本發(fā)明涉及質(zhì)譜法，并且更確切地說(shuō)涉及用于通過從蛋白質(zhì)、多肽和其它生物相關(guān)多電荷物質(zhì)產(chǎn)生的質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)產(chǎn)物離子的質(zhì)譜法來(lái)分析蛋白質(zhì)或多肽的復(fù)雜混合物的方法以及將這些方法應(yīng)用于微生物的識(shí)別和表征。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，質(zhì)譜法由于其在與傳統(tǒng)的用于識(shí)別微生物的方法相比時(shí)增加的準(zhǔn)確性和縮短的得到結(jié)果的時(shí)間，已經(jīng)作為用于識(shí)別微生物的工具而獲得普及。到目前為止，用于微生物識(shí)別的最常見質(zhì)譜法方法是基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜法。在MALDI-TOF中，未知微生物的細(xì)胞與合適的紫外光吸收基質(zhì)溶液混合且允許在樣本板上干燥。替代地，使用微生物細(xì)胞的提取而不是完整細(xì)胞。在轉(zhuǎn)移到質(zhì)譜儀的離子源之后，使激光束指向樣本以用于蛋白質(zhì)的解吸附和電離，且收集時(shí)間相依性質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

由MALDI-TOF方法產(chǎn)生的微生物的質(zhì)譜揭露了來(lái)自完整的肽、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段以及其它分子的若干個(gè)峰，其構(gòu)成微生物的“指紋”。此方法依賴于未知微生物的質(zhì)譜中的峰分布與參考數(shù)據(jù)庫(kù)的圖案匹配，所述參考數(shù)據(jù)庫(kù)包括使用基本上相同實(shí)驗(yàn)條件獲得的已知微生物的質(zhì)譜的收集。隔離的微生物的譜與參考數(shù)據(jù)庫(kù)中的譜之間的匹配越好，在種屬、物質(zhì)或在一些情況下亞種水平下對(duì)生物的識(shí)別的置信度水平越高。因?yàn)樗龇椒ㄒ蕾囉谄ヅ銶ALDI-TOF質(zhì)譜中的峰的圖案，所以不要求識(shí)別或另外表征所述未知微生物的譜中表示的蛋白質(zhì)以便對(duì)其進(jìn)行識(shí)別。

雖然MALDI-TOF方法是快速且經(jīng)濟(jì)的，但它們具有的局限是限制了對(duì)病原體表征和識(shí)別的應(yīng)用范圍，包含但不限于毒性檢測(cè)和定量、抗性標(biāo)記確定、菌株匹配以及抗生素易感性測(cè)試(僅舉幾例)。MALDI質(zhì)譜內(nèi)的信息內(nèi)容反映了在所使用實(shí)驗(yàn)條件下一般受限于核糖體蛋白質(zhì)的大多數(shù)充足且可電離的蛋白質(zhì)。因?yàn)楹颂求w蛋白質(zhì)在原核細(xì)胞當(dāng)中是高度守恒的，所以通過MALDI-TOF對(duì)接近相關(guān)的微生物的區(qū)分受到限制。在此情況下，跨越接近相關(guān)的物質(zhì)的許多核糖體蛋白質(zhì)含有相同或稍微不同的氨基酸序列(即，單氨基酸取代)，這無(wú)法以低分辨率質(zhì)譜儀有效地區(qū)分。此外，菌株和/或血清變型類型、抗生素抗性、抗生素易感性、毒性或其它重要特性的確定依賴于除核糖體蛋白質(zhì)外的蛋白質(zhì)標(biāo)記的檢測(cè)，這進(jìn)一步限制MALDI-TOF用于微生物分析的應(yīng)用。使用MALDI-TOF用于微生物識(shí)別的實(shí)驗(yàn)室必須使用其它方法來(lái)進(jìn)一步表征經(jīng)識(shí)別的微生物。另外，MALDI-TOF方法對(duì)匹配譜圖案的依賴要求純的培養(yǎng)基以得到高質(zhì)量結(jié)果，且因此一般不適合于直接測(cè)試、混合培養(yǎng)基、血培養(yǎng)基或含有不同微生物的其它復(fù)雜樣本。

已經(jīng)使用用于微生物檢測(cè)的若干其它質(zhì)譜法方法。舉例來(lái)說(shuō)，已經(jīng)描述基于質(zhì)譜法的蛋白質(zhì)定序方法，其中液相層析與串連質(zhì)譜法結(jié)合(LC-MS/MS)，且根據(jù)從微生物樣本導(dǎo)出的蛋白質(zhì)的酶消化獲得序列信息。被稱為“從下到上”蛋白質(zhì)組研究的此方法是用于蛋白質(zhì)識(shí)別的廣泛實(shí)踐的方法。所述方法可提供對(duì)亞種或菌株層級(jí)的識(shí)別，因?yàn)閷游龇蛛x允許除僅核糖體蛋白質(zhì)外的額外蛋白質(zhì)的檢測(cè)，包含可用于抗生素抗性標(biāo)記和毒性因數(shù)的表征的那些。

與“從下到上”蛋白質(zhì)組研究相比，“從上到下”蛋白質(zhì)組研究指代其中將蛋白質(zhì)樣本完整地引入質(zhì)譜儀而無(wú)需酶、化學(xué)品或其它解離方式的分析方法。從上到下的分析實(shí)現(xiàn)完整蛋白質(zhì)的研究，從而允許直接在蛋白質(zhì)層級(jí)的識(shí)別、主要結(jié)構(gòu)確定以及轉(zhuǎn)譯后修飾(PTM)的局部化。從上到下的蛋白質(zhì)組分析通常包括將完整蛋白質(zhì)引入質(zhì)譜儀的電離源中，使蛋白質(zhì)離子斷裂，且測(cè)量如此產(chǎn)生的各種片段的質(zhì)荷比和豐度。所得分段比肽分段復(fù)雜得多，這在無(wú)本文教示的方法存在下可能必須要使用具有極高質(zhì)量準(zhǔn)確性和分辨率能力的質(zhì)譜儀以便以可接受的確定性解譯分段圖案。所述解譯一般包含將觀測(cè)的分段圖案與包含從已知樣本產(chǎn)生的經(jīng)編譯實(shí)驗(yàn)分段結(jié)果的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，或替代地與理論上預(yù)測(cè)分段圖案進(jìn)行比較。舉例來(lái)說(shuō)，Liu等(《經(jīng)由四極/飛行時(shí)間串連質(zhì)譜儀中的離子阱碰撞引起的解離和離子/離子反應(yīng)對(duì)先驗(yàn)未知蛋白質(zhì)的從上到下的蛋白質(zhì)識(shí)別/表征(Top-Down Protein Identification/Characterization of a Priori Unknown Proteins via Ion Trap Collision-Induced Dissociation and Ion/Ion Reactions in a Quadrupole/Time-of-Flight Tandem Mass Spectrometer)》，《分析化學(xué)(Anal.Chem.)》，2009，81，1433-1441)已經(jīng)描述對(duì)具有多達(dá)[1]28kDa的質(zhì)量的經(jīng)改質(zhì)和未改質(zhì)的未知蛋白質(zhì)的從上到下的蛋白質(zhì)識(shí)別和表征。

從上到下的分析優(yōu)于從下到上的分析的優(yōu)點(diǎn)在于可直接識(shí)別蛋白質(zhì)，而不是如從下到上的分析中肽的情況那樣進(jìn)行推斷。另一優(yōu)點(diǎn)在于可以識(shí)別蛋白質(zhì)的替代形式，例如轉(zhuǎn)譯后修飾和拼接變體。然而，從上到下的分析當(dāng)與從下到上的分析相比時(shí)具有的缺點(diǎn)在于許多蛋白質(zhì)會(huì)難以隔離和純化。因此，不完全分離混合物中的每一蛋白質(zhì)可在質(zhì)譜分析后即刻產(chǎn)生多個(gè)離子物質(zhì)，每一物質(zhì)對(duì)應(yīng)于不同相應(yīng)質(zhì)子化程度和不同相應(yīng)電荷態(tài)，且每一此類離子物質(zhì)可帶來(lái)多個(gè)同位素變體。因此，需要用于解譯所得高度復(fù)雜的質(zhì)譜的方法。

離子-離子反應(yīng)在近十年來(lái)已經(jīng)在生物質(zhì)譜法領(lǐng)域中得到較大實(shí)用性，主要使用電子轉(zhuǎn)移解離(ETD)來(lái)解離肽/蛋白質(zhì)且確定主要序列信息和表征轉(zhuǎn)譯后修飾。

作為另一類型的離子-離子反應(yīng)的質(zhì)子轉(zhuǎn)移也已經(jīng)在生物應(yīng)用中充分使用。以實(shí)驗(yàn)方式，通過致使來(lái)自樣本的多正電荷蛋白質(zhì)離子(即，蛋白質(zhì)陽(yáng)離子)與單電荷反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)以便減少個(gè)別蛋白質(zhì)陽(yáng)離子的電荷態(tài)以及蛋白質(zhì)陽(yáng)離子的此些電荷態(tài)的數(shù)目而實(shí)現(xiàn)質(zhì)子轉(zhuǎn)移。當(dāng)反應(yīng)劑陰離子大量超過蛋白質(zhì)陽(yáng)離子群體而存在時(shí)，這些反應(yīng)以偽一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)繼續(xù)。反應(yīng)的速率與蛋白質(zhì)陽(yáng)離子(或其它多電荷陽(yáng)離子)的電荷的平方乘以反應(yīng)劑陰離子上的電荷成正比。同一關(guān)系也適用于相反極性的反應(yīng)，此處經(jīng)界定為單電荷反應(yīng)劑陽(yáng)離子與從蛋白質(zhì)樣本導(dǎo)出的多電荷陰離子的群體之間的反應(yīng)。這產(chǎn)生一系列偽一級(jí)連續(xù)反應(yīng)曲線，如由起始的多電荷蛋白質(zhì)陽(yáng)離子群體界定。這產(chǎn)生一系列偽一級(jí)連續(xù)反應(yīng)曲線，如由起始的多電荷蛋白質(zhì)陽(yáng)離子群體界定。碰撞氣體用以在微秒時(shí)間尺度(10⁸碰撞每秒)上移除過量能量，因此防止所得產(chǎn)物離子群體的分段。

質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)(PTR)已經(jīng)成功地用以識(shí)別蛋白質(zhì)混合物中的蛋白質(zhì)。此混合物簡(jiǎn)化過程已用于確定高質(zhì)量蛋白質(zhì)的電荷態(tài)和分子量。PTR也已經(jīng)用于簡(jiǎn)化從多電荷前驅(qū)體蛋白質(zhì)離子的碰撞激活導(dǎo)出的產(chǎn)物離子譜。雖然PTR減少了從多電荷蛋白質(zhì)離子導(dǎo)出的總體信號(hào)，但這由所得PTR產(chǎn)物離子的信噪比的顯著增益更多地補(bǔ)償。PTR過程是100％高效的，其產(chǎn)生僅單一系列的反應(yīng)產(chǎn)物，且不產(chǎn)生需要特殊解譯和數(shù)據(jù)分析的副反應(yīng)產(chǎn)品。

