本發(fā)明涉及化學(xué)分析技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及表面增強(qiáng)拉曼光譜基底和樣品的制備方法。

背景技術(shù)：

拉曼光譜和紅外光譜一樣同屬于分子振動(dòng)光譜，可以反映分子的特征結(jié)構(gòu)。但是拉曼散射效應(yīng)是個(gè)非常弱的過(guò)程，一般其光強(qiáng)僅約為入射光強(qiáng)的10^-8。所以拉曼信號(hào)都很弱，要對(duì)表面吸附物種進(jìn)行拉曼光譜研究幾乎都要利用某種增強(qiáng)效應(yīng)。

表面增強(qiáng)拉曼光譜(Surface-enhanced Raman Scattering，SERS)自1974年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，通過(guò)利用金、銀等納米粒子的巨大電磁場(chǎng)增強(qiáng)效應(yīng)，可以使接近或吸附于納米粒子表面物質(zhì)的拉曼信號(hào)得到百萬(wàn)倍以上的增強(qiáng)。與常規(guī)拉曼相比，具有極高的檢測(cè)靈敏度，可達(dá)到痕量甚至單分子檢測(cè)水平。由于SERS檢測(cè)依賴納米尺度的金屬表面，因此，制備一種增強(qiáng)效應(yīng)高，并具有高度均勻性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性的SERS活性基底成為SERS檢測(cè)應(yīng)用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

目前，SERS基底的制備方法已經(jīng)從早期電化學(xué)氧化還原粗糙法發(fā)展到納米粒子合成、納米粒子有序組裝和有序納米結(jié)構(gòu)制備(如納米平板印刷術(shù))。相比電化學(xué)粗糙法，納米粒子的出現(xiàn)使SERS基底的制備更為靈活，可以將具有SERS增強(qiáng)活性的金、銀等金屬顆粒與待測(cè)基底混勻后滴于玻璃、硅片等無(wú)孔載體上，空氣中自然干燥后進(jìn)行SERS檢測(cè)，但是由于該方法制備的基底厚度不均勻，形狀不規(guī)整，信號(hào)均勻性和重復(fù)性不高。有序組裝納米粒子或制備有序納米結(jié)構(gòu)使得SERS信號(hào)的均勻性和重復(fù)性獲得了很大的提高，但由于制備工藝復(fù)雜，時(shí)間長(zhǎng)，且需要特殊或昂貴的專業(yè)儀器設(shè)備，對(duì)于操作人員的技術(shù)熟練度要求較高，廣泛應(yīng)用受到限制?，F(xiàn)有的商品化SERS基底，價(jià)格較高，而且SERS活性隨時(shí)間衰減，對(duì)于需要大批量基底的檢測(cè)，應(yīng)用存在局限性。

綜上所述，SERS基底信號(hào)均勻性通常不高，而均勻性高的SERS基底的制備工藝復(fù)雜，技術(shù)要求高，并且商業(yè)化SERS基底價(jià)格昂貴，這些問(wèn)題都極大限制了SERS技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室或?qū)嶋H檢測(cè)中的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供表面增強(qiáng)拉曼光譜基底和樣品的制備方法。本發(fā)明提供的制備方法工藝簡(jiǎn)單，制備的表面增強(qiáng)拉曼光譜基底和樣品具有高均勻性和重復(fù)性。

