一種測定等離子體殺菌后懸浮液中丙二醛含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于消毒技術(shù)領(lǐng)域，特別是提供了一種測定等離子體殺菌后懸浮液中丙二醛含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]丙二醛(MDA) —般是由于氧自由基攻擊細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸(PUFA)后生成的，因此是一種脂質(zhì)過氧化作用終產(chǎn)物的標(biāo)志物，并且丙二醛是經(jīng)過脂質(zhì)過氧化作用后終產(chǎn)物產(chǎn)生量較多的一種。因此，丙二醛含量被用來檢測細(xì)菌經(jīng)過等離子體處理后的脂質(zhì)過氧化水平。另外要說明的是丙二醛本身具有細(xì)胞毒性，能夠造成DNA損傷，或者是與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，甚至能夠破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)以及功能。因此丙二醛濃度越高，細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的含量會(huì)越低，最終細(xì)胞膜會(huì)喪失流動(dòng)性。也可以用經(jīng)過等離子體處理后懸浮菌液中丙二醛的濃度來表征自由基與細(xì)菌的作用情況。目前國內(nèi)外對(duì)等離子體殺菌后懸浮液中丙二醛含量的研宄甚少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為解決上述問題，本發(fā)明提出一種測定等離子體殺菌后懸浮液中丙二醛含量的方法，主要的機(jī)理是:丙二醛本身能夠與TBA發(fā)生反應(yīng)(在高溫和酸性條件下時(shí))生成的物質(zhì)為紅棕色，然后通過分光光度計(jì)檢測其吸光度換算出丙二醛的含量。
[0004]本發(fā)明為達(dá)到以上目的，是通過以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的，包括的步驟如下:
[0005](I)、丙二醛標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定，稱取97% 1，1，3，3_四乙氧基甲烷的丙二醛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.315g，加蒸餾水溶解并在IL容量瓶中定容，然后用稀釋法制作出80 μ g/ml、60 μ g/ml、40 μ g/ml、20 μ g/ml 的丙二醛標(biāo)準(zhǔn)溶液；然后測定 O μ g/ml、20 μ g/ml、40 μ g/ml、60 μ g/ml、80 μ g/ml的丙二醛標(biāo)準(zhǔn)溶液在532nm下的吸光度，以丙二醛濃度(μ g/mL)為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0006](2)、懸浮菌液中丙二醛含量的測定，將經(jīng)過等離子體處理過的菌膜膜塊放置到1ml磷酸鹽緩沖液中懸浮振蕩，所得液體即為待測液體；在測定之前將每個(gè)樣品離心處理，取上清液1ml，加入到編號(hào)的試管中，然后在每個(gè)試管中分別加入2ml的三氯乙酸溶液，并混合均勻；然后再將混合后的樣品離心處理，取上清液2ml，在加入3ml的硫代巴比妥酸，將樣品混合均勻后放在水浴鍋中水浴lOmin，其中溫度保持在95°C，待樣品自然冷卻至室溫后測定樣品在532nm處的吸光度值；然后將吸光度值代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中就能計(jì)算出對(duì)應(yīng)樣品的丙二醛含量。
【附圖說明】
[0007]圖1為丙二醛(MDA)含量與殺菌效果曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0008]實(shí)施例
[0009]在超凈工作臺(tái)中，制備含有大腸桿菌菌種(編號(hào):ATTC25922)的菌膜膜塊備用。
[0010](I)、丙二醛標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定，稱取97% 1，1，3，3_四乙氧基甲烷的丙二醛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.315g，加蒸餾水溶解并在IL容量瓶中定容，然后用稀釋法制作出80 μ g/ml,60 μ g/ml、40yg/ml、20yg/ml的丙二醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，放置于冰箱中保存?zhèn)溆茫⒁獗４鏁r(shí)間不宜超過 24h ;然后測定 O μ g/ml、20 μ g/ml、40 μ g/ml、60 μ g/ml、80 μ g/ml 的丙二醛標(biāo)準(zhǔn)溶液在532nm下的吸光度，以丙二醛濃度(y