PTR對(duì)肽、多肽和蛋白質(zhì)的分析的應(yīng)用的各種方面已經(jīng)在以下文獻(xiàn)中描述：在發(fā)明人Hunt等的名義下的第McLuckey號(hào)美國(guó)專利、在發(fā)明人Hartmer等的名義下的第2012/0156707 A1號(hào)美國(guó)專利預(yù)授權(quán)公開案、在發(fā)明人Zabrouskov的名義下的第2012/0205531 A1號(hào)美國(guó)預(yù)授權(quán)公開案；McLuckey等的《離子/離子質(zhì)子轉(zhuǎn)移動(dòng)力學(xué)：用于從蛋白質(zhì)混合物的電噴射導(dǎo)出的離子的分析的暗示(Ion/Ion Proton-Transfer Kinetics:Implications for Analysis of Ions Derived from Electrospray of Protein Mixtures)》，《分析化學(xué)(Anal.Chem.)》1998，70，1198-1202；Stephenson等的《涉及非共價(jià)交互的生物離子的離子-離子質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)：全肌紅蛋白(Ion-ion Proton Transfer Reactions of Bio-ions Involving Noncovalent Interactions:Holomyoglobin)》，《美國(guó)質(zhì)譜學(xué)會(huì)期刊(J.Am.Soc.Mass Spectrom.)》，1998，8，637-644；Stephenson等的《氣相中的離子/離子反應(yīng)：涉及多電荷蛋白質(zhì)的質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)(Ion/Ion Reactions in the Gas Phase:Proton Transfer Reactions Involving Multiply-Charged Proteins)》，《美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)期刊(J.Am.Chem.Soc.)》，1996，118，7390-7397；McLuckey等的《用于電噴射質(zhì)譜法中改進(jìn)的有效質(zhì)量分辨率的離子/分子反應(yīng)(Ion/Molecule Reactions for Improved Effective Mass Resolution in Electrospray Mass Spectrometry)》，《分析化學(xué)(Anal.Chem.)》，1995，67，2493-2497；Stephenson等的《用于蛋白質(zhì)混合物分析的離子/離子質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)(Ion/Ion Proton Transfer Reactions for Protein Mixture Analysis)》，《分析化學(xué)(Anal.Chem.)》，1996，68，4026-4032；Stephenson等的《用于寡肽混合物分析的離子/離子反應(yīng)：對(duì)由0.5-100kDa組分構(gòu)成的混合物的應(yīng)用(Ion/Ion Reactions for Oligopeptide Mixture Analysis:Application to Mixtures Comprised of 0.5-100kDa Components)》，1998，9，585-596；Stephenson等的《用于通過電噴射質(zhì)譜法的高質(zhì)量物質(zhì)和混合物組分的改進(jìn)質(zhì)量確定的電荷操縱(Charge Manipulation for Improved Mass Determination of High-mass Species and Mixture Components by Electrospray Mass Spectrometry)》，《質(zhì)譜學(xué)期刊(J.Mass Spectrom.)》，1998，33，664-672；Stephenson等的《經(jīng)由離子/離子化學(xué)方法從多電荷母代離子導(dǎo)出的產(chǎn)物離子譜的簡(jiǎn)化(Simplification of Product Ion Spectra Derived from Multiply Charged Parent Ions via Ion/Ion Chemistry)》，《分析化學(xué)(Anal.Chem.)》，1998，70，3533-3544，以及Scalf等的《電荷減少電噴射質(zhì)譜法(Charge Reduction Electrospray Mass Spectrometry)》，《分析化學(xué)(Anal.Chem.)》，2000，72，52-60。一般離子/離子化學(xué)方法的各種方面已經(jīng)在McLuckey等的《高質(zhì)量多電荷離子的離子/離子化學(xué)方法(Ion/Ion Chemistry of High-Mass Multiply Charged Ions)》，《質(zhì)譜學(xué)回顧(Mass Spectrom.Rev.)》，1998，17，369-407以及在發(fā)明人McLuckey等的名義下的第7,550,718B2號(hào)美國(guó)專利中描述。用于執(zhí)行PTR且用于減少質(zhì)譜儀中的離子電荷態(tài)的設(shè)備已經(jīng)在以下各者中描述：在發(fā)明人Chen等的名義下的第2011/0114835 A1號(hào)美國(guó)預(yù)授權(quán)公開案，在發(fā)明人Brown等的名義下的第2011/0189788 A1號(hào)美國(guó)預(yù)授權(quán)公開案，在發(fā)明人Brown等的名義下的第8,283,626 B2號(hào)美國(guó)專利，以及在發(fā)明人Frey等的名義下的第7,518,108B2號(hào)美國(guó)專利。PTR電荷減少技術(shù)對(duì)生物的檢測(cè)和識(shí)別的適配已由McLuckey等描述(《用于生物的檢測(cè)和識(shí)別的電噴射/離子阱質(zhì)譜法(Electrospray/Ion Trap Mass Spectrometry for the Detection and Identification of Organisms)》，生物質(zhì)譜法的首次聯(lián)合服務(wù)研討會(huì)會(huì)刊，巴爾的摩，馬里蘭州，1997年7月28-30日，127-132)。

由PTR過程產(chǎn)生的產(chǎn)物離子可通過使用被稱為“離子停車”的技術(shù)積聚到一個(gè)或若干電荷態(tài)中。離子停車在反應(yīng)周期期間使用補(bǔ)充AC電壓在特定質(zhì)荷比(m/z)值下將由任何給定蛋白質(zhì)分子的原始不同地質(zhì)子化離子形成的PTR產(chǎn)物離子固結(jié)為特定電荷態(tài)。此技術(shù)可用以將產(chǎn)物離子信號(hào)集中到單個(gè)或有限數(shù)目的電荷態(tài)中(且因此集中到單個(gè)或幾個(gè)相應(yīng)m/z值中)以用于較高靈敏度檢測(cè)或者使用碰撞激活、ETD或其它離子操縱技術(shù)的進(jìn)一步操縱。離子停車的各種方面已經(jīng)在以下各者中描述：在發(fā)明人McLuckey的名義下的第7,064,317 B2號(hào)美國(guó)專利；在發(fā)明人McLuckey的名義下的第7,355,169 B2號(hào)美國(guó)專利；在發(fā)明人McLuckey的名義下的第8,334,503 B2號(hào)美國(guó)專利；在發(fā)明人Le Blanc的名義下的第8,440,962 B2號(hào)美國(guó)專利；且在以下文獻(xiàn)中描述：McLuckey等的《在電動(dòng)離子阱中的離子/離子反應(yīng)期間的離子停車(Ion Parking during Ion/Ion Reactions inElectrodynamic Ion Traps)》，《分析化學(xué)(Anal.Chem.)》，2002，74，336-346；Reid等的《來(lái)自復(fù)雜混合物的完整蛋白質(zhì)的氣相濃度、純化和識(shí)別(Gas-Phase Concentration,Purification,and Identification of Whole Proteins from Complex Mixtures)》，《美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)期刊(J.Am.Chem.Soc.)》，2002，124，7353-7362；He等的《在單個(gè)氣相純化和濃度程序之后多個(gè)蛋白質(zhì)離子電荷態(tài)的解離(Dissociation of Multiple Protein Ion Charge States Following a Single Gas-Phase Purification and Concentration Procedure)》，《分析化學(xué)(Anal.Chem.)》，2002，74，4653-4661；Xia等的《混合線性離子阱中的相互存儲(chǔ)模式離子/離子反應(yīng)(Mutual Storage Mode Ion/Ion Reactions in a Hybrid Linear Ion Trap)》，《美國(guó)質(zhì)譜學(xué)會(huì)期刊(J.Am.Soc.Mass Spectrom.)》，2005，16，71-81；Chrisman等的《平行離子停車：改善電子轉(zhuǎn)移解離中的母代到第一代產(chǎn)物的轉(zhuǎn)換(Parallel Ion Parking:Improving Conversion of Parents to First-Generation Products in Electron Transfer Dissociation)》，《分析化學(xué)(Anal.Chem.)》，2005，77(10)，3411-3414，以及Chrisman等的《蛋白質(zhì)混合物的平行離子停車(Parallel Ion Parking of Protein Mixtures)》，《分析化學(xué)(Anal.Chem.)》，2006，78，310-316。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明教示了離子-離子反應(yīng)化學(xué)方法的應(yīng)用，其中采用質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)以簡(jiǎn)化從包括從微生物提取的化合物混合物的樣本的電噴射電離導(dǎo)出的錯(cuò)離子群體的質(zhì)譜分析。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過使此些離子的質(zhì)荷比受限子集經(jīng)受PTR，所得產(chǎn)物離子的群體包括具有較低總電荷值的電荷態(tài)的簡(jiǎn)單得多的群體(其中詞“較低”或“減少”在此上下文中指代在絕對(duì)值方面較低或減少)，其可容易解析且指派給特定蛋白質(zhì)或肽離子。因?yàn)镻TR產(chǎn)物離子表示比原始前驅(qū)體離子小的從電荷態(tài)的復(fù)雜混合物導(dǎo)出的多電荷物質(zhì)的子集，所以極大地簡(jiǎn)化質(zhì)譜解譯，且可對(duì)從微生物提取物導(dǎo)出的單個(gè)蛋白質(zhì)或其它組分執(zhí)行使用串連質(zhì)譜法(MS/MS或MSⁿ)的目標(biāo)分析。

從給定質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)產(chǎn)生的電荷減少的蛋白質(zhì)和肽產(chǎn)物離子產(chǎn)生比原始m/z值大的質(zhì)荷比(m/z)值。對(duì)于具有相同m/z值但不同質(zhì)量和電荷的蛋白質(zhì)離子的混合物，所述混合物可在微秒或毫秒時(shí)間尺度上分離。此外，具有不同質(zhì)量和電荷的相同m/z值的這些多電荷蛋白質(zhì)離子可基于反應(yīng)的電荷平方相依性而與從小分子、脂質(zhì)、溶劑或其它干擾物導(dǎo)出的低m/z值背景離子分離。多電荷離子因此及時(shí)與背景信號(hào)分離因此在高度增加的信噪比(s/n)比率下產(chǎn)生分離蛋白質(zhì)混合物。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由于這兩個(gè)因素，蛋白質(zhì)/肽或任何其它分析物產(chǎn)物離子的譜特征可以與大多數(shù)干擾物離子的那些譜特征顯著分離。另外，可執(zhí)行PTR反應(yīng)的多個(gè)階段以在低分辨率儀器上分離蛋白質(zhì)混合物，例如線性離子阱質(zhì)譜儀，以便簡(jiǎn)化且隔離這些蛋白質(zhì)和其它分析物以使得可經(jīng)由MSⁿ分析執(zhí)行目標(biāo)分析。本發(fā)明人已進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，通過與PTR反應(yīng)結(jié)合執(zhí)行“離子停車”程序可甚至進(jìn)一步放大簡(jiǎn)單PTR反應(yīng)的有利性質(zhì)，因此使得系統(tǒng)分析師能夠至少部分地選擇或控制由PTR反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物離子電荷態(tài)分布。

