本發(fā)明屬于肉類食品質(zhì)量檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種快速檢測肉品冷藏過程中脂質(zhì)氧化的方法。

背景技術(shù)：

冷卻肉以其安全性、營養(yǎng)性而優(yōu)于傳統(tǒng)的冷凍肉、熱鮮肉,已成為生鮮肉消費的必然趨勢。但在冷卻肉加工、流通和貯藏過程中,不可避免的受到溫度、光、射線、氧、水分和催化劑等外界環(huán)境的影響,這些因素會使肉本身的脂肪發(fā)生氧化,產(chǎn)生醛、醇、酮等化合物,產(chǎn)生令人不愉快的氣味、苦澀味,降低了肉的質(zhì)量和營養(yǎng)價值,同時還會引起肉表面褐變,可接受性也大大下降,從而造成很大的損失。氧化嚴重時會產(chǎn)生一些有毒性化合物,危及人體健康甚至生命。

實驗結(jié)果表明：食品之所以會腐敗，除了細菌感染之外，主要是因為發(fā)生了氧化反應，含有油脂的食品，特別是肉類食品很容易發(fā)生自由基介導的脂質(zhì)氧化反應。其介導過程如圖4所示。

ESR(電子自旋共振)技術(shù)特別適合測定各種各樣的自由基，對于活性氧自由基的檢測可以采用自旋捕獲的方法。捕捉劑ST與自由基R·反應形成的自旋加合物R-ST具有相對較長的壽命而且有特征的ESR波普，可以方便地在ESR波普儀上檢測。活性氧自由基在食品的氧化腐敗中起著決定性的作用。作質(zhì)量控制時，可以在食品生產(chǎn)的流程中定時地加入捕獲劑，定時采樣，然后在ESR波普儀上檢測。作為產(chǎn)品檢測或者研究之用，可以先采用強制性的措施造成氧化損傷，如加熱光照或者輻照等，并且在樣本中加入捕捉劑進行ESR檢測。

目前對脂質(zhì)氧化的檢測方法主要集中于檢測脂質(zhì)氧化過程中產(chǎn)生的初級和次級氧化產(chǎn)物從而反應氧化程度。對于氧化初級產(chǎn)物的檢測方法主要為：過氧化值法，此方法采用滴定法通過顏色變化從而確定反應終點，樣品的顏色對結(jié)果有很大干擾，同時不適合飽和脂肪酸含量高的樣品。紅外光譜法，雖然此方法可以精確反應氧化程度，但操作復雜，且成本較高。氣相色譜法，此方法在進行氣相色譜分析前樣品的衍生化處理可能會引起不飽和樣品物性變化,從而帶來檢測誤差。液相色譜法，此方法同樣操作較為繁瑣，同時檢測時間較長。對于次級氧化產(chǎn)物的檢測方法主要有酸價、硫代巴比妥酸反應物測定法、茴香胺值法、電導率法、熒光法、氣象色譜法等，但這些方法受限于樣品顏色影響大，操作繁瑣，副產(chǎn)物對檢測結(jié)果有影響等。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種快速檢測肉品冷藏過程中脂質(zhì)氧化的方法。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：一種快速檢測肉品冷藏過程中脂質(zhì)氧化的方法，包括以下步驟：

步驟1，取一定重量的冷藏后的肉品試樣；優(yōu)選地，步驟1中，肉品試樣的重量為0.5～2g。

步驟2，向試樣中添加a-(4-吡啶基-1-氧)-N-叔丁基硝基酮溶液后進行孵育；優(yōu)選地，步驟2中，a-(4-吡啶基-1-氧)-N-叔丁基硝基酮溶液的濃度為0.1～200mM，體積為1～4ml；孵育時間為10～60min，孵育溫度為0℃。

步驟3，向步驟2體系中添加氯仿與甲醇混合溶液和去離子水；優(yōu)選地，在步驟3中，在步驟3中，所述氯仿與甲醇混合溶液中二者的體積比為1:1-5:1，氯仿甲醇混合溶液總體積為1～10ml，去離子水的添加量為1～8ml。

