.5)；分析時(shí)間：50min；梯度洗脫。

梯度洗脫的具體程序?yàn)椋?/p>

0-15min，A相：B相體積比為0:100-8:92；

15-25min，A相：B相體積比為8:92-22:78；

25-36min，A相：B相體積比為22:78-36:64；

36-38min，A相：B相體積比為36:64-100:0；

38-43min，A相：B相體積比為100:0-100:0；

43-43.1min，A相：B相體積比為100:0-0:100；

43.1-50min，A相：B相體積比為0:100-0:100。

1.4測(cè)定

采用步驟1.3中的高效液相色譜法測(cè)定經(jīng)步驟1.2衍生化的供試品溶液，獲得供試品溶液的指紋圖譜。

2、指紋圖譜

將步驟1.4獲得供試品的指紋圖譜，與相同指紋圖譜檢測(cè)條件下獲得的胃可寧片的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行特征峰的比對(duì)、指紋圖譜相似度計(jì)算，從而對(duì)胃可寧片進(jìn)行質(zhì)量控制。其中，胃可寧片的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，是將上述至少10個(gè)批次的同一種供試品，按照相同指紋圖譜檢測(cè)條件下獲得的指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(國(guó)家藥典委員會(huì)，版本2009)，生成對(duì)照指紋圖譜獲得的。通過(guò)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng))的計(jì)算，得到10批次胃可寧片樣品的整體相似度評(píng)價(jià)結(jié)果，整體相似度可以體現(xiàn)不同批次樣品間各成分在種類及其相對(duì)含量上的相似程度，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，10批胃可寧片的相似度均大于0.95以上，表明此指紋圖譜作為胃可寧片的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，可用于胃可寧片質(zhì)量控制。

當(dāng)被檢樣品與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行相似度比較，當(dāng)相似度≥0.95，即為合格質(zhì)量的胃可寧片。

表2 10批胃可寧片指紋圖譜相似度結(jié)果

實(shí)施例2

1、實(shí)驗(yàn)部分

1.1樣品前處理

供試品溶液的制備：準(zhǔn)確稱取一定量的胃可寧片，置于100mL錐形瓶中，加入5-7mol/L鹽酸溶解，胃可寧片加入的重量與5-7mol/L鹽酸加入的體積之比為1:10-15(g/ml)。然后置于100±5℃水浴中水解7-9小時(shí)，取出冷卻。取水溶液置于蒸發(fā)皿中，100±5℃水浴濃縮至干，水溶液與5-7mol/L鹽酸加入的體積比為1:2-3。再加入0.05-0.2mol/L稀鹽酸溶解，0.05-0.2mol/L稀鹽酸與5-7mol/L鹽酸加入的體積比為1:1-3。用0.45μm濾膜的針式過(guò)濾器過(guò)濾后，取清液貯存于4℃冰箱中，供衍生待用。

1.2衍生化

準(zhǔn)確量取一定量的供試品溶液，置于2mL離心管中，分別加入0.5-2.0mol/L三乙胺的乙腈溶液和0.05-0.2mol/L異硫氰酸苯酯的乙腈溶液，搖勻室溫靜置衍生0.5-2.0小時(shí)。三乙胺的乙腈溶液與供試品溶液加入的體積比為1:4-3:4。異硫氰酸苯酯的乙腈溶液與供試品溶液加入的體積比為1:4-3:4。衍生結(jié)束后加入正己烷，振搖并靜置5-15min，正己烷與供試品溶液加入的體積比為1-3:1。取下層溶液并用水稀釋到一定體積，混合均勻，所取的下層溶液與供試品溶液加入的體積比為1:1。再用0.22μm濾膜的針式過(guò)濾器過(guò)濾，即得所需待測(cè)溶液。

1.3色譜條件

高效液相色譜法的色譜條件為：色譜柱：Venusil AA色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)；柱溫：30-45℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：250-260nm；流速：0.8-1.2mL/min；進(jìn)樣量：5-20μL；流動(dòng)相：乙腈水溶液-醋酸鈉水溶液，其中，A相為乙腈水溶液(乙腈與水的體積之比為80:15-25)，B相為40-100mmol/L醋酸鈉水溶液(醋酸調(diào)pH＝6.0-7.5)；分析時(shí)間：50min；梯度洗脫。