PTR也可用以改善質(zhì)譜法中的高質(zhì)量性能。在質(zhì)譜法中，可對(duì)離子指派整數(shù)標(biāo)稱質(zhì)量或質(zhì)荷比或者準(zhǔn)確或確切的質(zhì)量或質(zhì)荷比。準(zhǔn)確或確切的質(zhì)量或質(zhì)荷比可視為包括整數(shù)分量或值以及十進(jìn)制分量或值。原子和分子質(zhì)量是以道爾頓(Da)的單位測(cè)得，且m/z比值一般是以每基本電荷的道爾頓或Da/e或湯姆森(Th)的單位給定。應(yīng)注意，在本文檔中的m/z比的描述數(shù)值的實(shí)例中，此些比率應(yīng)理解為以每基本電荷的道爾頓或Th的單位提供。準(zhǔn)確或確切(即非整數(shù))質(zhì)量或m/z比可表示為整數(shù)標(biāo)稱質(zhì)量或質(zhì)荷比值或分量以及對(duì)應(yīng)的十進(jìn)制分量。因此，如本文檔中所使用，準(zhǔn)確質(zhì)量確定或質(zhì)量分析可視為包括子整數(shù)精度，即±0.5Da或更好且優(yōu)選0.1Da或更好的準(zhǔn)確性。

替代地，準(zhǔn)確或確切質(zhì)量或m/z比可在百萬(wàn)分率(ppm)質(zhì)量準(zhǔn)確性方面界定。對(duì)于多肽和蛋白質(zhì)的質(zhì)譜確定，一般需要50ppm或更好、較優(yōu)選10ppm或更好且再優(yōu)選1ppm或更好的實(shí)驗(yàn)質(zhì)量準(zhǔn)確性，因?yàn)檫@些分子及其離子經(jīng)常具有至少10,000Da且多達(dá)100,000Da的分子或離子量。因此，如本文檔中所使用，準(zhǔn)確質(zhì)量確定或質(zhì)量分析可替代地被視為包括50ppm或更好、較優(yōu)選10ppm或更好且再優(yōu)選1ppm或更好的準(zhǔn)確性。

除改善此類型分析的信噪比之外，本發(fā)明人還考慮了蛋白質(zhì)離子上的電荷減少造成這些大離子在氣相中再折疊，如Zhao等的《離子/離子質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)對(duì)氣相細(xì)胞色素C離子的構(gòu)形的影響(Effects of Ion/Ion Proton Transfer Reactions on Conformation of Gas-Phase Cytochrome c Ions)》，《美國(guó)質(zhì)譜學(xué)會(huì)期刊(J.Am.Soc.Mass Spectrom.)》2010，21，1208-1217中描述。據(jù)相信，這帶來(lái)更緊湊的配置，其減少蛋白質(zhì)離子的碰撞橫截面并且因此增加其穩(wěn)定性而防止由于與存在于質(zhì)量分析器腔室中的背景氣體分子的碰撞而分段。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)此效應(yīng)可特別有益于采用鏡像電流檢測(cè)的質(zhì)量分析器，例如傅里葉變換離子回旋共振(FT-ICR)質(zhì)量分析器或Orbitrap^TM質(zhì)量分析器(可購(gòu)自美國(guó)馬薩諸塞州的Thermo Fisher Scientific of Waltham的一類靜電阱質(zhì)量分析器)中所完成。改進(jìn)的高質(zhì)量性能的另一潛在原因是進(jìn)入由PTR過程產(chǎn)生的給定蛋白質(zhì)離子的大的能量沉積。由于PTR過程而沉積的能量超過100千卡/摩爾，且隨后因碰撞能量的存在而有效地衰減。此快速加熱過程使得可能經(jīng)由離子-偶極子、離子-引發(fā)偶極子或偶極子-引發(fā)偶極子交互而附著到蛋白質(zhì)的中性分子“沸騰”。最重要的是，用于高質(zhì)量蛋白質(zhì)的電荷態(tài)的減少可顯著改善這些離子從其中通常執(zhí)行PTR過程的離子導(dǎo)向器、離子存儲(chǔ)或離子捕獲裝置的相對(duì)高壓力傳送到例如Orbitrap^TM質(zhì)量分析器等質(zhì)量分析器的較低壓力區(qū)。減少的電荷態(tài)意味著離子以較少動(dòng)能傳送，因此限制了離子散射、直接分段或亞穩(wěn)定物質(zhì)的形成。本發(fā)明人進(jìn)一步考慮此后一種性質(zhì)在例如Orbitrap^TM型靜電阱質(zhì)量分析器等準(zhǔn)確質(zhì)譜儀中實(shí)現(xiàn)PTR產(chǎn)物離子的高準(zhǔn)確性質(zhì)量分析方面尤其顯著，所述準(zhǔn)確質(zhì)譜儀檢測(cè)在一延伸時(shí)間范圍中通過循環(huán)離子運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的鏡像電流。

本發(fā)明教示尤其可用于具有超過50kDa的分子量的完整蛋白質(zhì)的分析和識(shí)別。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)出人意料的結(jié)果，所述結(jié)果與上文提到的各種有利因素結(jié)合在一起可實(shí)現(xiàn)從自然微生物樣本導(dǎo)出的極復(fù)雜混合物中準(zhǔn)確識(shí)別多個(gè)完整蛋白質(zhì)或大的肽。此識(shí)別可在物質(zhì)、亞種或甚至菌株層級(jí)上實(shí)現(xiàn)微生物識(shí)別。目標(biāo)蛋白質(zhì)或多肽離子單物質(zhì)或多物質(zhì)可經(jīng)選擇以便基于先驗(yàn)知識(shí)或信息個(gè)別地或組合地指示特定微生物或細(xì)胞類型或者微生物或細(xì)胞類型的特定菌株或變體或者給定毒性因數(shù)或毒素在樣本中的存在，或者指示微生物或細(xì)胞抵抗抗菌劑化合物或抗生素藥品的能力。

本發(fā)明在一個(gè)方面中提供對(duì)傳統(tǒng)的從下到上蛋白質(zhì)組研究方法的替代，即經(jīng)由方法對(duì)從微生物細(xì)胞導(dǎo)出的完整蛋白質(zhì)的從上到下分析，所述方法適用于大體上所有微生物，包含革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、分枝桿菌、霉?jié){菌、酵母、原生動(dòng)物、絲狀(即，微觀)真菌。本發(fā)明提供甚至在含有微生物的混合物和/或直接來(lái)自純的和/或混合培養(yǎng)基及來(lái)自直接樣本(例如，表面棉簽、體液等)分析的微生物的樣本中在種屬、物質(zhì)、亞種、菌株致病變型和血清變型層級(jí)對(duì)微生物的識(shí)別。另外，本文教示的方法可用于毒性因數(shù)、抗生素抗性和易感性標(biāo)記或其它特性的目標(biāo)檢測(cè)。本發(fā)明教示的從上到下方法是簡(jiǎn)單且快速的，因?yàn)椴恍枰獦颖镜幕瘜W(xué)或酶分解且實(shí)時(shí)地實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)處理。

根據(jù)本發(fā)明教示的方法可包括以下步驟中的至少一或多個(gè)：微生物細(xì)胞中斷，蛋白質(zhì)的溶解，樣本凈化(脫鹽、移除不可溶組分和殘?jiān)?，?或聚集)，樣本灌注或流動(dòng)注入，快速部分液體層析分離，標(biāo)準(zhǔn)層析分離，等電點(diǎn)聚焦，溶液中蛋白質(zhì)的電離，離子的給定m/z范圍的隔離，致使離子的隔離范圍經(jīng)受PTR以便形成第一代PTR產(chǎn)物離子，第一代PTR產(chǎn)物離子的m/z范圍的任選隔離，MS或MS/MS模式中的任選質(zhì)譜法，任選地致使第一代PTR產(chǎn)物離子的隔離范圍經(jīng)受第二PTR反應(yīng)以便形成第二代PTR產(chǎn)物離子，MS或MS/MS模式中的質(zhì)譜法，以及經(jīng)由分子量分析和/或蛋白質(zhì)序列分析的微生物識(shí)別，或使用任何統(tǒng)計(jì)分類方法。優(yōu)選但不一定地，以高分辨率、高準(zhǔn)確性質(zhì)譜儀執(zhí)行質(zhì)譜法步驟，例如包括Orbitrap^TM質(zhì)量分析器的質(zhì)譜儀。

因?yàn)閳?zhí)行使用化學(xué)反應(yīng)劑的有限集合的常用方法，所以本發(fā)明教示的方法適合于在完全自動(dòng)系統(tǒng)內(nèi)使用以用于樣本制備和質(zhì)譜法。理想地，這些方法可從樣本制備到結(jié)果報(bào)告都是自動(dòng)的。結(jié)果可自動(dòng)傳送到醫(yī)院的電子醫(yī)療記錄系統(tǒng)，其中結(jié)果可直接鏈接到患者治療策略、保險(xiǎn)、記賬或在流行病報(bào)告中使用。此集成系統(tǒng)促進(jìn)了在醫(yī)院、本地、地區(qū)和全球?qū)蛹?jí)對(duì)流行病爆發(fā)的跟蹤。對(duì)于高處理量實(shí)驗(yàn)室，多個(gè)系統(tǒng)可介接到中央計(jì)算機(jī)，所述中央計(jì)算機(jī)在報(bào)告之前整合來(lái)自不同儀器的數(shù)據(jù)。所述系統(tǒng)可導(dǎo)入表現(xiàn)型易感性數(shù)據(jù)，其中所述數(shù)據(jù)可與由本發(fā)明產(chǎn)生的識(shí)別、毒性、抗生素抗性和鍵入信息組合。

