本發(fā)明屬于食品檢測領(lǐng)域，具體涉及一種檢測動物內(nèi)臟中頭孢菌素類藥物殘留的方法，以及適用的樣品前處理方法。
背景技術(shù)：
：頭孢菌素類抗生素是一類具有β-內(nèi)酰胺環(huán)的半合成抗生素，自20世紀(jì)60年代初發(fā)明以來，由于其具有抗菌譜廣、抗菌力強(qiáng)、毒副作用小、過敏反應(yīng)少等特點(diǎn)，是目前世界上應(yīng)用最為廣泛，且發(fā)展最為迅速的一類抗感染藥物，現(xiàn)已有第1至第4代頭孢菌素類藥物共60多種，被廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外臨床。同時(shí)一些頭孢類抗生素也逐步用于獸藥中，用其治療呼吸疾病、細(xì)菌感染等，從而不可避免地引起動物組織或其產(chǎn)品中的殘留，對人類健康造成危害。目前，該類藥物在動物源食品中的殘留問題已引起了各國高度重視，中國、日本、美國、歐盟等國都已規(guī)定了動物源性食品中頭孢菌素類藥物殘留的最大殘留限量，嚴(yán)格控制頭孢菌素類抗生素在畜牧業(yè)中的應(yīng)用。其中日本最為嚴(yán)格，對動物肌肉組織中7種頭孢菌素類藥物(頭孢匹林、頭孢噻呋、頭孢氨芐、頭孢洛寧、頭孢唑林、頭孢喹諾、頭孢呋辛)制定了最高殘留限量，我國也規(guī)定了3種頭孢類藥物的最高殘留限量。為滿足進(jìn)出口貿(mào)易中日趨嚴(yán)格的殘留限量檢測要求，具備一種高效、準(zhǔn)確、靈敏度高的頭孢類藥物殘留檢測的方法尤為必要。目前，國內(nèi)外對動物源食品中頭孢類抗生素的檢測技術(shù)已有少量報(bào)道，但仍存在一些不足。一是涵蓋頭孢種類較少，在現(xiàn)有的國內(nèi)外文獻(xiàn)中β-內(nèi)酰胺類抗生素的檢測方法多針對青霉素類,頭孢類定量分析方法很少,且不成體系，只能同時(shí)檢測頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢唑林等少數(shù)幾種頭孢藥物殘留，不能滿足對多種頭孢類藥物同時(shí)檢測的實(shí)際需求。二是涉及的樣品基質(zhì)簡單，多集中在動物肌肉組織或牛奶中頭孢類殘留的測定，對于基質(zhì)復(fù)雜的動物內(nèi)臟組織少有涉及。三是現(xiàn)有的頭孢類藥物檢測方法中樣品前處理步驟復(fù)雜，時(shí)間過長，尤其是在內(nèi)臟組織中一些頭孢類化合物易降解為代謝物，從而導(dǎo)致待測化合物回收率偏低。因此，亟需開發(fā)出一種快速檢測頭孢類藥物的樣品前處理方法，尤其是適用于液-質(zhì)聯(lián)用檢測的高效靈敏的樣品前處理的方法，以滿足日趨嚴(yán)格的頭孢類藥物殘留限量檢測要求。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于現(xiàn)有技術(shù)中對動物源食品中頭孢菌素類藥物進(jìn)行檢測時(shí)采用的樣品前處理方法耗時(shí)長、涵蓋頭孢種類較少、基質(zhì)單一，進(jìn)而提供一種適用于同時(shí)、快速檢測動物內(nèi)臟中20種頭孢菌素類化合物的樣品前處理方法，尤其是適用于液-質(zhì)聯(lián)用檢測的樣品前處理方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種能夠快速檢測出動物內(nèi)臟中頭孢菌素類藥物的方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：本發(fā)明提供了一種檢測動物內(nèi)臟中20種頭孢菌素類藥物殘留的樣品前處理方法，其包括下述步驟：(1)取待檢測樣品，加入提取溶劑對所述待測樣品進(jìn)行提取，所述提取溶劑為乙腈和水的混合溶液；(2)離心，得上清液；(3)取上清液加載到固相萃取小柱上凈化，收集得第一流出液；所述固相萃取小柱為PRiMEHLB固相萃取小柱；(4)待第一流出液收集完畢，再取所述提取溶劑加載到所述固相萃取小柱上，收集得第二流出液，合并全部流出液；(5)將所述全部流出液經(jīng)濃縮、復(fù)溶和過濾步驟，得到待測樣液。