g/mL)為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0011](2)懸浮菌液中丙二醛含量的測定，選用空氣微弧等離子體射流作為等離子體發(fā)生源，將經(jīng)過0s、10s、15S、20S、25S、30S等離子體處理過的(處理距離2cm)菌膜膜塊放置到1ml磷酸鹽緩沖液中懸浮振蕩，所得液體即為待測液體；在測定之前將每個(gè)樣品離心處理(6000rpm，1min)，取上清液1ml，加入到編號(hào)的試管中，然后在每個(gè)試管中分別加入2ml的三氯乙酸溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% )，并混合均勻；然后再將混合后的樣品離心處理(6000rpm, 1min)，取上清液2ml，在加入3ml的硫代巴比妥酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6% )，將樣品混合均勻后放在水浴鍋中水浴lOmin，其中溫度保持在95°C，待樣品自然冷卻至室溫后測定樣品在532nm處的吸光度值；然后將吸光度值代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中就能計(jì)算出對(duì)應(yīng)樣品的丙二醛含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖1，能夠看到經(jīng)過等離子體處理后，確實(shí)能夠立即造成細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化作用，并且在Os處理時(shí)間到20s處理時(shí)間內(nèi)，菌液懸浮液中的丙二醛含量逐步上升，在等離子體處理30s后達(dá)到了峰值，然后，在30s處理樣品中丙二醛開始下降。這主要是因?yàn)樵?-30s等離子體處理時(shí)，等離子體中的活性物質(zhì)(主要是ROS)刻蝕細(xì)菌的細(xì)胞膜，與細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)，從而生成丙二醛，然后由于超過30s后，所有的細(xì)菌都已經(jīng)死亡，說明等離子體對(duì)膜的破壞作用已經(jīng)很嚴(yán)重，此時(shí)大量的不飽和脂肪酸被消耗，丙二醛的生成量減少，然后丙二醛在等離子體的作用下開始轉(zhuǎn)化或者分解。表現(xiàn)為丙二醛含量開始下降，可以預(yù)測，隨著等離子體處理的時(shí)間進(jìn)一步延長，丙二醛含量會(huì)繼續(xù)下降。另外，當(dāng)丙二醛大量生成后，由于細(xì)胞裂解，一部分DNA釋放出來，丙二醛本身也能造成DNA的損傷而造成細(xì)菌死亡。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種測定等離子體殺菌后懸浮液中丙二醛含量的方法，其特征在于該方法的步驟如下: (1)、丙二醛標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定，稱取97%1，1，3，3_四乙氧基甲烷的丙二醛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.315g，加蒸餾水溶解并在IL容量瓶中定容，然后用稀釋法制作出80 μ g/ml、60 μ g/ml、40 μ g/ml、20 μ g/ml 的丙二 醛標(biāo)準(zhǔn)溶液；然后測定 O μ g/ml、20 μ g/ml、40 μ g/ml、60 μ g/ml、80 μ g/ml的丙二醛標(biāo)準(zhǔn)溶液在532nm下的吸光度，以丙二醛濃度(μ g/mL)為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線； (2)、懸浮菌液中丙二醛含量的測定，將經(jīng)過等離子體處理過的菌膜膜塊放置到1ml磷酸鹽緩沖液中懸浮振蕩，所得液體即為待測液體；在測定之前將每個(gè)樣品離心處理，取上清液1ml，加入到編號(hào)的試管中，然后在每個(gè)試管中分別加入2ml的三氯乙酸溶液，并混合均勻；然后再將混合后的樣品離心處理，取上清液2ml，在加入3ml的硫代巴比妥酸，將樣品混合均勻后放在水浴鍋中水浴lOmin，其中溫度保持在95°C，待樣品自然冷卻至室溫后測定樣品在532nm處的吸光度值；然后將吸光度值代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中就能計(jì)算出對(duì)應(yīng)樣品的丙二醛含量。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種測定等離子體殺菌后懸浮液中丙二醛含量的方法，主要的機(jī)理是：丙二醛本身能夠與TBA發(fā)生反應(yīng)生成的物質(zhì)為紅棕色，然后通過分光光度計(jì)檢測其吸光度換算出丙二醛的含量。首先完成丙二醛標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定；接著測定懸浮菌液中丙二醛含量。本方明方法靈敏度非常高，能夠表征等離子體殺菌過程中自由基與細(xì)菌的作用情況。
【IPC分類】G01N21-31
【公開號(hào)】CN104777120
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510217966
【發(fā)明人】杜長明, 馬丹燕
【申請(qǐng)人】中山大學(xué)
【公開日】2015年7月15日
【申請(qǐng)日】2015年4月24日