因此，在第一方面中，揭示一種用于識(shí)別液體樣本內(nèi)的蛋白質(zhì)/多肽或其它生物相關(guān)化合物的存在或不存在的方法，所述液體樣本包括化合物的混合物，所述混合物包含多種蛋白質(zhì)化合物或多種多肽化合物或多種蛋白質(zhì)和多肽或其它化合物，其中所述方法包括：(a)將所述液體樣本的一部分或全部引入到質(zhì)譜儀的電噴射電離源中；(b)通過電噴射電離形成所述液體樣本的所述部分的所述化合物混合物的帶正電離子，所述帶正電離子包括多個(gè)離子物質(zhì)；(c)隔離包括第一質(zhì)荷比(m/z)比率范圍的所述離子物質(zhì)的第一子集，所述范圍包含所述分析物化合物的多質(zhì)子化分子物質(zhì)的m/z比；(d)通過致使所述隔離的離子物質(zhì)的第一子集在預(yù)定持續(xù)時(shí)間中與反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)而從所述隔離的離子物質(zhì)的第一子集產(chǎn)生多個(gè)第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)，所述反應(yīng)劑陰離子在反應(yīng)后從一或多個(gè)離子物質(zhì)中的包括蛋白質(zhì)或多肽化合物的質(zhì)子化物質(zhì)的每一者提取質(zhì)子；(e)使用質(zhì)量分析器產(chǎn)生所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)或從所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)產(chǎn)生的第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)的質(zhì)譜；(f)進(jìn)行對(duì)所述第一代或所述第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)的所述質(zhì)譜的搜索以找到作為所述蛋白質(zhì)或多肽分析物化合物的診斷的一或多個(gè)m/z比的集合；以及(g)基于在所述質(zhì)譜中識(shí)別的m/z比的集合與一或多個(gè)診斷m/z比的集合之間的相似性量度而產(chǎn)生所述樣本內(nèi)的所述分析物化合物的存在或不存在的確定。所述相似性量度可包括基于發(fā)現(xiàn)在經(jīng)識(shí)別m/z比的測(cè)得集合中發(fā)生的一或多個(gè)診斷m/z比的所確定百分比或比例而計(jì)算的度量。替代地，可通過比較所述質(zhì)譜中識(shí)別的m/z比的集合與基于蛋白質(zhì)、DNA或碳水化合物的數(shù)據(jù)庫(kù)中包含的集合之間的相似性量度；以及(h)使用前述信息作為使用譜庫(kù)、基于序列的搜索、統(tǒng)計(jì)分類方法(包含但不限于貝葉斯、邏輯回歸和決策樹分類器)積極地識(shí)別任何未知的微生物，來(lái)確定樣本內(nèi)的分析物化合物的存在。作為在步驟(b)中形成帶正電離子的一個(gè)替代方案，實(shí)際上可產(chǎn)生帶負(fù)電分析物離子物質(zhì)。在此些情況下，選擇反應(yīng)劑陰離子以便將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到分析物離子物質(zhì)，進(jìn)而減少其負(fù)電荷的絕對(duì)值。

在第二方面中，揭示一種識(shí)別樣本中的微生物類型的存在或不存在的方法，其包括：(i)識(shí)別在所述樣本中的同時(shí)存在是所述樣本中的所述微生物類型的存在的診斷的一系列分子量；(ii)識(shí)別在所述樣本中的同時(shí)存在是所述樣本中的所述微生物類型的存在的診斷的分析物化合物列表，所述分析物化合物列表包括蛋白質(zhì)化合物、多肽化合物或蛋白質(zhì)和多肽化合物兩者；(iii)從所述樣本提取包括從樣本導(dǎo)出的蛋白質(zhì)和多肽的混合物的液體溶液；(iv)針對(duì)所述列表中的每一相應(yīng)分析物化合物執(zhí)行分析步驟的集合；以及(v)如果所述液體溶液內(nèi)識(shí)別出所述分析物化合物列表的微生物特定分析物化合物的存在，那么識(shí)別所述樣本內(nèi)的微生物類型的存在。針對(duì)所述列表中的每一相應(yīng)分析物執(zhí)行的分析步驟包括：(a)將所述液體溶液的一部分引入到質(zhì)譜儀的電噴射電離源中；(b)通過電噴射電離形成所述液體溶液的所述部分的所述化合物混合物的帶正電離子，所述帶正電離子包括多個(gè)離子物質(zhì)；(c)隔離包括第一質(zhì)荷比(m/z)比率范圍的所述離子物質(zhì)的第一子集，所述范圍包含所述相應(yīng)分析物化合物的隨機(jī)或特定預(yù)定多質(zhì)子化分子物質(zhì)的m/z比；(d)通過致使所述隔離的離子物質(zhì)的第一子集在預(yù)定持續(xù)時(shí)間中與反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)而從所述隔離的離子物質(zhì)的第一子集產(chǎn)生多個(gè)第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)，所述反應(yīng)劑陰離子從一或多個(gè)離子物質(zhì)中的包括蛋白質(zhì)或多肽化合物的質(zhì)子化物質(zhì)的每一者自發(fā)地提取質(zhì)子；(e)使用質(zhì)量分析器產(chǎn)生所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)或從所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)產(chǎn)生的第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)的質(zhì)譜；(f)進(jìn)行所述第一代或所述第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)的所述質(zhì)譜的搜索以找到作為所述相應(yīng)分析物化合物的診斷的一或多個(gè)m/z比的集合；以及(g)基于所述質(zhì)譜中識(shí)別的m/z比的集合與一或多個(gè)診斷m/z比的所述集合之間的相似性量度而識(shí)別所述液體溶液內(nèi)的所述相應(yīng)分析物化合物的存在。所述相似性量度可包括基于發(fā)現(xiàn)在經(jīng)識(shí)別m/z比的測(cè)得集合中發(fā)生的一或多個(gè)診斷m/z比的所確定百分比或比例而計(jì)算的度量?？蓮淖V庫(kù)或序列數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)出診斷m/z比。如果在步驟(c)中隔離的m/z比是隨機(jī)多質(zhì)子化分子物質(zhì)，那么在步驟(f)中進(jìn)行的搜索是基于序列的搜索。否則，如果在步驟(c)中隔離的m/z比是特定預(yù)定多質(zhì)子化分子物質(zhì)，那么在步驟(f)中進(jìn)行譜庫(kù)搜索。除使用前述信息作為使用譜庫(kù)或基于序列的搜索而積極地識(shí)別未知微生物之外，還可利用統(tǒng)計(jì)分類方法(包含但不限于貝葉斯、邏輯回歸和決策樹分類器)用于微生物表征和識(shí)別。作為在步驟(b)中形成帶正電離子的一個(gè)替代方案，實(shí)際上可產(chǎn)生帶負(fù)電分析物離子物質(zhì)。在此些情況下，選擇反應(yīng)劑陰離子或陽(yáng)離子以便將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到分析物陰離子物質(zhì)，從而減少其負(fù)電荷的絕對(duì)值。本文所描述的PTR實(shí)驗(yàn)過程的控制可使用實(shí)時(shí)光譜解卷積實(shí)時(shí)地手動(dòng)或自動(dòng)執(zhí)行。

在上文中的術(shù)語(yǔ)“實(shí)時(shí)譜解卷積”指代質(zhì)譜數(shù)據(jù)的譜解卷積，其與產(chǎn)生(或已經(jīng)產(chǎn)生)所述質(zhì)譜數(shù)據(jù)的質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)或分析運(yùn)行是同時(shí)執(zhí)行的。舉例來(lái)說(shuō)，通過在梯度溶離期間在第一保持層析滯留時(shí)間溶離的分析物的質(zhì)量分析獲取的質(zhì)譜數(shù)據(jù)可經(jīng)解卷積，以便識(shí)別分析物，同時(shí)繼續(xù)在同一梯度溶離期間在第二較晚的滯留時(shí)間溶離的額外分析物的額外質(zhì)譜數(shù)據(jù)的收集。同樣，可執(zhí)行額外質(zhì)譜數(shù)據(jù)的解卷積以便識(shí)別額外分析物，同時(shí)繼續(xù)在同一梯度溶離期間在第三溶離時(shí)間溶離的分析物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)的收集?？赏ㄟ^使用快速計(jì)算機(jī)來(lái)促進(jìn)實(shí)時(shí)光譜解卷積，例如采用并行處理或圖形處理單元(GPU)執(zhí)行必要計(jì)算的計(jì)算機(jī)。替代地或另外，可通過使用計(jì)算上高效或經(jīng)優(yōu)化算法來(lái)促進(jìn)實(shí)時(shí)譜解卷積，例如至少部分以匯編語(yǔ)言編寫或廣泛利用高速緩沖存儲(chǔ)器中查找表的算法。

更一般地，術(shù)語(yǔ)“實(shí)時(shí)”可理解為意味著當(dāng)參考與數(shù)據(jù)獲取過程相關(guān)聯(lián)的事件或活動(dòng)而使用時(shí)，在所述數(shù)據(jù)獲取過程的一些方面或子過程在進(jìn)行中的同時(shí)發(fā)生所述事件或活動(dòng)。數(shù)據(jù)獲取過程自身可包含以下個(gè)別子過程中的一或多個(gè)：樣本純化(例如，固相萃取、尺寸排阻層析)；樣本分離(例如，層析法)；進(jìn)入質(zhì)譜儀的樣本傳送(例如，溶離液從層析儀的灌注或進(jìn)入)；離子源中的樣本電離以產(chǎn)生第一代離子；離子的選擇和隔離以用于進(jìn)一步操縱；致使從樣本導(dǎo)出的離子的分段或從樣本導(dǎo)出的離子與反應(yīng)劑離子的反應(yīng)以便產(chǎn)生第一代產(chǎn)物離子；產(chǎn)物離子的任選選擇和隔離；產(chǎn)物離子的任選進(jìn)一步分段或產(chǎn)物離子的進(jìn)一步反應(yīng)；離子(第一代離子或第一代或后續(xù)代產(chǎn)物離子)到質(zhì)量分析器的傳送，質(zhì)量分析器的檢測(cè)器對(duì)離子質(zhì)荷比的檢測(cè)和測(cè)量；以及從檢測(cè)和測(cè)量導(dǎo)出的數(shù)據(jù)向用于存儲(chǔ)、數(shù)學(xué)分析等的數(shù)字處理器的傳送。如此界定的可“實(shí)時(shí)”發(fā)生的事件或活動(dòng)可包含但不一定限于：樣本中的分析物的存在的確定或識(shí)別；樣本中的微生物的存在的識(shí)別或確定；以及向用戶提供樣本中的分析物或微生物的存在的識(shí)別或確定的通知。

本發(fā)明教示的上述以及各種其它特征和優(yōu)點(diǎn)將從以下描述和所附權(quán)利要求書變得更完全明了，或可通過如下文闡述的本發(fā)明的實(shí)踐而習(xí)得。

附圖說(shuō)明

為進(jìn)一步闡明本發(fā)明的以上和其它優(yōu)點(diǎn)及特征，將參照附圖中說(shuō)明的其特定實(shí)施例呈現(xiàn)本發(fā)明的更具體描述。應(yīng)了解，這些圖只是描繪了本發(fā)明的所說(shuō)明的實(shí)施例，且因此不應(yīng)當(dāng)被看作限制了本發(fā)明的范圍。本發(fā)明將以額外特殊性和細(xì)節(jié)經(jīng)由使用隨附圖式進(jìn)行描述和闡述，附圖中：

圖1是示意性地說(shuō)明用于來(lái)自至少一個(gè)微生物的可溶蛋白質(zhì)的快速提取和分析以用于識(shí)別所述至少一個(gè)微生物的系統(tǒng)的框圖；