進(jìn)一步地，在步驟(1)和步驟(4)中，所述提取溶劑乙腈和水的混合溶液中，乙腈和水的體積比為4:1-6:1。。在步驟(1)中，所述待測樣品與提取溶劑的質(zhì)量體積比為1g:4mL-1g:6mL。為了提高對頭孢菌素類藥物的提取效率，優(yōu)選的，在步驟(1)中，所述提取溶劑提取頭孢菌素類藥物的步驟是在超聲條件下進(jìn)行的，更優(yōu)選的，超聲的頻率為40kHz，提取時(shí)間為15-20min。進(jìn)一步地，在步驟(2)中，離心時(shí)，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速不低于8000r/min，離心8-10min。進(jìn)一步地，步驟(3)中，所述待凈化的上清液中所含樣品的量與所述固相萃取中PRiMEHLB填料的質(zhì)量比為1.75:1-2.25:1。進(jìn)一步地，所述步驟(5)中，所述濃縮步驟采用以氮?dú)獯蹈傻姆绞竭M(jìn)行，溫度低于45℃。所述復(fù)溶步驟是采用水溶液。所述過濾采用孔徑為0.22μm濾膜。本發(fā)明所述方法可針對20種頭孢菌素類藥物，包括：頭孢氨芐、頭孢羥氨芐、頭孢唑啉、頭孢氨噻肟、頭孢吡肟、頭孢克肟、頭孢克洛、頭孢孟多鋰、頭孢拉定、頭孢匹羅、頭孢米諾、頭孢哌酮、頭孢尼西、頭孢呋辛、頭孢喹諾、頭孢匹林、頭孢噻呋、頭孢洛寧、去乙?；^孢匹林和脫呋喃甲?；^孢噻呋。進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供一種液-質(zhì)聯(lián)用檢測動物內(nèi)臟中20種頭孢菌素類藥物殘留的方法，其包括下述步驟：(a)按照上面所述的樣品前處理方法對動物內(nèi)臟樣品進(jìn)行前處理，得到所需的待測樣品；(b)采用超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀對動物內(nèi)臟中含有的頭孢菌素進(jìn)行檢測。進(jìn)一步地，步驟(b)中，所述高效液相色譜的檢測條件為：色譜柱：ThermoHypersilGoldC182.1×100mm，1.9μm；柱溫：30℃；流動相A：甲醇，流動相B：5mmol/L醋酸銨水溶液(含0.01％甲酸)；流速：0.20mL/min；進(jìn)樣量：10μL；洗脫方式：梯度洗脫；所述三重四級桿質(zhì)譜的檢測條件為：質(zhì)量分析器：三重四級桿；離子源：ESI+；噴霧電壓：4.5kV；鞘氣流速：40arb；輔助氣流速：10arb；毛細(xì)管溫度：327℃。所述高效液相色譜的梯度洗脫程序?yàn)椋罕景l(fā)明的有益效果如下：(1)本發(fā)明所述的樣品前處理方法，以乙腈-水(4:1-6:1，V:V)的混合溶液對樣品中頭孢菌素類化合物進(jìn)行提取，若水的含量太少，影響頭孢鈉鹽的提取效率，若水的含量太高，固相萃取小柱對目標(biāo)物產(chǎn)生吸附，回收率降低。(2)本發(fā)明所述的樣品前處理方法，利用PRiMEHLB固相萃取小柱對樣品進(jìn)行凈化處理，能夠去除樣品中蛋白、鹽、磷脂等基質(zhì)干擾物，此外，該固相萃取小柱無需活化、平衡、淋洗、洗脫步驟，解決了現(xiàn)有技術(shù)中樣品前處理步驟復(fù)雜，時(shí)間過長，待測化合物易降解的問題。(3)本發(fā)明所述樣品前處理方法，當(dāng)固相萃取小柱填料的質(zhì)量為200mg時(shí)，所述取部分待凈化的上清液中所含樣品的質(zhì)量為0.35-0.45g，并優(yōu)選0.4g，既避免了上樣體積中所含樣品量過大，固相萃取小柱過載，也保證了待測化合物的檢測低限要求。(4)本發(fā)明所述樣品前處理方法，當(dāng)固相萃取小柱填料的質(zhì)量為200mg時(shí)，待所述第一流出液收集完畢后，再取0.8-1mL乙腈和水的混合溶液加載到所述固相萃取小柱上，將殘留在固相萃取小柱中的凈化后的液體置換出來，從而減少目標(biāo)化合物的損失，提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。(5)本發(fā)明所述濃縮步驟采用氮?dú)獯蹈傻姆绞?