步驟4，對步驟3體系進行勻漿；

步驟5，向步驟4體系中添加氯仿與甲醇混合溶液；優(yōu)選地，在步驟5中，所述氯仿與甲醇混合溶液中二者的比例為1:1-5:1，氯仿甲醇混合溶液總體積為10～40ml。

步驟6，在渦旋振蕩器上振蕩步驟5體系；優(yōu)選地，在步驟6中，所述渦旋振蕩時間為2～5min。

步驟7，隨后對步驟6體系進行離心；優(yōu)選地，在步驟7中，所述離心力為500～1000g，離心時間為5～15min。

步驟8，將氯仿層從離心后的體系中分離出來；優(yōu)選地，在步驟8中，利用分液漏斗將氯仿層從離心后的體系中分離出來。

步驟9，分離得到的氯仿溶液經(jīng)過硫酸鈉柱后收集；硫酸鈉柱起到干燥的作用可以吸收水分，進一步純化氯仿提取溶液。

步驟10，收集步驟9中的氯仿溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除氯仿；優(yōu)選地，在步驟10中，所述旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為30～70℃。

步驟11，收集步驟10中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的樣品，放入電子自旋共振檢測石英管中；

步驟12，將石英管放入電子自旋共振儀內(nèi)進行檢測。優(yōu)選地，電子自旋共振儀的中心磁場強度為3500G，微波功率為1.86mW，微波頻率為9.85GHz，放大倍數(shù)為1.00×10⁶，調(diào)制幅度為1.00G,調(diào)制頻率為100kHz,時間常數(shù)為240ms,掃描時間為245.76s。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)基于ESR方法檢測肉品凍藏過程中脂質(zhì)氧化的方法，每個樣品檢測耗時短，方便迅速；檢測結(jié)果準確。

相比較ESR波普法的優(yōu)點是：1、精確可靠，專一性強；2、省時怕、高效、快速，樣品不需要分離或者重加工等繁瑣過程；3、可以實現(xiàn)自動批量檢測，簡化測量過程和降低工作強度；4、使用POBN捕捉劑，成本低廉；5、是一種物理的測量方法，對樣品沒有損害。

附圖說明

圖1為基于ESR技術(shù)檢測實施例2牛肉中脂質(zhì)氧化情況的特征峰型；

圖2為基于ESR技術(shù)檢測實施例3豬肉中脂質(zhì)氧化情況的特征峰型；

圖3為基于ESR技術(shù)檢測實施例4雞肉中脂質(zhì)氧化情況的特征峰型；

圖4為油類食品脂質(zhì)過氧化過程的示意圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

一種具體實施方式的快速檢測肉品冷藏過程中脂質(zhì)氧化的方法包括以下步驟：

步驟1，取一定重量的冷藏后的肉品試樣；由于電子自旋共振儀的檢測只需要少量試樣，所以在優(yōu)選的實施例中，肉品試樣的重量為0.5～2g。

步驟2，向試樣中添加a-(4-吡啶基-1-氧)-N-叔丁基硝基酮(POBN，CAS66893-81-0)溶液后進行孵育；優(yōu)選地，步驟2中，a-(4-吡啶基-1-氧)-N-叔丁基硝基酮溶液的濃度為0.1～200mM，體積為1～4ml；孵育時間為10～60min，孵育溫度為0℃。

步驟3，向步驟2體系中添加氯仿與甲醇混合溶液和去離子水；優(yōu)選地，在步驟3中，在步驟3中，所述氯仿與甲醇混合溶液中二者的體積比為1:1-5:1，氯仿甲醇混合溶液總體積為1～10ml，去離子水的添加量為1～8ml。

步驟4，對步驟3體系進行勻漿；

步驟5，向步驟4體系中添加氯仿與甲醇混合溶液；優(yōu)選地，在步驟5中，所述氯仿與甲醇混合溶液中二者的比例為1:1-5:1，氯仿甲醇混合溶液總體積為10～40ml。