圖2是適合于與根據(jù)本發(fā)明教示的方法結(jié)合采用的示范性質(zhì)譜儀的示意性表示，所述質(zhì)譜儀包括混合系統(tǒng)，所述混合系統(tǒng)包括四極濾質(zhì)器、雙壓力四極離子阱質(zhì)量分析器和靜電阱質(zhì)量分析器；

圖3A是根據(jù)本發(fā)明教示的第一方法的流程圖；

圖3B是根據(jù)本發(fā)明教示的替代方法的流程圖；

圖3C是根據(jù)本發(fā)明教示的另一替代方法的流程圖；

圖3D和圖3E說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明教示的又一替代方法的流程圖；

圖3F是根據(jù)本發(fā)明教示的再另一替代方法的流程圖；

圖4A是經(jīng)由典型大腸桿菌提取物的直接輸注的ESI質(zhì)譜；

圖4B是通過隔離以m/z＝750Th為中心的2Th質(zhì)量窗口內(nèi)的圖4A的大腸桿菌提取物的離子且使隔離的離子與PTR反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)而產(chǎn)生的PTR產(chǎn)物離子質(zhì)譜；

圖5A是通過隔離以1200Th為中心的寬度5Th的質(zhì)量窗口內(nèi)的大腸桿菌提取物的離子且使隔離的離子與PTR反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)而產(chǎn)生的第一代PTR產(chǎn)物離子的質(zhì)譜；

圖5B是通過隔離以1320Th為中心的寬度5Th的質(zhì)量窗口內(nèi)的圖5A的第一代PTR產(chǎn)物離子的離子且第二次使隔離的第一代產(chǎn)物離子與PTR反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)而產(chǎn)生的第二代PTR產(chǎn)物離子的質(zhì)譜；

圖6A是通過隔離以640Th為中心的寬度5Th的質(zhì)量窗口內(nèi)的大腸桿菌提取物的離子且使隔離的離子與PTR反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)而產(chǎn)生的PTR產(chǎn)物離子的質(zhì)譜；

圖6B是選自圖6A的產(chǎn)物離子集合且具有833Th的m/z比的隔離的PTR產(chǎn)物離子物質(zhì)的質(zhì)譜；

圖6C是通過圖6B的隔離的PTR產(chǎn)物離子物質(zhì)的碰撞引發(fā)的解離(CID)產(chǎn)生的第二代產(chǎn)物離子的質(zhì)譜；

圖6D是選自圖6A的產(chǎn)物離子集合且具有926Th的m/z比的隔離的PTR產(chǎn)物離子物質(zhì)的質(zhì)譜；

圖6E是通過圖6D的隔離的PTR產(chǎn)物離子物質(zhì)的碰撞引發(fā)的解離產(chǎn)生的第二代產(chǎn)物離子的質(zhì)譜；

圖6F是選自圖6A的產(chǎn)物離子集合且具有917Th的m/z比的隔離的PTR產(chǎn)物離子物質(zhì)的質(zhì)譜；

圖6G是圖6F的隔離的PTR產(chǎn)物離子物質(zhì)的碰撞引發(fā)的解離產(chǎn)生的第二代產(chǎn)物離子的質(zhì)譜；

圖7A是根據(jù)本發(fā)明教示的通過電噴射產(chǎn)生的第一代前驅(qū)體離子的多個(gè)m/z范圍的同時(shí)隔離和反應(yīng)進(jìn)行的選定分析物的離子向PTR產(chǎn)物離子集合的改進(jìn)效率的PTR轉(zhuǎn)換的方法的示意性繪圖；

圖7B是如離子的改進(jìn)效率的PTR轉(zhuǎn)換方法的初始步驟中可采用的用于PTR反應(yīng)的電噴射產(chǎn)生的第一代前驅(qū)體離子的第一隨機(jī)所選范圍的隔離的示意圖；

圖7C是如可用作離子的改進(jìn)效率的PTR轉(zhuǎn)換的方法的中間步驟的對(duì)應(yīng)于不同分析物分子的PTR產(chǎn)物離子的兩個(gè)電荷態(tài)序列的辨識(shí)的示意性繪圖；

圖8是根據(jù)本發(fā)明教示的選定分析物的離子向PTR產(chǎn)物離子集合的改進(jìn)效率的PTR轉(zhuǎn)換的方法的流程圖；

圖9A是在大腸桿菌提取物的十分鐘梯度反相液相層析分離的過程期間在10分鐘30秒的滯留時(shí)間下從溶離液產(chǎn)生的第一代離子的全掃描質(zhì)譜；

圖9B是在以750Th為中心的10Th寬隔離窗口內(nèi)使六氟化硫與圖9A的樣本的隔離離子群體反應(yīng)10ms產(chǎn)生的PTR產(chǎn)物離子譜；

圖10A是在大腸桿菌提取物的六十分鐘梯度反相液相層析分離的過程期間在42分鐘30秒的滯留時(shí)間下從溶離液產(chǎn)生的第一代離子的全掃描質(zhì)譜；

圖10B是通過在以750Th為中心的10Th寬隔離窗口內(nèi)使六氟化硫與圖10A的樣本的隔離離子群體反應(yīng)10ms產(chǎn)生的PTR產(chǎn)物離子譜；

圖11A是在三十分鐘梯度反相液相層析分離的過程期間在18分鐘9秒的滯留時(shí)間下從溶離液產(chǎn)生的第一代離子的全掃描質(zhì)譜；

圖11B是通過在以750Th為中心的10Th寬隔離窗口內(nèi)PTR反應(yīng)劑離子與圖11A的樣本的隔離離子群體的反應(yīng)產(chǎn)生的PTR產(chǎn)物離子譜；

圖11C是在圖11A中標(biāo)繪了其較早溶離結(jié)果的同一三十分鐘梯度反相液相層析分離的過程期間以22分鐘27秒的滯留時(shí)間從溶離液產(chǎn)生的第一代離子的全掃描質(zhì)譜；以及

圖11D是通過在以750Th為中心的10Th寬隔離窗口內(nèi)PTR反應(yīng)劑離子與圖11C的樣本的隔離離子群體的反應(yīng)產(chǎn)生的PTR產(chǎn)物離子譜。

具體實(shí)施方式

呈現(xiàn)以下描述以使所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠制作并使用本發(fā)明，并且在特定應(yīng)用和其要求的情況下提供以下描述。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，對(duì)所描述的實(shí)施例的各種修改將是顯而易見的，并且在此的一般原則可以應(yīng)用到其他實(shí)施例。因此，本發(fā)明并不希望限于所示的實(shí)施例和實(shí)例，而是應(yīng)被賦予根據(jù)權(quán)利要求書的最廣可能的范圍。參照附圖1到11結(jié)合以下描述，本發(fā)明的具體特征和優(yōu)點(diǎn)將變得更加清楚。

現(xiàn)參看圖1，示意性地說(shuō)明用于從一或多種微生物提取蛋白質(zhì)、檢測(cè)所述蛋白質(zhì)且識(shí)別所述一或多種微生物的系統(tǒng)100。系統(tǒng)100包含樣本處置裝置115、可由樣本處置裝置115接達(dá)的樣本110，以及反應(yīng)劑、緩沖劑及類似物的源120，這些源通過各種管道或其它傳輸線流體地耦合到樣本處置裝置115。系統(tǒng)100進(jìn)一步包含第一以及任選地第二樣本純化裝置135(例如固相萃取盒)，其經(jīng)配置以用于清潔樣本(例如，去鹽、移除污染物、聚集蛋白質(zhì))，以及任選的層析柱140，其可經(jīng)配置以用于通過在質(zhì)譜分析之前的液相層析而至少部分地純化樣本110。至少一個(gè)樣本純化裝置135可包括直列式尺寸排阻層析柱，其可用以不僅移除鹽而且還移除小分子和脂質(zhì)。樣本110、第一和任選的第二樣本純化裝置135以及任選的層析柱140與流體處置泵130、各種反應(yīng)劑、緩沖劑和其它流體120以及質(zhì)譜儀150成流體連通。

樣本處置裝置115能夠準(zhǔn)備含有一或多種微生物的某一范圍的樣本類型，且將從所述微生物提取的可溶蛋白質(zhì)部分遞送到質(zhì)譜儀150用于分析。樣本110可為疑似含有一或多種微生物的任何類型，包含但不限于來(lái)自培養(yǎng)基板的隔離的群落、來(lái)自液體生長(zhǎng)介質(zhì)的細(xì)胞、血液、血培養(yǎng)基、唾液、尿、糞便、痰液、傷口和身體部位棉簽、土壤、食物、飲料、水、空氣以及環(huán)境表面棉簽。

樣本處置裝置115可包含細(xì)胞中斷構(gòu)件、機(jī)器人液體處置構(gòu)件、離心機(jī)、過濾構(gòu)件、孵育箱、混合構(gòu)件、真空泵、流體泵以及反應(yīng)劑120中的一或多者，其可用于微生物的中斷以及可溶蛋白質(zhì)部分的隔離。細(xì)菌、真菌、霉?jié){菌細(xì)胞、病毒及類似物的中斷可通過機(jī)械、化學(xué)、酶和其它方式實(shí)現(xiàn)，如此項(xiàng)技術(shù)中通常已知。機(jī)械方法包含打珠、例如French壓機(jī)及類似物的壓力的使用、超聲處理或此項(xiàng)技術(shù)中已知的其它方法?；瘜W(xué)方法包含暴露于例如尿素、硫脲或胍HCl等離液劑以使微生物細(xì)胞裂解且溶解其內(nèi)含物。替代地，有機(jī)酸/溶劑混合物可用來(lái)破壞細(xì)胞。酶方法包含使用溶菌酶、溶葡球菌酶或其它裂解酶類以在細(xì)菌細(xì)胞壁中形成“孔”，其允許內(nèi)含物滲出到周圍溶液中。

如圖1中所說(shuō)明，系統(tǒng)100進(jìn)一步包含任選的控制單元160，其可通過聯(lián)動(dòng)裝置170a-170d鏈接到系統(tǒng)100的各種組件。舉例來(lái)說(shuō)，控制單元160可鏈接到樣本110以控制樣本施加，鏈接到反應(yīng)劑120以控制各種反應(yīng)劑的施加，鏈接到泵130以控制流體處置、流動(dòng)速率等，鏈接到樣本處置裝置115以控制樣本準(zhǔn)備，且鏈接到質(zhì)譜儀150以控制質(zhì)譜法參數(shù)。在所說(shuō)明的實(shí)施例中，控制單元160也可充當(dāng)數(shù)據(jù)處理單元以例如處理來(lái)自質(zhì)譜儀150的數(shù)據(jù)，或?qū)?shù)據(jù)轉(zhuǎn)發(fā)到服務(wù)器以用于處理和存儲(chǔ)(圖1中未圖示服務(wù)器)。控制單元160也可實(shí)時(shí)確定PTR產(chǎn)物離子的任何產(chǎn)生的分子量和電荷態(tài)以用于MS/MS、MSⁿ或分子量確定?？刂茊卧?60也可用以將結(jié)果自動(dòng)轉(zhuǎn)發(fā)到醫(yī)療保健專業(yè)人士。

