本發(fā)明涉及一種測定硒含量的方法，尤其涉及一種測定富硒酵母中有機硒和無機硒含量的方法。

背景技術：

硒具有抗氧化、抗腫瘤等多種生理功能，是動物的重要營養(yǎng)元素之一，廣泛用于飼料添加劑中，硒的主要添加形式有無機亞硒酸鈉鹽和有機硒酵母，亞硒酸鈉毒性高、不易被動物吸收利用，易造成浪費和環(huán)境污染，目前大多數(shù)地區(qū)已被禁止使用，而硒酵母由于其代謝周期長，生物利用率高，毒性低等特點。硒酵母中主要是以-2價存在的硒蛋白、核酸、多脂類的有機硒，和少量的亞硒酸鈉、硒酸鈉。因此，檢測硒酵母中無機硒和有機硒的含量，在飼料安全使用中具有重要意義。

目前，硒酵母作為一種重要飼料添加劑，總硒的測定方法主要有二氨基聯(lián)苯紫外分光光度法、原子熒光分光光度法、電感耦合等離子法，其中氫化物原子熒光光度法已引入國家標準法中；有機硒的測定方法目前還沒有唯一標準，報道較多的主要有質(zhì)譜-高效液相色譜法，衍生-高效液相色譜法，ICP-MS(Rajani Jagtap，2016)或HPLC-HG-AFS(王金榮，2013)等，但這些方法對儀器要求較高，試劑昂貴，一般實驗室難以實現(xiàn)，操作繁瑣，測試周期較長，且成本較高不適合廣泛推廣，此外，還有一些方法采用有機緩沖溶液浸提、透析分離的方法測定有機硒(高建忠，2006)，但這種方法耗時較長。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足之處而提供一種測定時間短、簡單且易于實施的測定富硒酵母中無機硒含量的方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種測定富硒酵母中有機硒含量的方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術方案為：

一種測定富硒酵母中無機硒的含量的方法，包括以下步驟：

(1)稱取富硒酵母，向富硒酵母中加入強堿溶液，超聲，使富硒酵母溶解，再進行水浴加熱；其中，所述富硒酵母的質(zhì)量與強堿溶液中氫氧根離子的物質(zhì)的量的比為1g：15～35mmol(即按照每克富硒酵母中加入15～35mmol強堿溶液的比例，向富硒酵母中加入強堿溶液；其中，強堿溶液中強堿的物質(zhì)的量按強堿中氫氧根離子的物質(zhì)的量計)；

(2)加熱完后，進行冷卻，再離心，取上清液；

(3)調(diào)節(jié)步驟(2)所得上清液的酸度，至上清液的pH值為4～5，靜置后過濾，得到濾液；

(4)向步驟(3)所得濾液中加入6～12mol/L的鹽酸水溶液，煮沸后進行稀釋，采用原子熒光光度計測定稀釋所得溶液中的無機硒的含量。

作為本發(fā)明所述測定富硒酵母中無機硒的含量的方法的優(yōu)選實施方式，其中，在所述步驟(1)中，所述強堿溶液為氫氧化鈉溶液、氫氧化鉀溶液中的至少一種。更優(yōu)選地，所述強堿溶液為氫氧化鈉溶液。更優(yōu)選地，所述氫氧化鈉水溶液的濃度為0.15～0.35mol/L，更優(yōu)選地，所述氫氧化鈉水溶液的濃度為0.25mol/L。值得注意的是，氫氧化鈉的濃度對硒酵母中無機硒的提取效果影響較大，經(jīng)過大量的實驗，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當氫氧化鈉水溶液的濃度在0.15～0.35mol/L的范圍內(nèi)，都能取得較為理想的提取效果。

作為本發(fā)明所述測定富硒酵母中無機硒的含量的方法的優(yōu)選實施方式，其中，在所述步驟(1)中，所述水浴溫度為45～65℃，當水浴溫度在該范圍內(nèi)時，對于富硒酵母中無機硒的提取效果影響較小。更為優(yōu)選地，所述水浴溫度為65℃。