，不僅可以同時(shí)對多個(gè)樣品進(jìn)行濃縮處理，效率較高，而且相較于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方式，氮?dú)獯蹈筛m用于少量樣品，并避免了樣品在轉(zhuǎn)移中的浪費(fèi)而造成的實(shí)驗(yàn)誤差。(6)本發(fā)明所述樣品前處理方法，采用孔徑為0.22μm濾膜進(jìn)行過濾，以防止樣品中含有大粒徑雜質(zhì)分子而對色譜的損壞，同時(shí)也在一定程度上起到凈化樣品的作用。(7)本發(fā)明采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測所述待測樣品中含有的頭孢菌素類藥物，該檢測方法具有干擾性小、檢出限低、靈敏度高、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，適于對抗生素的痕量檢測。為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。附圖說明圖1為本發(fā)明所述液-質(zhì)聯(lián)用檢測20種頭孢菌素類藥物的工藝流程圖。圖2為本發(fā)明豬肝陰性樣品添加20種頭孢菌素類藥物的提取離子流圖，其中，A到T分別代表20種頭孢菌素的提取離子流圖。圖3為實(shí)施例2中脫呋喃甲?；^孢噻呋的提取離子流圖。圖4為對比例1和實(shí)施例1中20種頭孢菌素類藥物的添加回收率對比。具體實(shí)施方式為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。1.儀器與試劑：UHPLC-QuantumUltra型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國ThermoFisher公司)；氮吹儀(美國Organomation公司)；微孔濾膜(0.22μm，美國Pall公司)；超聲波清洗器(江蘇昆山超聲儀器有限公司)；渦旋混勻器(德國IKA公司)；高速離心機(jī)(德國Sigma公司)；ThermoHypersilGoldC182.1×100mm，1.9μm色譜柱(美國ThermoFisher公司)；20種頭孢菌素類藥物的標(biāo)準(zhǔn)品均購自加拿大TRC公司，各自用乙腈：水(50：50)配制成1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置-20℃冰箱中保存，保存期不超過一年，分別量取各標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用乙腈：水(50：50)配置成1.0μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，-20℃冰箱中保存，保存期不超過三個(gè)月。甲醇、乙腈、甲酸(色譜純)，均購自美國FisherChemical公司；乙酸銨(色譜純，購自北京百靈威科技有限公司；PRiMEHLB固相萃取小柱購自Waters公司(OasisPRiMEHLB，6cc200mg)；實(shí)驗(yàn)用水均由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。2.質(zhì)譜條件的優(yōu)化20種頭孢菌素類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度均為1.0μg/mL)在電噴霧正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，確定準(zhǔn)分子離子峰，除頭孢呋辛和頭孢尼西的[M+NH4]+準(zhǔn)分子離子峰的響應(yīng)明顯強(qiáng)于[M+H]+，其它化合物均得到相應(yīng)的[M+H]+峰。以準(zhǔn)分子離子峰為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，選擇相對豐度較高的2個(gè)碎片離子作為定量和定性離子，分別優(yōu)化各個(gè)離子對的管狀透鏡電壓和碰撞能量，其最優(yōu)條件見表1。表120種頭孢菌素類藥物的MRM質(zhì)譜參數(shù)*：定量離子(quantitativeion)3.