在一些實(shí)施例中，系統(tǒng)100經(jīng)設(shè)計(jì)以由臨床醫(yī)生或一般實(shí)驗(yàn)室技術(shù)員使用，其不一定在樣本準(zhǔn)備、LC-MS操作、LC-MS方法開發(fā)及類似等所有方面中都有專業(yè)技能。因此，控制單元160可經(jīng)設(shè)計(jì)以通過為用戶提供簡(jiǎn)化應(yīng)用程序接口而囊封數(shù)據(jù)系統(tǒng)環(huán)境，所述應(yīng)用程序接口可用以起始且監(jiān)視測(cè)定樣本110的基本上所有方面而不需要用戶與系統(tǒng)100的總體硬件和控制系統(tǒng)交互?？刂茊卧?60因此經(jīng)配置以提供用戶與控制著裝置、數(shù)據(jù)文件和用于將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為用戶可讀形式的算法的底層服務(wù)之間的分離程度。即，控制單元160使得用戶不需要知道或控制硬件以用于分析臨床樣本，且提供簡(jiǎn)化接口以從質(zhì)譜儀發(fā)送和接收信息。

控制單元160可經(jīng)配置以內(nèi)部地監(jiān)視每一樣本分析請(qǐng)求，且能夠通過系統(tǒng)100始終跟蹤分析請(qǐng)求。一旦系統(tǒng)100正在獲取或已經(jīng)獲取樣本110的數(shù)據(jù)，則控制單元160可經(jīng)配置以基于由用戶選擇的測(cè)定類型而自動(dòng)開始后處理數(shù)據(jù)。最重要的是，控制單元160可經(jīng)配置以在獲取過程期間實(shí)時(shí)處理數(shù)據(jù)。此處實(shí)時(shí)地將結(jié)果返回到用戶，其包含微生物識(shí)別、毒性和抗性表征、菌株匹配信息，以及關(guān)于抗生素易感性測(cè)試的數(shù)據(jù)。此外，控制單元160可經(jīng)配置以基于由用戶選擇的測(cè)定類型而自動(dòng)選擇后處理參數(shù)，從而一旦測(cè)定已選定且開始用于分析則進(jìn)一步減少用戶與系統(tǒng)交互的需要?？刂茊卧?60可被設(shè)計(jì)為配合于系統(tǒng)100與用戶之間的層，以減少設(shè)置樣本測(cè)定以用于獲取所需的復(fù)雜性?？刂葡到y(tǒng)160還可經(jīng)配置以僅將最相關(guān)數(shù)據(jù)返回到用戶以避免用戶接收太多的額外信息。

在一個(gè)實(shí)施例中，系統(tǒng)100可進(jìn)一步包含可操作地耦合到樣本處置裝置115或與其集成的樣本檢測(cè)裝置(未圖示)。所述樣本檢測(cè)裝置可與樣本處置裝置115一起工作或獨(dú)立于樣本處置裝置115而執(zhí)行以下功能中的至少一者：i.識(shí)別進(jìn)入系統(tǒng)的樣本；ⅱ.識(shí)別用于進(jìn)入系統(tǒng)的樣本的測(cè)定類型；iii.基于預(yù)期測(cè)定類型和/或所關(guān)注的分析物而選擇測(cè)定協(xié)議；ⅳ.引導(dǎo)樣本處置裝置和/或控制系統(tǒng)以起始對(duì)樣本中所關(guān)注的分析物的分析；v.引導(dǎo)控制系統(tǒng)基于針對(duì)測(cè)定類型和/或所關(guān)注的分析物選定的測(cè)定協(xié)議而選擇一或多種反應(yīng)劑；vi.引導(dǎo)控制系統(tǒng)基于針對(duì)測(cè)定類型和/或所關(guān)注的分析物選定的測(cè)定協(xié)議而選擇液相層析移動(dòng)相條件，且致使液相層析系統(tǒng)執(zhí)行測(cè)定和/或純化所關(guān)注的分析物；vii.引導(dǎo)控制系統(tǒng)基于針對(duì)測(cè)定類型和/或所關(guān)注的分析物選定的測(cè)定協(xié)議而選擇質(zhì)譜儀設(shè)定，且致使質(zhì)譜儀產(chǎn)生與選定測(cè)定類型和/或所關(guān)注的分析物相關(guān)聯(lián)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)；以及viii.引導(dǎo)控制系統(tǒng)分析與選定測(cè)定類型和/或所關(guān)注的分析物相關(guān)聯(lián)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)以識(shí)別所關(guān)注的分析物的存在和/或濃度。

樣本或經(jīng)處理樣本可在質(zhì)譜法的分析之前經(jīng)凈化和或純化。此純化或樣本凈化可指代從粗細(xì)胞提取物移除鹽或脂質(zhì)的程序，或使所關(guān)注的一或多種分析物相對(duì)于樣本的一或多種其它組分變豐富的程序。其也可指代具有用于處置分枝桿菌或絲狀真菌的生物安全三級(jí)機(jī)構(gòu)的單獨(dú)實(shí)驗(yàn)室中的樣本處理和凈化。在此實(shí)施例中，樣本傳送到系統(tǒng)且可如先前所描述進(jìn)行分析。在一個(gè)實(shí)施例中，此純化或樣本凈化可通過固相萃取裝置、直列式尺寸排阻層析和/或任選的層析柱140實(shí)現(xiàn)。

在一個(gè)實(shí)施例中，第一和/或第二樣本純化裝置135可包含固相萃取(SPE)盒。在一些實(shí)施例中，SPE盒可直接與高分辨率/高質(zhì)量準(zhǔn)確性質(zhì)譜儀150成直列式。在一個(gè)實(shí)施例中，SPE盒可為具有具有小體積的二氧化硅或其它吸附劑的聚丙烯尖端，其含有固定于盒中的鍵合的C₄、C₈或C₁₈或其它官能團(tuán)，例如StageTip^TM盒(Thermo FisherScientific)。在替代實(shí)施例中，可使用聚合吸附劑或螯合劑。床體積可小達(dá)1μL或更小，但也可以使用較大體積。所述設(shè)備和方法良好地適合于從微生物細(xì)胞導(dǎo)出的復(fù)雜樣本，因?yàn)槊恳籗PE盒僅使用一次，從而使從一個(gè)樣本到另一樣本的殘留問題最小化。

在一個(gè)實(shí)施例中，樣本純化裝置135可為直列式尺寸排阻層析柱，其經(jīng)設(shè)計(jì)以從樣本110移除鹽、小分子和脂質(zhì)。所述方法還可用以分離媒介與大分子量蛋白質(zhì)。將相選擇為與部分(即，少于100％)有機(jī)溶液和有機(jī)酸相容。相可適應(yīng)分子量從10³到10⁸Da不同的蛋白質(zhì)尺寸分布。實(shí)時(shí)經(jīng)調(diào)流動(dòng)速率以實(shí)現(xiàn)完整蛋白質(zhì)從小分子的分離，其中分離流動(dòng)速率通常比用以從系統(tǒng)移除小分子、脂質(zhì)和鹽的較高流動(dòng)速率小得多。在此實(shí)施例中，樣本純化裝置135也可以經(jīng)加熱以促進(jìn)完整蛋白質(zhì)的較快擴(kuò)散速率，因此顯著縮短運(yùn)行時(shí)間。移動(dòng)相通過樣本純化裝置135的流動(dòng)也可以在凈化過程的一部分期間分流，以從流動(dòng)的流移除某些雜質(zhì)且防止其進(jìn)入質(zhì)譜儀150。

在一個(gè)實(shí)施例中，任選的層析柱140可包含經(jīng)配置以用于樣本中的蛋白質(zhì)的至少部分層析分離的柱。層析柱中的固定相可為多孔或非多孔的二氧化硅或瓊脂糖顆粒，或所述柱內(nèi)部聚合或另外形成的單塊材料。所述固定相可涂覆有適當(dāng)材料，例如C₁₈、C₈、C₄或另一合適的衍生物，或含有陽(yáng)離子交換劑或其它材料，或以上的組合以促進(jìn)蛋白質(zhì)的分離，且此材料可以化學(xué)方式鍵合到顆?；蛟谒鲋鶅?nèi)為單塊的。顆粒大小通常在1.5μm到30μm的范圍內(nèi)變化?？讖娇梢栽?0到300埃的范圍內(nèi)變化。柱的內(nèi)徑通常在50μm到2.1mm的范圍內(nèi)變化，且柱長(zhǎng)度在約0.5cm到25cm的范圍內(nèi)或以其它方式變化。移動(dòng)相或溶離劑可為純?nèi)軇┗蛘邇煞N或更多種溶劑的混合物，且可含有添加的鹽、酸和/或其它化學(xué)改質(zhì)劑。蛋白質(zhì)基于一或多個(gè)生理化學(xué)性質(zhì)在柱上分離，包含大小、凈電荷、疏水性、親和力或其它生理化學(xué)性質(zhì)。層析分離方法包含離子交換、尺寸排阻、HILIC、疏水性交互、親和力、正常相或反向相層析法中的一或多者。

純化樣本的額外方法可包含(不限于)液相層析、HPLC、UHPLC、沉淀、固相萃取、液-液提取、透析、親和力捕獲、電泳、過濾、超過濾或此項(xiàng)技術(shù)中已知用于純化的其它合適的方法。

已經(jīng)描述涉及在質(zhì)譜法分析之前使用HPLC用于樣本凈化的各種方法。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可選擇適合于在本發(fā)明中使用的HPLC儀器和柱。層析柱通常包含媒介(即，填充材料)以在空間和時(shí)間上促進(jìn)化學(xué)部分的分離。所述媒介可包含極小顆粒，其可具有與各種化學(xué)部分交互以促進(jìn)所關(guān)注的分析物的分離的鍵合表面。一個(gè)合適的鍵合表面是疏水性鍵合表面，例如烷基鍵合表面。烷基鍵合表面可包含C₄、C₈或C₁₈鍵合烷基。另外，也可以使用現(xiàn)有技術(shù)水平中已知的單塊和其它相。層析柱包含用于接收樣本的入口端口以及用于排放包含部分分離樣本的流出物的出口端口。舉例來(lái)說(shuō)，測(cè)試樣本可在入口端口處施加于柱，以溶劑或溶劑混合物溶離，且在出口端口處排放。在另一實(shí)例中，多于一個(gè)柱可循序地使用或作為二維(2D)層析法系統(tǒng)，其中測(cè)試樣本可在入口端口處施加于第一柱，以溶劑或溶劑混合物溶離到第二柱上，且以溶劑或溶劑混合物從所述第二柱溶離到出口端口?？蛇x擇不同溶劑模式用于溶離分析物。舉例來(lái)說(shuō)，可使用梯度模式、等度模式或多型(即混合)模式執(zhí)行液相層析。