本發(fā)明提供了一種表面增強(qiáng)拉曼光譜基底的制備方法，包括以下步驟：

(1)將金屬納米顆粒與水混合，得到金屬納米顆粒分散液，所述金屬納米顆粒包括金納米顆粒和/或銀納米顆粒；

(2)將所述步驟(1)得到的金屬納米顆粒分散液置于濾膜表面，真空抽濾得到表面增強(qiáng)拉曼光譜基底。

優(yōu)選的，所述步驟(2)中濾膜的孔徑不超過(guò)0.1μm。

優(yōu)選的，所述步驟(2)中濾膜的材質(zhì)包括聚砜、聚醚砜、混合纖維素酯、聚偏二氟乙烯、碳酸酯或聚四氟乙烯。

優(yōu)選的，所述步驟(2)中真空抽濾的真空度為-0.01～-0.05MPa，真空抽濾的時(shí)間為3～8s。

優(yōu)選的，所述金屬納米顆粒分散液的質(zhì)量濃度為3～10g/L。

優(yōu)選的，所述金屬納米顆粒分散液在濾膜表面的加量為0.3～2μL/mm²。

本發(fā)明還提供了一種表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品的制備方法，將待測(cè)物置于上述技術(shù)方案所述表面增強(qiáng)拉曼光譜基底的金屬納米顆粒層表面，真空抽濾得到表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品。

本發(fā)明還提供了一種表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品的制備方法，包括以下步驟：

(a)將待測(cè)物、金屬納米顆粒與水混合，得到混合分散液，所述金屬納米顆粒包括金納米顆?；蜚y納米顆粒；

(b)將所述步驟(a)得到的混合分散液置于濾膜表面，真空抽濾得到表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品。

優(yōu)選的，所述待測(cè)物包括有機(jī)物或微生物。

本發(fā)明提供了一種表面增強(qiáng)拉曼光譜基底的制備方法，將金納米顆粒或銀納米顆粒與水混合，得到金屬納米顆粒分散液，置于濾膜表面，真空抽濾得到表面增強(qiáng)拉曼光譜基底。

本發(fā)明還提供了表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品的制備方法，將待測(cè)物置于上述技術(shù)方案所述表面增強(qiáng)拉曼光譜基底上，真空抽濾得到表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品；或?qū)⒔鸺{米顆?；蜚y納米顆粒與待測(cè)物和水混合，得到混合分散液，將所述混合分散液置于濾膜表面，真空抽濾得到表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品。

本發(fā)明以濾膜為載體，通過(guò)真空抽濾實(shí)現(xiàn)快速干燥，得到的表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品厚度均勻、形狀規(guī)整、SERS信號(hào)均勻、重復(fù)性好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的方法制備得到的腺嘌呤的表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品的SERS信號(hào)檢出限達(dá)到10^-8M，且信號(hào)在不同樣品或同一個(gè)樣品上不同采樣點(diǎn)都表現(xiàn)出高均勻性，樣品間重復(fù)性好；腸桿菌的表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品的拉曼信號(hào)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差可低至3.6％，均勻、重復(fù)性好。

并且，本發(fā)明提供的制備方法與傳統(tǒng)無(wú)孔載體結(jié)合自然干燥相比，制樣時(shí)間大大縮短，可從幾十分鐘至數(shù)小時(shí)縮短至3-8秒。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中制備的表面增強(qiáng)拉曼光譜基底圖片；

圖2為實(shí)施例2、3、4和5中得到的不同濃度的腺嘌呤表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品的SERS譜圖；

圖3為分別在實(shí)施例1制備的三個(gè)平行SERS基底上采集到的10^-4M腺嘌呤表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品的SERS譜圖；

圖4為實(shí)施例6中制備的腸桿菌LSJC7的表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品的SEM圖；

圖5為實(shí)施例圖4的局部放大圖；

圖6為實(shí)施例6中腸桿菌LSJC7的表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品的SERS譜圖733cm^-1峰的積分強(qiáng)度及對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差值；

圖7為實(shí)施例6中腸桿菌LSJC7暴露于不同濃度砷和四環(huán)素5小時(shí)后的SERS譜圖；

圖8為實(shí)施例7中大腸桿菌暴露于不同濃度納米氧化鋅30分鐘后的SERS譜圖733cm^-1峰的積分強(qiáng)度(柱狀圖)及對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差值，其中，ZnOX代表細(xì)菌暴露于Xmg/L納米氧化鋅；

圖9為實(shí)施例7中大腸肝菌暴露于不同濃度納米氧化鋅30分鐘后的SERS譜圖(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種表面增強(qiáng)拉曼光譜基底的制備方法，包括以下步驟：