梯度洗脫的具體程序?yàn)椋?/p>

0-15min，A相：B相體積比為0:100-8:92；

15-25min，A相：B相體積比為8:92-22:78；

25-36min，A相：B相體積比為22:78-36:64；

36-38min，A相：B相體積比為36:64-100:0；

38-43min，A相：B相體積比為100:0-100:0；

43-43.1min，A相：B相體積比為100:0-0:100；

43.1-50min，A相：B相體積比為0:100-0:100。

1.4測(cè)定

采用步驟1.3中的高效液相色譜法測(cè)定經(jīng)步驟1.2衍生化的供試品溶液，獲得供試品溶液的指紋圖譜。

2、指紋圖譜

將步驟1.4獲得供試品的指紋圖譜，與相同指紋圖譜檢測(cè)條件下獲得的胃可寧片的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行特征峰的比對(duì)、指紋圖譜相似度計(jì)算，從而對(duì)胃可寧片進(jìn)行質(zhì)量控制。其中，胃可寧片的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，是將上述至少10個(gè)批次的同一種供試品，按照相同指紋圖譜檢測(cè)條件下獲得的指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(國(guó)家藥典委員會(huì)，版本2009)，生成對(duì)照指紋圖譜獲得的。通過(guò)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng))的計(jì)算，得到10批次胃可寧片樣品的整體相似度評(píng)價(jià)結(jié)果，整體相似度可以體現(xiàn)不同批次樣品間各成分在種類及其相對(duì)含量上的相似程度。當(dāng)10批胃可寧片的相似度均大于0.95以上，表明此指紋圖譜作為胃可寧片的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，可用于胃可寧片質(zhì)量控制。

當(dāng)被檢樣品與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行相似度比較，當(dāng)相似度≥0.95，即為合格質(zhì)量的胃可寧片。

實(shí)施例3

1、實(shí)驗(yàn)部分

1.1樣品前處理

供試品溶液的制備：與實(shí)施例1中的步驟1.1中的供試品溶液的制備過(guò)程相同。

1.2對(duì)照品前處理

對(duì)照品溶液的制備：分別精密稱取甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸對(duì)照品20mg，用0.1mol/L鹽酸溶解并定容，搖勻，逐級(jí)稀釋后，由對(duì)照品儲(chǔ)備液得到對(duì)照品溶液。對(duì)照品溶液中甘氨酸，精氨酸，丙氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸的含量均為100μg/ml。

1.3衍生化

供試品溶液的衍生化與實(shí)施例1的步驟1.2中的供試品溶液的衍生化過(guò)程相同。

準(zhǔn)確量取步驟1.2中的對(duì)照品溶液400μL，置于2mL離心管中，加入1mol/L三乙胺的乙腈溶液200μL和0.1mol/L異硫氰酸苯酯的乙腈溶液200μL，搖勻室溫靜置衍生1小時(shí)。衍生結(jié)束后加入800μL正己烷，振搖并靜置10min，取下層溶液400μL并用水稀釋到1mL，混合均勻后用0.22μm濾膜的針式過(guò)濾器過(guò)濾，即得所需待測(cè)對(duì)照品溶液。

1.4比較溶液

取0.1mol/L鹽酸400μL作為空白對(duì)照溶液，按步驟1.3中的衍生化方法進(jìn)行衍生化，得到所需待測(cè)空白對(duì)照溶液。

取未添加珍珠層粉的胃可寧片樣品，按步驟1.1中的方法進(jìn)行前處理，獲得未添加珍珠層粉的陰性樣品溶液。再取未添加珍珠層粉的陰性樣品溶液400μL，按步驟1.3中的衍生化方法進(jìn)行衍生化，得到所需待測(cè)未添加珍珠層粉的陰性樣品溶液。