圖2是可用作圖1的質(zhì)譜儀150的示范性質(zhì)譜儀150a的示意性繪圖。在圖2中說(shuō)明的質(zhì)譜儀是混合質(zhì)譜儀，包括多于一個(gè)類型的質(zhì)量分析器。具體地說(shuō)，質(zhì)譜儀150a包含離子阱質(zhì)量分析器216以及Orbitrap^TM分析器，其為一類靜電阱質(zhì)量分析器。如下文將描述，由于根據(jù)本發(fā)明教示的各種分析方法采用多次質(zhì)量分析數(shù)據(jù)采集，因此混合質(zhì)譜儀系統(tǒng)可有利地用以通過同時(shí)使用兩個(gè)或更多個(gè)分析器而改善工作循環(huán)。Orbitrap^TM質(zhì)量分析器212采用鏡像電荷檢測(cè)，其中通過借助離子阱內(nèi)的離子的運(yùn)動(dòng)檢測(cè)電極上引起的鏡像電流而間接檢測(cè)離子。

在質(zhì)譜儀150a的操作中，電噴射離子源201提供待分析的樣本的離子到撇渣器202的孔隙，在此處離子進(jìn)入第一真空腔室。在進(jìn)入之后，由堆疊環(huán)離子導(dǎo)向器204將離子捕獲且聚焦為密集束。第一離子光學(xué)傳送組件203a將束傳送到下游的質(zhì)譜儀的高真空區(qū)。大多數(shù)剩余的中性分子和不合意的高速度離子群集(例如溶合離子)通過彎曲束導(dǎo)向器206從離子束分離。中性分子和離子群集跟隨直線路徑，而所關(guān)注的離子由曳力場(chǎng)引起彎曲約九十度轉(zhuǎn)彎，從而產(chǎn)生分離。

質(zhì)譜儀150a的四極濾質(zhì)器208在其常規(guī)意義上用作可調(diào)諧的濾質(zhì)器以便僅在選定窄的m/z范圍內(nèi)使離子通過。后續(xù)離子光學(xué)傳送組件203b將經(jīng)過濾離子遞送到彎曲四極離子阱(“C阱”)組件210。C阱210能夠沿著四極濾質(zhì)器208與離子阱質(zhì)量分析器216之間的路徑傳送離子。C阱210也具有臨時(shí)收集且存儲(chǔ)離子群體并且然后將離子作為脈沖或包遞送到Orbitrap^TM質(zhì)量分析器212中的能力。離子包的傳送是通過在C阱210與安置于C阱210和Orbitrap^TM質(zhì)量分析器212之間的一組注入電極211之間施加電位差來(lái)控制。C阱的曲率經(jīng)設(shè)計(jì)以使得離子群體在空間上聚焦以便匹配Orbitrap^TM質(zhì)量分析器212的入口孔徑的接受角。

多極離子導(dǎo)向器214和光學(xué)傳送組件203b用來(lái)在C阱210與離子阱質(zhì)量分析器216之間導(dǎo)引離子。多極離子導(dǎo)向器214提供臨時(shí)離子存儲(chǔ)能力以使得在分析方法的第一處理步驟中產(chǎn)生的離子可稍后被取得以用于后續(xù)步驟中的處理。多極離子導(dǎo)向器214也可充當(dāng)分段單元。沿著C阱210與離子阱質(zhì)量分析器216之間的路徑的各種柵電極是可控的，以使得離子可在任一方向上傳送，這取決于任何特定分析方法中所需的離子處理步驟的序列。

離子阱質(zhì)量分析器216是雙壓力線性離子阱(即，二維阱)，其包括高壓線性阱單元217a和低壓線性阱單元217b，所述兩個(gè)單元定位成鄰近于彼此，通過具有小孔隙的板透鏡分隔開，所述小孔隙準(zhǔn)許所述兩個(gè)單元之間的離子傳送且呈現(xiàn)泵送限制并允許在所述兩個(gè)阱中維持不同的壓力。高壓?jiǎn)卧?17a的環(huán)境有利于離子冷卻、通過碰撞引起的解離或電子轉(zhuǎn)移解離的離子分段，或例如質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)等離子-離子反應(yīng)。低壓?jiǎn)卧?17b的環(huán)境有利于以高分辨力和質(zhì)量準(zhǔn)確性進(jìn)行分析掃描。低壓?jiǎn)卧p倍增極離子檢測(cè)器215。

質(zhì)量分析方法內(nèi)的電子轉(zhuǎn)移解離或質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的步驟的使用需要在質(zhì)譜儀內(nèi)引起受控離子-離子反應(yīng)的能力。離子-離子反應(yīng)又需要產(chǎn)生反應(yīng)劑離子以及致使反應(yīng)劑離子與樣本離子混合的能力。如圖2中所描繪的質(zhì)譜儀150a說(shuō)明兩個(gè)替代的反應(yīng)劑離子源，第一反應(yīng)劑離子源299a安置于堆疊環(huán)離子導(dǎo)向器204與彎曲束導(dǎo)向器206之間，且第二反應(yīng)劑離子源299b安置在儀器的相對(duì)端，鄰近于線性離子阱質(zhì)量分析器216的低壓?jiǎn)卧?17b。大體上，任何特定系統(tǒng)將至多僅包含一個(gè)反應(yīng)劑離子源。然而，此處為了說(shuō)明性目的而描繪且論述兩個(gè)不同反應(yīng)劑離子源。雖然以下論述是針對(duì)用于PTR的反應(yīng)劑離子源，但類似論述可應(yīng)用于ETD反應(yīng)劑離子源。

第一可能的反應(yīng)劑離子源299a可位于堆疊環(huán)離子導(dǎo)向器204與彎曲束導(dǎo)向器206之間。反應(yīng)劑離子源299a包括輝光放電單元，其包括暴露于反應(yīng)劑氣體導(dǎo)管298a的一對(duì)電極(陽(yáng)極和陰極)，所述反應(yīng)劑氣體導(dǎo)管從具有使反應(yīng)劑化合物揮發(fā)的加熱器的反應(yīng)劑液體(或固體)儲(chǔ)集器297a遞送反應(yīng)劑氣體。當(dāng)跨電極施加高電壓時(shí)，起始輝光放電，其使在電極之間流動(dòng)的反應(yīng)劑電離。來(lái)自輝光放電源的反應(yīng)劑陰離子被引入到在四極濾質(zhì)器208前方的離子光學(xué)元件路徑，在其內(nèi)它們可進(jìn)行m/z選擇。反應(yīng)劑離子接著可在多極離子導(dǎo)向器214中積聚，且隨后傳送到雙壓力線性離子阱216的高壓?jiǎn)卧?17b中，在其內(nèi)使得它們可用于PTR反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物可直接傳送到低壓力單元217a或Orbitrap^TM質(zhì)量分析器212用于m/z分析。

可能的替代反應(yīng)劑離子源299a可鄰近于低壓力線性阱單元217b定位，在此其可包括額外高真空腔室292，反應(yīng)劑離子可以從所述高真空腔室通過腔室292與高壓?jiǎn)卧g的孔隙而引導(dǎo)到高壓力單元217b中。在操作中，氣態(tài)反應(yīng)劑化合物從具有使反應(yīng)劑化合物揮發(fā)的加熱器的反應(yīng)劑液體(或固體)儲(chǔ)集器297b供應(yīng)，且被引導(dǎo)通過反應(yīng)劑氣體導(dǎo)管298b，所述反應(yīng)劑氣體導(dǎo)管將反應(yīng)劑氣體遞送到部分地被限制的離子產(chǎn)生體積296中。在操作中，從電加熱長(zhǎng)絲294供應(yīng)的熱離子電子通過在長(zhǎng)絲294與加速器電極(未圖示)之間施加電位而以某一預(yù)定能量引導(dǎo)到離子產(chǎn)生體積296中。供應(yīng)的高能電子造成反應(yīng)劑氣體的電離以便產(chǎn)生反應(yīng)劑離子。反應(yīng)劑離子接著可在柵電極(未圖示)的操作下由離子光學(xué)傳送組件203a導(dǎo)引到高壓?jiǎn)卧?17b中。

根據(jù)本發(fā)明教示的示范性方法在圖3A到3F中所示的流程圖中示意性地說(shuō)明。圖3A示意性地說(shuō)明用于監(jiān)視微生物樣本中的某些特定目標(biāo)分析物蛋白質(zhì)或肽的存在并任選地量化的第一種此類示范性方法，方法300。方法300的初始步驟302、304和306分別是微生物中斷(例如，裂解)和提取、固相凈化或尺寸排阻層析以及層析分離的步驟，如上文所描述。在一些實(shí)驗(yàn)情形中，可在后續(xù)樣本引入步驟308中將所提取樣本直接灌注到質(zhì)譜儀中，因此，步驟304和306由虛線展示為任選的。也可以使用離線方法制備樣本，包含透析或現(xiàn)有技術(shù)水平中已知的其它技術(shù)。然而，在許多其它實(shí)驗(yàn)情形中，步驟304和306是有用的以便在質(zhì)譜分析之前至少部分地純化樣本。

當(dāng)必須根據(jù)時(shí)間約束完成分析時(shí)，如一些臨床應(yīng)用中，分析所需的時(shí)間可通過采用SPE步驟304(如發(fā)明人Enke的U.S.5,175,430中所描述的時(shí)間壓縮層析法步驟)或如國(guó)際(PCT)專利申請(qǐng)公開案WO 2013/166169 A1中所描述的層析法步驟306中的“快速部分層析分離”(FPCS)的方法而縮短。大體上，在執(zhí)行FPCS中，含有各種有機(jī)和無(wú)機(jī)分析物的復(fù)雜混合物的微生物細(xì)胞的粗提取物(小有機(jī)分子、蛋白質(zhì)及其天然產(chǎn)生片段、脂質(zhì)、核酸、多糖、脂蛋白等)加載于層析柱上且經(jīng)受層析法。然而，并非允許梯度來(lái)單獨(dú)地溶離每一分析物(理想地，每層析峰一種分析物)，而是有意加速所述梯度以使得在例如近似八分鐘或更短時(shí)間內(nèi)、且優(yōu)選地五分鐘或更短時(shí)間內(nèi)大體上不獲得層析峰，而不是獲得基線分離原本將需要的長(zhǎng)得多的運(yùn)行時(shí)間。在FPCS分離中，許多分析物是根據(jù)其性質(zhì)以及使用的層析法的類型(反相、HILIC等)而在任何給定時(shí)間從柱有意地共溶離。部分或不完全分離也可通過所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其它方法實(shí)現(xiàn)，包含但不限于減少化合物在柱上的保持的移動(dòng)相溶劑和/或改質(zhì)劑的使用，減少化合物在柱上的保持的固定相媒介的選擇(包含粒度、微孔尺寸等)，層析系統(tǒng)以較高流動(dòng)速率的操作，層析系統(tǒng)以高溫的操作，或不同層析分離模式(即，反相、尺寸排阻等)的選擇。FPCS技術(shù)產(chǎn)生很少或可能不產(chǎn)生跨越整個(gè)梯度的解析層析峰。因此，從層析圖導(dǎo)出的大體上僅相關(guān)信息是從柱的溶離時(shí)間。記錄的每一質(zhì)譜表示共溶離分析物的“子集”，其隨后經(jīng)電離、在質(zhì)量分析器中分離且被檢測(cè)。