在所述步驟(1)中，水浴時間取決于水浴溫度，在可選擇的范圍(即45～65℃)內(nèi)，當溫度相對較高時，水浴時間相對較短，反之。但是，當水浴時間超過30分鐘，對于富硒酵母中無機硒提取的效果并沒有明顯的提高。

作為本發(fā)明所述測定富硒酵母中無機硒的含量的方法的優(yōu)選實施方式，其中，在所述步驟(3)中，將上清液的pH調(diào)至4.5，這是因為pH＝4.5是富硒酵母中蛋白質(zhì)的等電點，在該pH下，富硒酵母中蛋白質(zhì)的溶解度最小。更為優(yōu)選地，用鹽酸將上清液的pH調(diào)至4.5，從而避免過多物質(zhì)引入待檢測的溶液中。

作為本發(fā)明所述測定富硒酵母中無機硒的含量的方法的優(yōu)選實施方式，其中，原子熒光光度計的工作參數(shù)設置為：儀器工作負高壓：280V，空心陰極燈電流：80mA，載氣流量：400mL/min，屏蔽氣流量：900mL/min，原子化爐高度：8mm，讀數(shù)時間：15s，延遲時間：3s，載液：5％HCl(質(zhì)量百分比濃度)，還原劑：2％KBH₄+0.5％NaOH。

值得注意的是，原子熒光光度原理上只能測定+4價硒的含量，富硒酵母中存在+6，+4，-2價三種硒形態(tài)，其中-2價存在的為有機硒(大量硒蛋白、少量核酸)，+6、+4價的為可溶性無機硒鹽(硒酸鹽、亞硒酸鹽)，在所述步驟(1)中，在富硒酵母的樣品中加入強堿溶液(比如，氫氧化鈉水溶液、氫氧化鉀水溶液)，在一定溫度下能有效的改變富硒酵母細胞壁結構，增強通透性，從而提高富硒酵母中無機硒的提取效果。此外，在所述步驟(3)中，通過將pH調(diào)至富硒酵母中蛋白質(zhì)的等電點，可去除提取液中的可溶性硒蛋白，從而避免-2價硒對+4價硒含量測定的干擾(-2價硒對+4價硒含量測定的有微弱的干擾)。另外，在所述步驟(5)中，在加入鹽酸并加熱的條件下，能將富硒酵母的樣品中+6價硒還原為+4價，從而通過氫化物原子熒光光譜法測定出無機硒含量。

此外，本發(fā)明還公開了一種測定富硒酵母中有機硒的含量的方法，其技術方案如下：

一種測定富硒酵母中有機硒的含量的方法，包括以下步驟：

(a)測定富硒酵母中總硒的含量；

(b)根據(jù)上述方法測定富硒酵母中無機硒的含量；

(c)計算硒酵母中有機硒含量：計算富硒酵母中有機硒含量：將步驟(a)測得的硒酵母中總硒含量減去步驟(b)測得的富硒酵母中無機硒含量，所得的差值即為富硒酵母中有機硒含量。

其中，在所述步驟(a)中，對于總硒含量的測定，可以采用本領域已知的測定方法。作為本發(fā)明所述測定富硒酵母中有機硒的含量的方法的優(yōu)選實施方式，測定總硒含量的方法為GB/T13883-2008《飼料中硒的測定》中記載的“氫化物原子熒光光譜法(即，HG-AFS法)”，具體步驟如下：

(1)稱取富硒酵母，按照每克富硒酵母中加入7.5mL混合酸的比例，向富硒酵母中加入混合酸，消化過夜；其中，所述混合酸由硝酸和高氯酸組成，所述硝酸和高氯酸的體積比為4:1；