取未添加浙貝母的胃可寧片樣品，按步驟1.1中的方法進(jìn)行前處理，獲得未添加浙貝母的陰性樣品溶液。再取未添加浙貝母的陰性樣品溶液400μL，按步驟1.3中的衍生化方法進(jìn)行衍生化，得到所需待測(cè)未添加浙貝母的陰性樣品溶液。

1.5色譜條件

高效液相色譜法的色譜條件與實(shí)施例1的步驟1.3中的高效液相色譜法的色譜條件相同。

1.6測(cè)定

采用步驟1.5中的高效液相色譜法測(cè)定經(jīng)步驟1.3衍生化的供試品溶液和對(duì)照品溶液，將獲得的供試品溶液的液相色譜圖，與對(duì)照品溶液的液相色譜圖進(jìn)行比較，根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間，指認(rèn)出共有特征峰，從而獲得供試品溶液中氨基酸類成分的指紋圖譜。

同時(shí)，采用步驟1.5中的高效液相色譜法測(cè)定經(jīng)步驟1.4衍生化的空白溶液、未添加珍珠層粉的陰性樣品溶液、未添加浙貝母的陰性樣品溶液，獲得的空白溶液、未添加珍珠層粉的陰性樣品溶液、未添加浙貝母的陰性樣品溶液的液相色譜圖，作為參考。

2、指紋圖譜

將步驟1.6獲得供試品的指紋圖譜，與相同指紋圖譜檢測(cè)條件下獲得的胃可寧片的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行特征峰的比對(duì)、指紋圖譜相似度計(jì)算，從而對(duì)胃可寧片進(jìn)行質(zhì)量控制。其中，胃可寧片的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，是將上述至少10個(gè)批次的同一種供試品，按照相同指紋圖譜檢測(cè)條件下獲得的指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(國(guó)家藥典委員會(huì)，版本2009)，生成對(duì)照指紋圖譜獲得的，具體圖譜見(jiàn)圖6。通過(guò)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)的計(jì)算，得到10批次胃可寧片樣品的整體相似度評(píng)價(jià)結(jié)果，整體相似度可以體現(xiàn)不同批次樣品間各成分在種類及其相對(duì)含量上的相似程度，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，10批胃可寧片的相似度均大于0.95以上，表明此指紋圖譜作為胃可寧片的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，可用于胃可寧片質(zhì)量控制。當(dāng)被檢樣品與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行相似度比較，當(dāng)相似度≥0.95，即為合格質(zhì)量的胃可寧片。

同時(shí)，如圖5所示，此指紋圖譜中具有分離度較好和穩(wěn)定性較高的12個(gè)共有峰。通過(guò)與空白溶液(見(jiàn)圖1)、未添加珍珠層粉的陰性樣品溶液(見(jiàn)圖3)、未添加浙貝母的陰性樣品溶液的液相色譜圖(見(jiàn)圖4)對(duì)比，確定了12個(gè)共有峰的來(lái)源，其中1號(hào)峰和4號(hào)峰來(lái)源于浙貝母，5號(hào)峰來(lái)源于珍珠層粉，而其余9個(gè)峰共同來(lái)源了浙貝母和珍珠層粉。再通過(guò)與圖2中對(duì)照品溶液的液相色譜圖進(jìn)行比較，確定圖5中2號(hào)峰為甘氨酸(Glu)、3號(hào)峰為精氨酸(Arg)，6號(hào)峰為丙氨酸(Ala)，11號(hào)峰為亮氨酸(Leu)，12號(hào)峰為苯丙氨酸(Phe)。

3、方法學(xué)驗(yàn)證

3.1精密度

取批號(hào)為151109的胃可寧片樣品1份，按步驟1.1制備供試品溶液，并按步驟1.3對(duì)供試品溶液進(jìn)行衍生化，再按步驟1.5的液相色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，以12號(hào)峰為參照峰，分別計(jì)算12個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，精密度具體結(jié)果見(jiàn)表3、4。結(jié)果表明，12個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值，均小于3％，說(shuō)明該指紋圖譜的精密度良好。