(1)將金屬納米顆粒與水混合，得到金屬納米顆粒分散液，所述金屬納米顆粒包括金納米顆粒和/或銀納米顆粒；

(2)將所述步驟(1)得到的金屬納米顆粒分散液置于濾膜表面，真空抽濾得到表面增強(qiáng)拉曼光譜基底。

本發(fā)明將金屬納米顆粒與水混合，得到金屬納米顆粒分散液，所述金屬納米顆粒包括金納米顆?；蜚y納米顆粒。本發(fā)明對(duì)所述金屬納米顆粒分散液的制備的操作沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的分散液制備的技術(shù)方案即可。

本發(fā)明優(yōu)選將所述金屬納米顆粒與水混合后進(jìn)行離心，得到上層清液和下層的金屬納米顆粒分散液；再將所述上清液去除，得到金屬納米顆粒分散液。在本發(fā)明中，所述金納米顆粒的離心的速率優(yōu)選為2500～5000rpm，更優(yōu)選為3000～4000rpm；所述金納米顆粒的離心的時(shí)間優(yōu)選為6～10min。在本發(fā)明中，所述銀納米顆粒的離心的速率優(yōu)選為5000～7000rpm，更優(yōu)選為5500～6500rpm；所述銀納米顆粒的離心的時(shí)間優(yōu)選為6～10min。在本發(fā)明中，所述金屬納米顆粒分散液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為3～10g/L，更優(yōu)選為5～8g/L，最優(yōu)選為6～7g/L。

在本發(fā)明中，所述金納米顆粒的粒徑優(yōu)選為60～200nm，更優(yōu)選為100～160nm，最優(yōu)選為120～140nm。在本發(fā)明中，所述銀納米顆粒的粒徑優(yōu)選為40～120nm，更優(yōu)選為60～100nm，最優(yōu)選為70～90nm。

本發(fā)明對(duì)所述金屬納米顆粒的來(lái)源沒有特殊的限定，采用市售產(chǎn)品或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的制備方法制備即可。在本發(fā)明中，所述金屬納米顆粒的制備方法優(yōu)選為化學(xué)還原合成法，更優(yōu)選包括以下步驟：將氯金酸或硝酸銀與水和檸檬酸三鈉混合，還原反應(yīng)得到金納米顆?；蜚y納米顆粒。

本發(fā)明優(yōu)選將所述氯金酸或硝酸銀與水混合，得到氯金酸或硝酸銀溶液。在本發(fā)明中，所述氯金酸或硝酸銀溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為0.1～0.2g/L，更優(yōu)選為0.11～0.18g/L。

得到氯金酸或硝酸銀溶液后，本發(fā)明優(yōu)選將所述氯金酸或硝酸銀溶液加熱至還原反應(yīng)溫度，再與檸檬酸三鈉混合，還原反應(yīng)得到金納米顆?；蜚y納米顆粒。本發(fā)明中，所述氯金酸與檸檬酸三鈉的質(zhì)量比優(yōu)選為1:2.1～2.3；所述硝酸銀與檸檬酸三鈉的質(zhì)量比優(yōu)選為1:1～1.2。在本發(fā)明中，所述檸檬酸三鈉優(yōu)選以檸檬酸三鈉溶液的形式加入。在本發(fā)明中，制備金納米顆粒時(shí)，所述檸檬酸三鈉溶液的濃度優(yōu)選為0.05～0.06g/L；制備銀納米顆粒時(shí)，所述檸檬酸三鈉溶液的濃度優(yōu)選為0.19～0.20g/L。

在本發(fā)明中，所述還原反應(yīng)的溫度優(yōu)選為98～102℃，所述還原反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選為20～70min；在本發(fā)明中，制備金納米顆粒時(shí)，所述還原反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選為20～40min，更優(yōu)選為25～35min；制備銀納米顆粒時(shí)，所述還原反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選為50～70min，更優(yōu)選為55～65min。在本發(fā)明中，所述還原反應(yīng)優(yōu)選在攪拌條件下進(jìn)行，所述攪拌的速率優(yōu)選為1000～1500rpm。在本發(fā)明中，所述攪拌優(yōu)選持續(xù)至反應(yīng)結(jié)束。