(2)加熱消化所得的溶液，至溶液中高氯酸冒煙；

(3)冷卻，加入2.5mL鹽酸，繼續(xù)加熱至高氯酸冒煙，冷卻；

(4)將步驟(3)冷卻后所得溶液移入50mL容量瓶，定容；

(5)取20mL步驟(4)所得溶液至50mL容量瓶中，加入8mL鹽酸和2mL濃度為200g/L的鐵氰化鉀溶液，用水稀釋至刻度，得到上樣液，再采用原子熒光光度計測定上樣液中的總硒含量。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的技術方案具有以下有益效果：

1、本發(fā)明所述的測定硒酵母中無機硒含量的方法通過堿熱法(比如，用氫氧化鈉加熱提取的方法)提高了無機硒的提取率，并通過調(diào)節(jié)pH至蛋白質(zhì)等電點減少了有機硒對于無機硒含量測定的干擾，從而提高了無機硒含量測定的準確度。

2、本發(fā)明采用一般的酸堿試劑以及常見儀器，在一般實驗室均可實現(xiàn)富硒酵母中無機硒和有機硒含量的測定；此外，本發(fā)明采用強堿溶液(比如，氫氧化鈉溶液)提取富硒酵母中無機硒的浸提法提取速度快，用時短，測定時間過程不超過1小時。

3、本發(fā)明所述的測定富硒酵母中無機硒的方法操作簡單，精密度高，回收率好，在優(yōu)化條件下，無機硒的檢出限為0.0201μg/L，線性范圍為0～40μg/L，通過加標回收實驗，無機硒回收率為79.6％～85.9％。

4、本發(fā)明所述的測定富硒酵母中有機硒含量的方法通過HG-AFS(氫化物發(fā)生-原子熒光光譜)方法測定富硒酵母中總硒、無機硒的含量，結合差減法(即，有機硒含量＝總硒含量-無機硒含量)計算有機硒含量，從而簡化了有機硒含量測定的步驟，縮短了測定時間。

附圖說明：

圖1為本發(fā)明測定富硒酵母中無機硒標準溶液得到的標準曲線；

圖2為氫氧化鈉濃度對無機硒提取量的影響趨勢圖。

具體實施方式

為更好的說明本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點，下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。

下述實施例中，所用到的材料與方法如下：

材料與試劑：硼氫化鉀，濃鹽酸、濃硝酸、高氯酸(均為優(yōu)級純，即市售的未經(jīng)稀釋的酸)，高純水，硒標準溶液(國家標準物質(zhì)中心)?；旌纤幔合跛帷酶呗人幔?∶1(原液體積比，總硒含量測定消解用)，硼氫化鉀溶液(原子熒光分光光度計儀器反應液)：稱取1g氫氧化鈉加200mL水使其充分溶解，再加入4g硼氫化鉀混合均勻，現(xiàn)配先用。

儀器與AFS-2000原子熒光分光光度計(北京科創(chuàng)海光有限公司)，數(shù)顯恒溫浴鍋(上海申勝生物技術有限公司)，超聲波清洗器(上?？茖С晝x器有限公司)，恒溫電熱板(Lab-TechEH20B)，低速離心機(金壇鴻科儀器HDL-4)。

實施例中，原子熒光光度計最佳工作條件：儀器工作負高壓：280V，空心陰極燈電流：80mA，載氣流量：400mL/min，屏蔽氣流量：900mL/min，原子化爐高度：8mm，讀數(shù)時間：15s，延遲時間：3s，載液：5％HCl(質(zhì)量百分比濃度)，還原劑：2％KBH₄+0.5％NaOH(1g氫氧化鈉加200mL水使其充分溶解，再加入4g硼氫化鉀混合均勻而得到的水溶液)。

儀器精密度與檢出限：按照儀器的最佳條件，硒的最佳線性線性范圍為0～40μg/L，將硒標準溶液(國家標準物質(zhì)中心)稀釋為0μg/L、10μg/L、20μg/L、40μg/L，鹽酸定容，按照以上工作條件測定硒含量的標準曲線(參見圖1)，其相關系數(shù)R²＝0.9999通過對10μg/L標準硒測定5次，得到RSD＝2.8％，該方法有較好的精密度。同時，對11組空白進行測量，按3倍標準偏差得到檢出限(3δ)為0.0201μg/L。