步驟6，在渦旋振蕩器上振蕩步驟5體系；優(yōu)選地，在步驟6中，所述渦旋振蕩時間為2～5min。

步驟7，隨后對步驟6體系進行離心；優(yōu)選地，在步驟7中，所述離心力為500～1000g，離心時間為5～15min。

步驟8，將氯仿層從離心后的體系中分離出來；優(yōu)選地，在步驟8中，利用分液漏斗將氯仿層從離心后的體系中分離出來。

步驟9，分離得到的氯仿溶液經(jīng)過硫酸鈉柱后收集；硫酸鈉柱起到干燥的作用可以吸收水分，進一步純化氯仿提取溶液。

步驟10，收集步驟9中的氯仿溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除氯仿；優(yōu)選地，在步驟10中，所述旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為30～70℃。

步驟11，收集步驟10中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的樣品，放入電子自旋共振檢測石英管中；

步驟12，將石英管放入電子自旋共振儀內(nèi)進行檢測。優(yōu)選地，電子自旋共振儀的中心磁場強度為3500G，微波功率為1.86mW，微波頻率為9.85GHz，放大倍數(shù)為1.00×10⁶，調(diào)制幅度為1.00G,調(diào)制頻率為100kHz,時間常數(shù)為240ms,掃描時間為245.76s。

以下實施例中所用試劑、儀器的規(guī)格型號及生產(chǎn)廠家如下：

POBN(a-(4-吡啶基-1-氧)-N-叔丁基硝基酮)，日本TCI試劑公司，純度98％。渦旋振蕩器，上海精科實業(yè)有限公司，型號：XW-80A。離心機，日立公司型號：CF 16RXⅡ；硫酸鈉柱，安捷倫公司，型號：直管型柱15g，60mL。

實施例1

取冷藏3天的牛肉0.5g；

向肉品中添加1ml，80mM的POBN(a-(4-吡啶基-1-氧)-N-叔丁基硝基酮)溶液進行孵育，孵育20min；

向上述體系中添加8ml氯仿甲醇混合溶，體積比為1:1和6ml去離子水；

對上述體系進行勻漿；

向上述體系中再次添加15ml氯仿甲醇混合溶液，二者體積比為1:1；

在渦旋振蕩器上振蕩上述體系2min；

隨后以500g離心力對上述體系離心8min；

將氯仿層用分液漏斗從體系中分離出來：

將氯仿溶液經(jīng)過硫酸鈉柱子后收集；

收集上述過柱子后的氯仿溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除氯仿，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為50℃；

收集上述旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的樣品，放入ESR檢測專用的石英管中；

將石英管放入ESR諧振腔內(nèi)，進行檢測，ESR的中心磁場強度為3500G，微波功率為1.86mW，微波頻率為9.85GHz，放大倍數(shù)為1.00×10⁶，調(diào)制幅度為1.00G；調(diào)制頻率為100kHz；時間常數(shù)為240ms；掃描時間為245.76s，其峰高值為0.243×10⁶。

ESR檢測到的肉品氧化后自由基所形成特征峰型的峰高與肉品氧化程度呈現(xiàn)正相關(guān)，肉品氧化程度越嚴重，伴隨ESR上檢測到的特征峰的峰高也越高。

實施例2

取冷藏5天的牛肉1g；

向肉品中添加1.5ml，70mM的POBN溶液進行孵育，孵育40min；

向上述體系中添加6ml氯仿甲醇混合溶，體積比為4:1和5ml去離子水；

對上述體系進行勻漿；

向上述體系中再次添加18ml氯仿甲醇混合溶液，二者體積比為4:1；

在渦旋振蕩器上振蕩上述體系2.5min；

隨后以800g離心力對上述體系離心10min；

將氯仿層用分液漏斗從體系中分離出來：

將氯仿溶液經(jīng)過硫酸鈉柱子后收集；

收集上述過柱子后的氯仿溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除氯仿，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為55℃；