得到金屬納米顆粒后，本發(fā)明優(yōu)選將所述金屬納米顆粒進(jìn)行洗滌。在本發(fā)明中，所述洗滌的洗滌劑優(yōu)選為水，更優(yōu)選為去離子水或超純水。在本發(fā)明中，所述洗滌的次數(shù)優(yōu)選為1～2次。

得到金屬納米顆粒分散液后，本發(fā)明將所述金屬納米顆粒分散液置于濾膜表面，真空抽濾得到表面增強(qiáng)拉曼光譜基底。在本發(fā)明中，所述濾膜的孔徑優(yōu)選不超過(guò)0.1μm，更優(yōu)選為0.001～0.08μm，最優(yōu)選為0.02～0.06μm。在本發(fā)明中，所述濾膜的材質(zhì)優(yōu)選包括聚砜、聚醚砜、混合纖維素酯、聚偏二氟乙烯、碳酸酯或聚四氟乙烯。在本發(fā)明中，所述濾膜可具體為截留分子量為5～100kDa的聚砜和截留分子量為5～100kDa的聚醚砜超濾膜以及孔徑不超過(guò)0.1μm的混合纖維素酯微濾膜、孔徑不超過(guò)0.1μm的聚偏二氟乙烯膜、孔徑不超過(guò)0.1μm的碳酸酯膜和孔徑不超過(guò)0.1μm的聚四氟乙烯膜中的一種。在本發(fā)明中，所述濾膜的孔結(jié)構(gòu)可以使溶劑在真空抽濾條件下快速濾出。

本發(fā)明對(duì)所述金屬納米顆粒分散液置于濾膜表面的操作沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的液體加入方法即可。本發(fā)明優(yōu)選將所述金屬納米顆粒分散液滴加于濾膜表面。本發(fā)明對(duì)所述滴加的速率沒有特殊的限定，根據(jù)實(shí)際滴加情況進(jìn)行調(diào)整即可。在本發(fā)明中，所述金屬納米顆粒分散液在濾膜表面的加量?jī)?yōu)選為0.3～2μL/mm²，更優(yōu)選為0.8～1.5μL/mm²。

在本發(fā)明中，所述真空抽濾的真空度優(yōu)選為-0.01～-0.05MPa，更優(yōu)選為-0.02～-0.04MPa；所述真空抽濾的時(shí)間優(yōu)選為3～8s，更優(yōu)選為4～6s。在本發(fā)明中，所述真空抽濾可以實(shí)現(xiàn)快速均勻干燥，得到厚度均勻，表面平整的表面增強(qiáng)拉曼光譜基底。

本發(fā)明還提供了一種表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品的制備方法，將待測(cè)物置于上述技術(shù)方案所述表面增強(qiáng)拉曼光譜基底的金屬納米顆粒層表面，真空抽濾得到表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品。在本發(fā)明中，所述待測(cè)物優(yōu)選包括有機(jī)物或微生物；所述有機(jī)物優(yōu)選為生物分子。在本發(fā)明中，所述待測(cè)物優(yōu)選以待測(cè)物溶液或分散液的形式置于表面增強(qiáng)拉曼光譜基底的金屬納米顆粒層表面。本發(fā)明對(duì)所述待測(cè)物溶液或分散液的濃度和溶劑的種類沒有特殊的限定，根據(jù)待測(cè)物的種類進(jìn)行調(diào)整即可。

在本發(fā)明中，所述真空抽濾的真空度優(yōu)選為-0.01～-0.05MPa，更優(yōu)選為-0.02～-0.04MPa；所述真空抽濾的時(shí)間優(yōu)選為3～8s，更優(yōu)選為4～6s。在本發(fā)明中，所述真空抽濾可以實(shí)現(xiàn)快速均勻干燥，得到厚度均勻，表面平整的表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品。