表3精密度相對(duì)保留時(shí)間結(jié)果

表4精密度相對(duì)峰面積結(jié)果

3.2重復(fù)性

取批號(hào)為151109的胃可寧片樣品6份，按步驟1.1制備供試品溶液，并按步驟1.3對(duì)供試品溶液進(jìn)行衍生化，再按步驟1.5的液相色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以12號(hào)峰為參照峰，分別計(jì)算12個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，重復(fù)性具體結(jié)果見(jiàn)表5、6。

結(jié)果表明，12個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值，均小于3％，說(shuō)明該指紋圖譜的重復(fù)性良好。

表5重復(fù)性相對(duì)保留時(shí)間結(jié)果

表6重復(fù)性相對(duì)峰面積結(jié)果

3.3穩(wěn)定性

取批號(hào)為151109的胃可寧片樣品1份，按步驟1.1制備供試品溶液，并按步驟1.3對(duì)供試品溶液進(jìn)行衍生化，再按步驟1.5的液相色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別在0、1、2、4、6、8h測(cè)定，以12號(hào)峰為參照峰，分別計(jì)算12個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，重復(fù)性具體結(jié)果見(jiàn)表7、8。

結(jié)果表明，12個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值，均小于3％，說(shuō)明該指紋圖譜在8h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表7穩(wěn)定性相對(duì)保留時(shí)間結(jié)果

表8穩(wěn)定性相對(duì)峰面積結(jié)果

實(shí)施例4

1、實(shí)驗(yàn)部分

1.1樣品前處理

供試品溶液的制備：與實(shí)施例2中的步驟1.1中的供試品溶液的制備過(guò)程相同。

1.2對(duì)照品前處理

對(duì)照品溶液的制備：分別精密稱取甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸對(duì)照品20mg，用0.05-0.2mol/L鹽酸溶解并定容，搖勻，逐級(jí)稀釋后，由對(duì)照品儲(chǔ)備液得到對(duì)照品溶液。對(duì)照品溶液中甘氨酸，精氨酸，丙氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸的含量范圍均為10-200μg/ml。

1.3衍生化

供試品溶液的衍生化與實(shí)施例2的步驟1.2中的供試品溶液的衍生化過(guò)程相同。

準(zhǔn)確量取一定量的對(duì)照品溶液，置于2mL離心管中，分別加入0.5-2.0mol/L三乙胺的乙腈溶液和0.05-0.2mol/L異硫氰酸苯酯的乙腈溶液，搖勻室溫靜置衍生0.5-2.0小時(shí)。三乙胺的乙腈溶液與對(duì)照品溶液加入的體積比為1:4-3:4。異硫氰酸苯酯的乙腈溶液與對(duì)照品溶液加入的體積比為1:4-3:4。衍生結(jié)束后加入正己烷，振搖并靜置5-15min，正己烷與對(duì)照品溶液加入的體積比為1-3:1。取下層溶液并用水稀釋到一定體積，混合均勻，所取的下層溶液與對(duì)照品溶液加入的體積比為1:1。再用0.22μm濾膜的針式過(guò)濾器過(guò)濾，即得所需待測(cè)對(duì)照品溶液。

1.4比較溶液

取一定量0.1mol/L鹽酸作為空白溶液，按步驟1.3中的衍生化方法進(jìn)行衍生化，得到所需待測(cè)空白溶液。

取未添加珍珠層粉的胃可寧片樣品，按步驟1.1中的方法進(jìn)行前處理，獲得未添加珍珠層粉的陰性樣品溶液。再取一定量未添加珍珠層粉的陰性樣品溶液，按步驟1.3中的衍生化方法進(jìn)行衍生化，得到所需待測(cè)未添加珍珠層粉的陰性樣品溶液。

取未添加浙貝母的胃可寧片樣品，按步驟1.1中的方法進(jìn)行前處理，獲得未添加浙貝母的陰性樣品溶液。再取一定量未添加浙貝母的陰性樣品溶液，按步驟1.3中的衍生化方法進(jìn)行衍生化，得到所需待測(cè)未添加浙貝母的陰性樣品溶液。