基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍用空白豬肝、羊腎提取液配制一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述分析條件進(jìn)行測定,以峰面積對濃度進(jìn)行線性回歸計(jì)算，結(jié)果(見表2)表明：20種頭孢菌素的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99。表220種頭孢菌素類藥物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)實(shí)施例1樣品的測定本實(shí)施例所述動物內(nèi)臟樣品為加入20種頭孢菌素類藥物標(biāo)準(zhǔn)品的牛肝臟陰性樣品，加標(biāo)量均為50μg/kg，所述液-質(zhì)聯(lián)用檢測動物內(nèi)臟中20種頭孢菌素類化合物的方法，具體包括如下步驟：a、樣品的前處理，并具體包括如下步驟：(1)稱取2g牛肝臟陰性樣品，將20種頭孢菌素類藥物的混合工作液加入到樣品中，控制加標(biāo)量為50μg/kg，渦旋混勻，放置30min左右，之后加入10mL乙腈-水(4:1，V:V)混合溶液，渦旋30s，在40kHz的超聲波下提取20min，取出后以8000r/min離心10min。(2)取2mL上清液加載到PRiMEHLB固相萃取小柱上(PRiMEHLB固相萃取小柱的規(guī)格為200mg，6cc)，保持一秒一滴的流速，收集得第一流出液，待第一流出液收集完畢后，再取1mL乙腈-水(4:1，V:V)混合溶液加載到該柱上，收集得第二流出液，合并全部流出液。(3)將流出液氮吹濃縮至少于0.5mL(溫度低于45℃)，用水定容至0.5mL，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，制得待測樣品。b、采用超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀對所述待測樣品中含有的頭孢菌素進(jìn)行檢測：(1)所述高效液相色譜條件為：色譜柱：ThermoHypersilGoldC182.1×100mm，1.9μm；柱溫：30℃；流動相A：甲醇，流動相B：5mmol/L醋酸銨水溶液(含0.01％甲酸)；梯度洗脫程序：流速為0.2mL/min；進(jìn)樣體積：10.0μL。(2)所述質(zhì)譜條件為：質(zhì)量分析器：三重四級桿；離子源：ESI+；檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)；噴霧電壓：4.5kV；鞘氣流速：40arb；輔助氣流速：10arb；毛細(xì)管溫度：327℃。其中，監(jiān)測離子對、管狀透鏡電壓和碰撞能量等參數(shù)如表1所示。檢測結(jié)果見圖2，表明了采用本發(fā)明方法進(jìn)行樣品的前處理，并采用超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測，實(shí)現(xiàn)了對20種頭孢菌素類藥物的同時(shí)檢出。實(shí)施例2樣品測定本實(shí)施例所述動物內(nèi)臟樣品為雞腎臟陽性樣品，所述液-質(zhì)聯(lián)用檢測動物內(nèi)臟中20種頭孢菌素類方法的方法，具體包括如下步驟：(1)稱取2g雞腎臟陽性樣品，加入12mL乙腈-水(4:1，V:V)混合溶液，渦旋30s，在40kHz的超聲波下提取20min，取出后以8000r/min離心10min。(2)取2.5mL上清液加載到OasisPRiMEHLB固相萃取小柱上(PRiMEHLB固相萃取小柱的規(guī)格為200mg，6cc)，保持一秒一滴的流速，收集得第一流出液，待第一流出液收集完畢后，再取1mL乙腈-水(4:1，V:V)混合溶液加載到該柱上，收集得第二流出液，合并全部流出液。(3)將流出液氮吹濃縮至少于0.5mL(溫度低于45℃)，用水定容至0.5mL，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，制得待測樣品。