本發(fā)明還提供了一種表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品的制備方法，包括以下步驟：

(a)將待測(cè)物、金屬納米顆粒與水混合，得到混合分散液，所述金屬納米顆粒包括金納米顆?；蜚y納米顆粒；

(b)將所述步驟(a)得到的混合分散液置于濾膜表面，真空抽濾得到表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品。

本發(fā)明將待測(cè)物、金屬納米顆粒與水混合，得到混合分散液，所述金屬納米顆粒包括金納米顆?；蜚y納米顆粒。本發(fā)明對(duì)所述待測(cè)物和金屬納米顆粒的比例沒有特殊的限定，根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)選擇進(jìn)行調(diào)整即可。

本發(fā)明對(duì)所述金屬納米顆粒的來(lái)源沒有特殊的限定，采用市售產(chǎn)品或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的制備方法制備即可。在本發(fā)明中，所述金屬納米顆粒優(yōu)選與上述技術(shù)方案所述金屬納米顆粒相同。本發(fā)明對(duì)所述混合分散液的制備的操作沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的分散液制備的技術(shù)方案即可。在本發(fā)明中，所述混合分散液的制備優(yōu)選與上述技術(shù)方案所述金屬納米顆粒分散液的制備方法相同。在本發(fā)明中，所述金屬納米顆粒在混合分散液中的質(zhì)量濃度優(yōu)選為5～8g/L，更優(yōu)選為6～7g/L。

得到混合分散液后，本發(fā)明將所述混合分散液置于濾膜表面，真空抽濾得到表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品。在本發(fā)明中，所述濾膜的孔徑優(yōu)選不超過(guò)0.1μm，更優(yōu)選為0.001～0.08μm，最優(yōu)選為0.02～0.06μm。在本發(fā)明中，所述濾膜的材質(zhì)優(yōu)選包括聚砜、聚醚砜、混合纖維素酯、聚偏二氟乙烯、碳酸酯或聚四氟乙烯。在本發(fā)明中，所述濾膜可具體為截留分子量為5～100kDa的聚砜和截留分子量為5～100kDa的聚醚砜超濾膜以及孔徑不超過(guò)0.1μm的混合纖維素酯微濾膜、孔徑不超過(guò)0.1μm的聚偏二氟乙烯膜、孔徑不超過(guò)0.1μm的碳酸酯膜和孔徑不超過(guò)0.1μm的聚四氟乙烯膜中的一種。在本發(fā)明中，所述濾膜的孔結(jié)構(gòu)可以使溶劑在真空抽濾條件下快速濾出。

本發(fā)明對(duì)所述混合分散液置于濾膜表面的操作沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的液體加入方法即可。本發(fā)明優(yōu)選將所述混合分散液滴加于濾膜表面。本發(fā)明對(duì)所述滴加的速率沒有特殊的限定，根據(jù)實(shí)際滴加情況進(jìn)行調(diào)整即可。在本發(fā)明中，所述混合分散液在濾膜表面的加量?jī)?yōu)選為0.3～2μL/mm²，更優(yōu)選為0.8～1.5μL/mm²。

在本發(fā)明中，所述真空抽濾的真空度優(yōu)選為-0.01～-0.05MPa，更優(yōu)選為-0.02～-0.04MPa；所述真空抽濾的時(shí)間優(yōu)選為3～8s，更優(yōu)選為4～6s。在本發(fā)明中，所述真空抽濾可以實(shí)現(xiàn)快速均勻干燥，得到厚度均勻，表面平整的表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品。

為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的表面增強(qiáng)拉曼光譜基底和樣品的制備方法進(jìn)行詳細(xì)地描述，但不能將它們理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

實(shí)施例1:

(1)制備貴金屬納米顆粒

稱取4.84mL質(zhì)量濃度為1％的氯金酸溶液稀釋至400mL超純水中，加熱至沸騰，在1200rpm攪拌的情況下，快速加入2.735mL質(zhì)量濃度為1％的檸檬酸三鈉溶液，在1200rpm攪拌的情況下保持沸騰30min后冷卻至室溫，得到紫紅色的Au納米顆粒。