1.5色譜條件

高效液相色譜法的色譜條件與實(shí)施例2的步驟1.3中的高效液相色譜法的色譜條件相同。

1.6測(cè)定

采用步驟1.5中的高效液相色譜法測(cè)定經(jīng)步驟1.3衍生化的供試品溶液和對(duì)照品溶液，將獲得的供試品溶液的液相色譜圖，與對(duì)照品溶液的液相色譜圖進(jìn)行比較，根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間，指認(rèn)出共有特征峰，從而獲得供試品溶液中氨基酸類成分的指紋圖譜。

同時(shí)，采用步驟1.5中的高效液相色譜法測(cè)定經(jīng)步驟1.4衍生化的空白溶液、未添加珍珠層粉的陰性樣品溶液、未添加浙貝母的陰性樣品溶液，獲得的空白溶液、未添加珍珠層粉的陰性樣品溶液、未添加浙貝母的陰性樣品溶液的液相色譜圖，作為參考。

2、指紋圖譜

將步驟1.6獲得供試品的指紋圖譜，與相同指紋圖譜檢測(cè)條件下獲得的胃可寧片的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行特征峰的比對(duì)、指紋圖譜相似度計(jì)算，從而對(duì)胃可寧片進(jìn)行質(zhì)量控制。其中，胃可寧片的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，是將上述至少10個(gè)批次的同一種供試品，按照相同指紋圖譜檢測(cè)條件下獲得的指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(國(guó)家藥典委員會(huì)，版本2009)，生成對(duì)照指紋圖譜獲得的。通過(guò)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)的計(jì)算，得到10批次胃可寧片樣品的整體相似度評(píng)價(jià)結(jié)果，整體相似度可以體現(xiàn)不同批次樣品間各成分在種類及其相對(duì)含量上的相似程度。當(dāng)10批胃可寧片的相似度均大于0.95以上，表明此指紋圖譜作為胃可寧片的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，可用于胃可寧片質(zhì)量控制。當(dāng)被檢樣品與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行相似度比較，當(dāng)相似度≥0.95，即為合格質(zhì)量的胃可寧片。

同時(shí)，此指紋圖譜中具有分離度較好和穩(wěn)定性較高的12個(gè)共有峰。通過(guò)與空白溶液、未添加珍珠層粉的陰性樣品溶液、未添加浙貝母的陰性樣品溶液的液相色譜圖對(duì)比，確定了12個(gè)共有峰的來(lái)源，其中1號(hào)峰和4號(hào)峰來(lái)源于浙貝母，5號(hào)峰來(lái)源于珍珠層粉，而其余9個(gè)峰共同來(lái)源了浙貝母和珍珠層粉。

實(shí)施例5

1、實(shí)驗(yàn)部分

1.1樣品前處理

供試品溶液的制備：與實(shí)施例1中的步驟1.1中的供試品溶液的制備過(guò)程相同。

1.2對(duì)照品前處理

對(duì)照品溶液的制備：與實(shí)施例3中的步驟1.2中的對(duì)照品溶液的制備過(guò)程相同。

1.3衍生化

供試品溶液的衍生化與實(shí)施例1的步驟1.2中的供試品溶液的衍生化過(guò)程相同。

對(duì)照品溶液的衍生化與實(shí)施例3的步驟1.3中的對(duì)照品溶液的衍生化過(guò)程相同。

1.4色譜條件

高效液相色譜法的色譜條件與實(shí)施例1的步驟1.3中的高效液相色譜法的色譜條件相同。

1.5測(cè)定

采用步驟1.4中的高效液相色譜法測(cè)定經(jīng)步驟1.3衍生化的供試品溶液和對(duì)照品溶液，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算供試品溶液中氨基酸類成分的含量，供試品溶液的液相色譜圖見(jiàn)圖5。通過(guò)與圖2中對(duì)照品溶液的液相色譜圖進(jìn)行比較，確定圖5中2號(hào)峰為甘氨酸(Glu)、3號(hào)峰為精氨酸(Arg)，6號(hào)峰為丙氨酸(Ala)，11號(hào)峰為亮氨酸(Leu)，12號(hào)峰為苯丙氨酸(Phe)。