表1精確度測試

富硒酵母中無機硒的含量的測定：

(1)每1g富硒酵母中加入含有15～35mmol氫氧化鈉的氫氧化鈉水溶液，通過超聲使富硒酵母充分溶解；

(2)在溫度為45～65℃的條件下，至少水浴30分鐘后迅速冷卻；

(3)離心，取上清液，用鹽酸調(diào)pH至4.5并靜置至少5分鐘；

(4)將步驟(3)所得混合液用濾紙過濾后，取濾液，向其中加入濃鹽酸，煮沸2分鐘；

(5)將步驟(4)所得混合液用水稀釋至合適濃度，采用原子熒光光度計測定無機硒含量。

實施例1

(1)在0.1g富硒酵母中加入10mL 0.25mol/L的氫氧化鈉水溶液，通過超聲使富硒酵母充分溶解；

(2)在溫度為65℃的條件下，水浴30分鐘后迅速冷卻；

(3)4000r/min離心10分鐘，取上清液，用1mol/L的鹽酸調(diào)pH至4.5并靜置5分鐘；

(4)將步驟(3)所得混合液用濾紙過濾后，取濾液，向其中加入5mL濃鹽酸，煮沸2分鐘；

(5)將步驟(4)所得混合液用水稀釋至合適濃度，采用原子熒光光度計測定無機硒含量。

實施例2

(1)在0.1g富硒酵母中加入10mL 0.25mol/L的氫氧化鈉水溶液，通過超聲使富硒酵母充分溶解；

(2)在溫度為45℃的條件下，水浴30分鐘后迅速冷卻；

(3)4000r/min離心10分鐘，取上清液，用1mol/L的鹽酸調(diào)pH至4.5并靜置5分鐘；

(4)將步驟(3)所得混合液用濾紙過濾后，取濾液，向其中加入5mL濃鹽酸，煮沸2分鐘；

(5)將步驟(4)所得混合液用水稀釋至合適濃度，采用原子熒光光度計測定無機硒含量。

實施例3

(1)在0.1g富硒酵母中加入10mL 0.25mol/L的氫氧化鈉水溶液，通過超聲使富硒酵母充分溶解；

(2)在溫度為50℃的條件下，水浴30分鐘后迅速冷卻；

(3)4000r/min離心10分鐘，取上清液，用1mol/L的鹽酸調(diào)pH至4.5并靜置5分鐘；

(4)將步驟(3)所得混合液用濾紙過濾后，取濾液，向其中加入5mL濃鹽酸，煮沸2分鐘；

(5)將步驟(4)所得混合液用水稀釋至合適濃度，采用原子熒光光度計測定無機硒含量。

實施例4：不同濃度的氫氧化鈉水溶液對無機硒提取效果的影響

準確稱取0.1g富硒酵母5份，置于三角瓶中，按實施例1所述步驟進行無機硒含量的測定，區(qū)別僅在于這5份樣品中分別加入0.15mol/L、0.2mol/L、0.25mol/L、0.3mol/L、0.35mol/L的氫氧化鈉水溶液10mL。