(2)清洗并濃縮金屬納米顆粒

將步驟(1)制備的Au納米顆粒放入玻璃離心管內(nèi)，在2900rpm轉(zhuǎn)速下離心8min，移除上層清液，得到洗滌后的Au納米顆粒；加入一定體積的超純水，充分混勻后，于2900rpm離心6min，移除上層清液，獲得下層濃度為8g/L金屬納米顆粒分散液。

(3)制備表面增強(qiáng)拉曼光譜基底

將截留分子量為66kDa的聚砜(PS)超濾膜放置于玻璃砂芯濾頭上，在真空抽濾的條件下，將多組5μLAu納米顆粒分散液按照1μL/mm²的加量滴于微濾膜上，3s之后形成多個(gè)形狀規(guī)整、厚度均勻的表面增強(qiáng)拉曼光譜基底，如圖1所示。從圖1可以看出，本實(shí)施例可以簡(jiǎn)單且快速制備多個(gè)表面增強(qiáng)拉曼光譜基底。

實(shí)施例2:

將10μL濃度為10^-5M的腺嘌呤溶液滴于實(shí)施例1中得到的表面增強(qiáng)拉曼光譜基底上，在-0.01～-0.05MPa下抽濾3s，得到表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品。

實(shí)施例3:

將10μL濃度為10^-6M的腺嘌呤溶液滴于實(shí)施例1中得到的表面增強(qiáng)拉曼光譜基底上，在-0.01～-0.05MPa下抽濾4s，得到表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品。

實(shí)施例4:

將10μL濃度為10^-7M的腺嘌呤溶液滴于實(shí)施例1中得到的表面增強(qiáng)拉曼光譜基底上，在-0.01～-0.05MPa下抽濾6s，得到表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品。

實(shí)施例5:

將10μL濃度為10^-8M的腺嘌呤溶液滴于實(shí)施例1中得到的表面增強(qiáng)拉曼光譜基底上，在-0.01～-0.05MPa下抽濾8s，得到表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品。

將實(shí)施例2、3、4和5制備的表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品在拉曼光譜儀上進(jìn)行檢測(cè)(Horiba Aramis，激發(fā)光633nm)。

得到不同濃度腺嘌呤溶液在相同表面增強(qiáng)拉曼光譜基底上的拉曼光譜如圖2所示。從圖2可以看出，腺嘌呤的SERS信號(hào)檢出限達(dá)到10^-8M。另外，分別采集10^-4M腺嘌呤在實(shí)施例1制備的三個(gè)平行SERS基底以及同一個(gè)SERS基底不同位置的拉曼光譜圖，如圖3所示，可以看出信號(hào)在不同樣品或同一樣品不同點(diǎn)之間表現(xiàn)出高均勻性。

實(shí)施例6:

步驟(1)和(2)與實(shí)施例1相同；

(3)將直徑為50mm、孔徑為8μm的混合纖維素酯膜(底層承載膜)放置于砂芯濾頭上，再將裁剪好的直徑為6mm、孔徑為0.1μm的混合纖維素酯膜(樣品承載膜)放置于底層承載膜上，用適量超純水潤(rùn)濕膜面，使兩層膜緊密貼合。

將砷和四環(huán)素作用5小時(shí)后的腸桿菌LSJC7菌液于5000rpm離心2分鐘后，棄去上清液，剩余的菌液體積視菌團(tuán)大小約為40μL。向濃縮菌液中加入20μL濃度為5g/L的Au納米顆粒，得到混合分散液，滴于樣品承載膜上，在-0.01～-0.05MPa真空抽濾8s，形成形狀規(guī)整、厚度均勻的表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品。

本實(shí)施例制備的表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品中納米粒子和細(xì)菌分布的電鏡圖如圖4和圖5所示。從圖中可以看出，細(xì)菌均勻分布于濾膜表面，納米粒子位于細(xì)菌表面和間隙。