收集上述旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的樣品，放入ESR檢測專用的石英管中；

將石英管放入ESR諧振腔內(nèi)，進行檢測，ESR的中心磁場強度為3500G，微波功率為1.86mW，微波頻率為9.85GHz，放大倍數(shù)為1.00×10⁶，調(diào)制幅度為1.00G；調(diào)制頻率為100kHz；時間常數(shù)為240ms；掃描時間為245.76s，其峰高值為0.495×10⁶。

實施例3

取冷藏5天的豬肉1g；

向肉品中添加2ml，50mM的POBN溶液進行孵育，孵育30min；

向上述體系中添加10ml氯仿甲醇混合溶，體積比為3:1和4ml去離子水；

對上述體系進行勻漿；

向上述體系中再次添加30ml氯仿甲醇混合溶液，二者體積比為3:1；

在渦旋振蕩器上振蕩上述體系3min；

隨后以800g離心力對上述體系離心15min；

將氯仿層用分液漏斗從體系中分離出來：

將氯仿溶液經(jīng)過硫酸鈉柱子后收集；

收集上述過柱子后的氯仿溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除氯仿，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為45℃；

收集上述旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的樣品，放入ESR檢測專用的石英管中；

將石英管放入ESR諧振腔內(nèi)，進行檢測，ESR的中心磁場強度為3500G，微波功率為1.86mW，微波頻率為9.85GHz，放大倍數(shù)為1.00×10⁶，調(diào)制幅度為1.00G；調(diào)制頻率為100kHz；時間常數(shù)為240ms；掃描時間為245.76s，其峰高值為0.386×10⁶。

實施例4

取冷藏7天的雞肉1g；

向肉品中添加1ml，100mM的POBN溶液進行孵育，孵育50min；

向上述體系中添加6ml氯仿甲醇混合溶，體積比為2:1和4ml去離子水；

對上述體系進行勻漿；

向上述體系中再次添加20ml氯仿甲醇混合溶液，二者體積比為2:1；

在渦旋振蕩器上振蕩上述體系2min；

隨后以800g離心力對上述體系離心10min；

將氯仿層用分液漏斗從體系中分離出來：

將氯仿溶液經(jīng)過硫酸鈉柱子后收集；

收集上述過柱子后的氯仿溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除氯仿，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為45℃；

收集上述旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的樣品，放入ESR檢測專用的石英管中；

將石英管放入ESR諧振腔內(nèi)，進行檢測，ESR的中心磁場強度為3500G，微波功率為1.86mW，微波頻率為9.85GHz，放大倍數(shù)為1.00×10⁶，調(diào)制幅度為1.00G；調(diào)制頻率為100kHz；時間常數(shù)為240ms；掃描時間為245.76s，其峰高值為0.874×10⁶。

實施例5

取冷藏7天的豬肉1.5g；

向肉品中添加2ml，150mM的POBN溶液進行孵育，孵育40min；

向上述體系中添加8ml氯仿甲醇混合溶，體積比為2:1和5ml去離子水；

對上述體系進行勻漿；

向上述體系中再次添加35ml氯仿甲醇混合溶液，二者體積比為2:1；

在渦旋振蕩器上振蕩上述體系4min；

隨后以1000g離心力對上述體系離心10min；

將氯仿層用分液漏斗從體系中分離出來：

將氯仿溶液經(jīng)過硫酸鈉柱子后收集；

收集上述過柱子后的氯仿溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除氯仿，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為50℃；

收集上述旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的樣品，放入ESR檢測專用的石英管中；

將石英管放入ESR諧振腔內(nèi)，進行檢測，ESR的中心磁場強度為3500G，微波功率為1.86mW，微波頻率為9.85GHz，放大倍數(shù)為1.00×10⁶，調(diào)制幅度為1.00G；調(diào)制頻率為100kHz；時間常數(shù)為240ms；掃描時間為245.76s，其峰高值為0.736×10⁶。

以上實施例僅為本發(fā)明的示例性實施例，不用于限制本發(fā)明，本發(fā)明的保護范圍由權(quán)利要求書限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在本發(fā)明的實質(zhì)和保護范圍內(nèi)，對本發(fā)明做出各種修改或等同替換，這種修改或等同替換也應視為落在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。