如圖2所示，氫氧化鈉濃度在0.25mol/L時，提取率最高。

實施例5

(1)在0.1g富硒酵母中加入10mL 0.25mol/L的氫氧化鈉水溶液，通過超聲使富硒酵母充分溶解；

(2)在溫度為65℃的條件下，水浴30分鐘后迅速冷卻；

(3)4000r/min離心10分鐘，取上清液，用1mol/L的鹽酸調(diào)pH至4.0并靜置5分鐘；

(4)將步驟(3)所得混合液用濾紙過濾后，取濾液，向其中加入5mL濃鹽酸，煮沸2分鐘；

(5)將步驟(4)所得混合液用水稀釋至合適濃度，采用原子熒光光度計測定無機硒含量。

實施例6

(1)在0.1g富硒酵母中加入10mL 0.25mol/L的氫氧化鈉水溶液，通過超聲使富硒酵母充分溶解；

(2)在溫度為65℃的條件下，水浴30分鐘后迅速冷卻；

(3)4000r/min離心10分鐘，取上清液，用1mol/L的鹽酸調(diào)pH至5.0并靜置5分鐘；

(4)將步驟(3)所得混合液用濾紙過濾后，取濾液，向其中加入5mL濃鹽酸，煮沸2分鐘；

(5)將步驟(4)所得混合液用水稀釋至合適濃度，采用原子熒光光度計測定無機硒含量。

實施例7

(1)在0.1g富硒酵母中加入10mL 0.25mol/L的氫氧化鉀水溶液，通過超聲使富硒酵母充分溶解；

(2)在溫度為65℃的條件下，水浴30分鐘后迅速冷卻；

(3)4000r/min離心10分鐘，取上清液，用1mol/L的鹽酸調(diào)pH至4.5并靜置5分鐘；

(4)將步驟(3)所得混合液用濾紙過濾后，取濾液，向其中加入10mL6mol/L的鹽酸水溶液，煮沸2分鐘；

(5)將步驟(4)所得混合液用水稀釋至合適濃度，采用原子熒光光度計測定無機硒含量。

實施例8：

分別取同種富硒酵母5份，按本發(fā)明方法進行無機硒含量的測定，經(jīng)計算，該測定方法的相對標準偏差為5.29％(如表2所示)。

表2無機硒的測定含量

實施例9：樣品中無機硒測定結果

分別稱取3種不同市售的富硒酵母0.1g，每種富硒酵母取2份，各取一份并分別加入2.5μg，5μg，7.5μg無機硒(國家標準溶液硒經(jīng)稀釋得到)，剩下的3份中不加，按照實施例2所述的方法測定其無機硒的含量，結果如下表3所示。其中，回收率按照公式1進行計算。

公式1：

加標回收率＝(加標試樣測定值-空白試樣測定值)÷加標量×100％.

表3無機硒回收率的測定

由上表3可以看出，測定富硒酵母樣品中無機硒的含量時，使用本發(fā)明所述的方法具有較高的回收率，這表明本發(fā)明所述的方法對富硒酵母中無機硒的測定準確度較高。

實施例10

總硒含量測定方法：

按GB/T13883-2008《飼料中硒的測定》中記載的“氫化物原子熒光光譜法測定”，具體步驟如下：

(1)稱取富硒酵母2.0g，準確到0.0001g，置于100mL燒杯中，加入15.0mL體積比為4:1的硝酸和高氯酸的混合溶液，消化過夜；

(2)次日在電熱板上加熱，當溶液高氯酸冒煙時，繼續(xù)加熱至溶液體積為2mL左右，切不可蒸干；

(3)冷卻，加入2.5mL鹽酸，用水吹洗表面皿和杯壁，繼續(xù)加熱至高氯酸冒煙時，冷卻；

(4)將步驟(3)所得溶液移入50mL容量瓶，用水稀釋至刻度；

(5)取20mL步驟(4)所得溶液至50mL容量瓶，加入8mL鹽酸和2mL200g/L的鐵氰化鉀溶液，用水稀釋至刻度，隨后采用原子熒光光度計測定稀釋所得溶液中的總硒的含量。

實施例11

有機硒含量：通過差減法，即，有機硒含量＝總硒含量-無機硒含量。

實施例12

采用本發(fā)明所述的方法對市售的3種不同富硒酵母進行分析測定，結果如下表4所示。

表4富硒酵母中有機硒和無機硒的測定

根據(jù)《飼料添加劑安全使用規(guī)范》規(guī)定，酵母硒中無機硒含量不得超過2％。由表4可知，根據(jù)本發(fā)明所述的方法進行測定，市售的3種富硒酵母均符合規(guī)定。

最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的實質(zhì)和范圍。