采用拉曼光譜儀對(duì)本實(shí)施例制備的表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品進(jìn)行檢測(cè)。為考察制備的SERS樣品的均勻性和重復(fù)性，在單個(gè)樣品表面隨機(jī)取13個(gè)點(diǎn)采集譜線，并在三個(gè)平行樣上共采集3×13＝39條譜線，考察主要特征峰733cm^-1積分強(qiáng)度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，如圖6所示。

從圖6可以看出，本實(shí)例制備的樣品的拉曼信號(hào)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.2％，4.4％，3.6％，且三個(gè)平行樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.4％。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，SERS基底上樣品譜峰強(qiáng)度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于20％即可視為均勻，說(shuō)明本發(fā)明方法制得的SERS樣品信號(hào)均勻，重復(fù)性好。

另外，細(xì)菌的SERS譜圖隨砷和四環(huán)素的暴露濃度發(fā)生靈敏變化，如圖7所示，說(shuō)明該方法具有高靈敏性，可以用于抗生素抗性機(jī)制的研究。

實(shí)施例7:

步驟(1)和(2)與實(shí)施例1相同；

(3)將直徑為50mm、孔徑為8μm的混合纖維素酯膜(底層承載膜)放置于砂芯濾頭上，再將裁剪好的直徑為6mm、孔徑為0.1μm的混合纖維素酯膜(樣品承載膜)放置于底層承載膜上，用適量超純水潤(rùn)濕膜面，使兩層膜緊密貼合。

將納米氧化鋅處理一定時(shí)間后的大腸桿菌菌液于8000rpm離心5min后，棄去上清液，剩余的菌液體積視菌團(tuán)大小約為20μL。

向濃縮菌液中加入15μL濃度為8g/L的Au納米顆粒，得到混合分散液，在-0.01～-0.05MPa真空抽濾8s，形成形狀規(guī)整、厚度均勻的表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品。

采用拉曼光譜儀對(duì)本實(shí)施例制備的表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品進(jìn)行檢測(cè)。為考察制備的SERS樣品的均勻性和重復(fù)性，在單個(gè)樣品表面隨機(jī)取15個(gè)點(diǎn)采集譜線，在三個(gè)平行樣上共采集3×15＝45條譜線，考察主要特征峰733cm^-1積分強(qiáng)度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差如圖8所示，結(jié)果表明本實(shí)例制備的樣品的拉曼信號(hào)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差介于5.5％～11.8％，說(shuō)明本發(fā)明方法制備的SERS樣品信號(hào)均勻，樣品間重復(fù)性好。

另外，細(xì)菌暴露于納米氧化鋅30分鐘后的SERS譜圖隨氧化鋅濃度發(fā)生顯著變化如圖9所示，說(shuō)明該方法具有高靈敏性，可以用于毒性物質(zhì)暴露下細(xì)胞生物分子變化的快速檢測(cè)分析。

由以上實(shí)施例可以看出，本發(fā)明提供的或按照本發(fā)明制備方法制備的表面增強(qiáng)拉曼光譜樣品由于使用微孔濾膜作為載體，使得可以在真空抽濾的條件下，讓溶液中水快速通過(guò)，而樣品(納米粒子和待測(cè)物)被截留在濾膜上，從而快速獲得形狀規(guī)整、厚度均勻，SERS信號(hào)強(qiáng)度高、均勻性和重復(fù)性好的干燥SERS樣品；且樣品制備過(guò)程簡(jiǎn)單易行，成本低廉，所需抽濾裝置和水泵屬實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器、無(wú)需價(jià)格昂貴的儀器設(shè)備，所需微濾膜屬實(shí)驗(yàn)室常規(guī)耗材，因此可在不同實(shí)驗(yàn)室、不同環(huán)境甚至野外進(jìn)行操作；樣品制備時(shí)間短(3～8秒)；所需樣品量少(20～50μL)；可進(jìn)行大批量樣品的同時(shí)快速和新鮮制備。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。