2、方法學(xué)驗(yàn)證

2.1精密度

取批號(hào)為1501109的胃可寧片樣品1份，按步驟1.1制備供試品溶液，并按步驟1.3對(duì)供試品溶液進(jìn)行衍生化，再按步驟1.4的液相色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次。將測(cè)定結(jié)果與步驟1.5中的對(duì)照品溶液的液相色譜圖，進(jìn)行比較，從而獲得供試品溶液中氨基酸類成分的測(cè)定精密度。精密度具體結(jié)果見(jiàn)表3、4。結(jié)果表明，供試品溶液中氨基酸類成分所在特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值，均小于3％，供試品溶液中氨基酸類成分的測(cè)定精密度良好。

3.2重復(fù)性

取批號(hào)為1501109的胃可寧片樣品6份，按步驟1.1制備供試品溶液，并按步驟1.3對(duì)供試品溶液進(jìn)行衍生化，再按步驟1.4的液相色譜條件進(jìn)行測(cè)定。將測(cè)定結(jié)果與步驟1.5中的對(duì)照品溶液的液相色譜圖，進(jìn)行比較，從而獲得供試品溶液中氨基酸類成分的測(cè)定重復(fù)性。重復(fù)性具體結(jié)果見(jiàn)表5、6。結(jié)果表明，供試品溶液中氨基酸類成分所在特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值，均小于3％，供試品溶液中氨基酸類成分的測(cè)定重復(fù)性良好。

3.3穩(wěn)定性

取批號(hào)為1501109的胃可寧片樣品1份，按步驟1.1制備供試品溶液，并按步驟1.3對(duì)供試品溶液進(jìn)行衍生化，再按步驟1.4的液相色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別在0、1、2、4、6、8h測(cè)定。將測(cè)定結(jié)果與步驟1.5中的對(duì)照品溶液的液相色譜圖，進(jìn)行比較，從而獲得供試品溶液中氨基酸類成分的測(cè)定穩(wěn)定性。穩(wěn)定性具體結(jié)果見(jiàn)表7、8。結(jié)果表明，供試品溶液中氨基酸類成分所在特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值，均小于3％，供試品溶液中氨基酸類成分的測(cè)定穩(wěn)定性良好，可以在8h內(nèi)保持穩(wěn)定。

實(shí)施例6

1、實(shí)驗(yàn)部分

1.1樣品前處理

供試品溶液的制備：與實(shí)施例2中的步驟1.1中的供試品溶液的制備過(guò)程相同。

1.2對(duì)照品前處理

對(duì)照品溶液的制備：與實(shí)施例4中的步驟1.2中的對(duì)照品溶液的制備過(guò)程相同。

1.3衍生化

供試品溶液的衍生化與實(shí)施例2的步驟1.2中的供試品溶液的衍生化過(guò)程相同。

對(duì)照品溶液的衍生化與實(shí)施例4的步驟1.3中的對(duì)照品溶液的衍生化過(guò)程相同。

1.4色譜條件

高效液相色譜法的色譜條件與實(shí)施例2的步驟1.3中的高效液相色譜法的色譜條件相同。

1.5測(cè)定

采用步驟1.4中的高效液相色譜法測(cè)定經(jīng)步驟1.3衍生化的供試品溶液和對(duì)照品溶液，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算供試品溶液中氨基酸類成分的含量，供試品溶液的液相色譜圖見(jiàn)圖5。通過(guò)與圖2中對(duì)照品溶液的液相色譜圖進(jìn)行比較，確定圖5中2號(hào)峰為甘氨酸(Glu)、3號(hào)峰為精氨酸(Arg)，6號(hào)峰為丙氨酸(Ala)，11號(hào)峰為亮氨酸(Leu)，12號(hào)峰為苯丙氨酸(Phe)。

所以，本發(fā)明有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中的種種缺點(diǎn)而具高度產(chǎn)業(yè)利用價(jià)值。

上述實(shí)施例僅例示性說(shuō)明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。