b、采用超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀對所述待測樣品中含有的頭孢類藥物進(jìn)行檢測：(1)所述高效液相色譜條件為：色譜柱：ThermoHypersilGoldC182.1×100mm，1.9μm；柱溫：30℃；流動相A：甲醇，流動相B：5mmol/L醋酸銨水溶液(含0.01％甲酸)；梯度洗脫程序：Time(min)A(％)B(％)010901.010906.0406011901013901013.11090151090流速為0.2mL/min；進(jìn)樣體積：10.0μL。(2)所述質(zhì)譜條件為：質(zhì)量分析器：三重四級桿；離子源：ESI+；檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)；噴霧電壓：4.5kV；鞘氣流速：40arb；輔助氣流速：10arb；毛細(xì)管溫度：327℃。其中，監(jiān)測離子對、管狀透鏡電壓和碰撞能量等參數(shù)如表2所示。檢測結(jié)果見圖3，表明在該雞腎臟樣品中含有脫呋喃甲酰基頭孢噻呋，并采用外標(biāo)法以峰面積定量，測得該及腎臟樣品中脫呋喃甲酰基頭孢噻呋的含量為535ug/kg實(shí)施例3方法的驗(yàn)證回收率和精密度在空白豬肝、豬腎、雞肝、雞腎、牛肝和羊腎樣品中分別添加低中高3個(gè)不同水平混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率試驗(yàn)。每個(gè)添加水平平行實(shí)驗(yàn)6次，平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見表3。20種頭孢菌素類藥物回收率介于70％～120％之間，精密度(RSD)＜16.4％，符合殘留檢測要求，重現(xiàn)性較好。表3豬肝、豬腎、雞肝、雞腎、牛肝和羊腎中添加20種頭孢菌素類藥物的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差對比例1本對比例所述樣品為實(shí)施例1中牛肝臟陰性樣品添加20種頭孢菌素類藥物標(biāo)準(zhǔn)品量為50μg/kg制得，采用與實(shí)施例1完全相同的超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀對所述待測樣品中含有的頭孢菌素進(jìn)行檢測，區(qū)別僅在于樣品的前處理方法不同。本對比例采用的樣品前處理方法，其具體步驟為：(1)稱取2g牛肝臟陰性樣品，將20種頭孢菌素的混合工作液加入到樣品中，控制加標(biāo)量為50μg/kg，渦旋混勻，放置30min左右，之后加入10mL乙腈-水(4:1，V:V)混合溶液，渦旋30s，在40kHz的超聲波下提取20min，取出后以8000r/min離心10min。(2)取全部上清液在低于45℃條件下減壓濃縮至少于2mL，待固相萃取小柱凈化。(3)將濃縮液加載到活化好的HLB固相萃取小柱上(HLB固相萃取小柱的規(guī)格為200mg，6cc；加載前依次用5mL甲醇、5mL水活化)，保持一秒一滴的流速，待樣液完全流出后，用5mL水洗柱，棄去流出液。再用5mL甲醇洗脫，收集全部流出液。(4)將流出液氮吹濃縮至近干(溫度低于45℃)，用水定容至1.0mL，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，制得待測樣品。用此前處理方法測得的牛肝臟中頭孢菌素的添加回收率與實(shí)施例1中相比，20種目標(biāo)物的添加回收明顯下降(見圖4)，其中，頭孢克洛的回收率僅為23.2％。因此，采用上述樣品前處理方法，不僅步驟繁瑣，還會導(dǎo)致部分化合物回收率偏低，測得結(jié)果不準(zhǔn)確。顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實(shí)施方式的限定，對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這里無法對所有的實(shí)施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。當(dāng)前第1頁1 2 3