在步驟308(圖3A)中，將樣本引入到質(zhì)譜儀中。所述樣本可提供為從SPE盒、層析法設(shè)備或替代地通過溶離液溶液的直接輸注而出現(xiàn)的溶離液材料。在提供到質(zhì)譜儀后，通過質(zhì)譜儀的電噴射電離源將樣本化合物電離(步驟308)。這些電噴射產(chǎn)生的離子在本文稱為“第一代”離子。在此時(shí)，可任選地執(zhí)行完整或分段MS¹掃描(步驟309)以便識(shí)別m/z空間中的富蛋白質(zhì)區(qū)。(應(yīng)注意在本文檔中，可采用術(shù)語(yǔ)“掃描”來(lái)當(dāng)用作名詞時(shí)一般指代質(zhì)譜，或替代地當(dāng)用作動(dòng)詞時(shí)指代質(zhì)譜的獲取)。在優(yōu)選實(shí)施例中，可在質(zhì)譜儀儀器的完整質(zhì)量范圍上獲得MS¹掃描以便能夠隨后以數(shù)據(jù)相依或獨(dú)立方式選擇譜的富信息部分以用于隔離(步驟310)。然而，在目標(biāo)分析的情況下，MS¹掃描可能是不必要的，且方法300的執(zhí)行可直接繼續(xù)到步驟310，其中隨后隔離離子的子集以用于進(jìn)一步反應(yīng)和分析。當(dāng)采用目標(biāo)分析時(shí)，在步驟310中執(zhí)行的隔離可以使得某一預(yù)定m/z范圍或可能多個(gè)預(yù)定m/z范圍內(nèi)的離子被保持以用于后續(xù)反應(yīng)和分析，而一或多個(gè)預(yù)定m/z范圍外的離子被丟棄。預(yù)定m/z范圍經(jīng)選擇以便對(duì)應(yīng)于目標(biāo)分析物蛋白質(zhì)或肽的優(yōu)選地已知m/z比，在方法的執(zhí)行中檢測(cè)或監(jiān)視所述目標(biāo)分析物蛋白質(zhì)或肽的存在或數(shù)量。

大體上，可以已知方式通過將來(lái)自離子源的離子引入到離子阱(例如三維離子阱、彎曲離子阱(有時(shí)稱為“C阱”)、單片段線性離子阱、多分段線性離子阱、多極離子導(dǎo)向器或四極濾質(zhì)器)中，并且然后通過跨離子阱的電極對(duì)施加補(bǔ)充AC電壓或施加適當(dāng)RF/DC電壓比以隔離所關(guān)注的離子群體而共振地噴出m/z比在所希望范圍之外的離子，來(lái)執(zhí)行步驟310的隔離。在一些實(shí)施例中，補(bǔ)充電壓的頻率可掃過各種頻率以使得離子根據(jù)其m/z比按順序噴出。在此些情況下，可在離子噴出時(shí)檢測(cè)離子以便產(chǎn)生離子的原始集合的質(zhì)譜。然而，由于在此階段可能不需要質(zhì)譜，因此可替代地施加補(bǔ)充AC電壓作為疊加頻率的組合，其經(jīng)選擇以便造成m/z比在所希望范圍之外的離子的基本上同時(shí)排出。在一些實(shí)施例中，疊加頻率的組合可具備遺失頻率的多個(gè)片段(即，“缺口”)以使得包括兩個(gè)或更多個(gè)非鄰接m/z比范圍的離子在阱內(nèi)同時(shí)隔離。非鄰接m/z比范圍中的每一個(gè)可對(duì)應(yīng)于相應(yīng)唯一目標(biāo)分析物蛋白質(zhì)或肽的優(yōu)選地已知m/z比。四極濾質(zhì)器的施加RF/DC電壓比率也可用以隔離所關(guān)注的經(jīng)界定或目標(biāo)質(zhì)量范圍。第一代離子的特定m/z范圍是通過單個(gè)或一系列固定RF/DC電壓比率而選擇以便選擇適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量隔離窗口。在此情況下采用的起作用的配置可為混合質(zhì)譜儀儀器，其包括四極、C阱、Orbitrap^TM質(zhì)量分析器以及高能量碰撞池(HCD)，其中隔離的離子群體可存儲(chǔ)在C阱或HCD池中用于PTR實(shí)驗(yàn)。第一代離子的隔離群體在本文稱為“前驅(qū)體”離子，因?yàn)檫@些離子將經(jīng)受后續(xù)離子-離子反應(yīng)或分段。

在優(yōu)選實(shí)施例中，前驅(qū)體離子群體的隔離可在分段線性離子阱的第一片段中執(zhí)行。在所需離子群體的隔離之后，多電荷蛋白質(zhì)離子群體可有利地移動(dòng)到線性離子阱的另一片段。這些步驟可在PTR過程之前針對(duì)前驅(qū)體離子的隔離的經(jīng)界定范圍重復(fù)多次。

接著，使用具有化學(xué)電離的基于錸的長(zhǎng)絲或輝光放電電離源從合適的基于高電子親和性的氣態(tài)反應(yīng)劑產(chǎn)生陰離子。可使用氮?dú)?、甲烷、異丁烷或現(xiàn)有技術(shù)水平中的其它已知?dú)怏w執(zhí)行化學(xué)電離。陰離子反應(yīng)劑可為在室溫下的氣體，或可為具有足夠蒸氣壓力以產(chǎn)生過量陰離子的液體，所述過量陰離子將在偽一級(jí)反應(yīng)條件下驅(qū)動(dòng)PTR過程。陰離子隨后從源區(qū)傳送到分段線性阱，借此使用如上文所描述的補(bǔ)充AC電壓使特定陰離子反應(yīng)劑質(zhì)量隔離。陰離子源可與電噴射源成直列式或安裝在分段線性離子阱的相對(duì)端上。替代地，四極濾質(zhì)器也可執(zhí)行陰離子隔離，其中后續(xù)PTR過程在儀器的C阱或HCD池中發(fā)生。

在方法300(圖3A)的步驟312中，在步驟310中經(jīng)質(zhì)量隔離的離子(即，“前驅(qū)體”離子)經(jīng)受質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，其中反應(yīng)劑陰離子物質(zhì)在指定時(shí)間周期中與離子阱中的樣本前驅(qū)體離子反應(yīng)以便從前驅(qū)體陽(yáng)離子提取質(zhì)子。在一個(gè)實(shí)施例中，通過調(diào)整分段線性離子阱的DC電壓偏移以便存儲(chǔ)多電荷正離子與單電荷陰離子以促進(jìn)PTR過程，而使多電荷前驅(qū)體離子群體與單電荷陰離子群體反應(yīng)。反應(yīng)劑陰離子經(jīng)選擇以使得在此實(shí)例中反應(yīng)劑陰離子表現(xiàn)為堿，且使得前驅(qū)體離子表現(xiàn)為一或多種酸。反應(yīng)劑陰離子是通過具有足夠蒸氣壓力的合適的反應(yīng)劑氣體/液體的單獨(dú)電離而形成，其包含(但不限于)六氟化硫、全氟-1,3-二甲基環(huán)己烷、全氟萘烷以及全氟菲烷。在允許反應(yīng)繼續(xù)指定時(shí)間之后，跨越離子阱的電極施加補(bǔ)充AC電壓以便排出反應(yīng)劑陰離子，從而在離子阱內(nèi)留下產(chǎn)物離子并且可能留下一些殘余前驅(qū)體離子。

在相反極性實(shí)驗(yàn)中，從蛋白質(zhì)或其它生物分子導(dǎo)出的多電荷陰離子也可與單電荷陽(yáng)離子反應(yīng)?？刹捎枚喾N源來(lái)產(chǎn)生單電荷陽(yáng)離子，包含電子、化學(xué)和電噴射電離過程。這些反應(yīng)遵循先前描述的相同反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。典型反應(yīng)劑陽(yáng)離子包含吡啶、苯并(f)喹諾酮以及惰性氣體氬和氙。另外，相反極性的多電荷蛋白質(zhì)也已反應(yīng)，以及來(lái)自核酸的多電荷陰離子與蛋白質(zhì)的多電荷陽(yáng)離子也已反應(yīng)。

在方法300(圖3A)的步驟314中，從在所關(guān)注的m/z比的完整范圍中保持于離子阱中的來(lái)自PTR過程的產(chǎn)物離子獲得質(zhì)譜?？捎靡阎绞酵ㄟ^按其m/z比次序檢測(cè)從3D或線性離子阱循序地噴出的離子而獲得質(zhì)譜。替代地，可將離子引導(dǎo)到質(zhì)譜儀的不同質(zhì)量分析器，例如飛行時(shí)間(TOF)質(zhì)量分析器或Orbitrap^TM型靜電阱質(zhì)量分析器，以用較大準(zhǔn)確性或質(zhì)量分辨率進(jìn)行分析，隨后通過離子阱的順序掃描而可用。此外，通過將產(chǎn)物離子引導(dǎo)到單獨(dú)分析器，在正執(zhí)行質(zhì)量分析時(shí)可以對(duì)離子阱重新填充前驅(qū)體離子的新樣本。如果準(zhǔn)確質(zhì)量分析器是檢測(cè)由離子阱內(nèi)的循環(huán)離子運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的鏡像電流的類型，例如FT-ICR質(zhì)量分析器或Orbitrap^TM質(zhì)量分析器，那么PTR反應(yīng)步驟可有利地減少目標(biāo)蛋白質(zhì)或多肽分子的碰撞橫截面，以使得這些分子在阱中保持穩(wěn)定足夠的時(shí)間長(zhǎng)度以產(chǎn)生高質(zhì)量質(zhì)譜。并且，PTR產(chǎn)物離子當(dāng)在其傳送到Orbitrap^TM質(zhì)量分析器后離開高壓力C阱區(qū)時(shí)將具有較少動(dòng)能。由于PTR過程，所得產(chǎn)物離子群體將完全去溶劑化，這將改善所得質(zhì)譜的質(zhì)量。

在方法300的步驟316中，自動(dòng)檢查由在步驟314中執(zhí)行的質(zhì)量分析產(chǎn)生的質(zhì)譜，以便辨識(shí)一或多個(gè)個(gè)別系列的相關(guān)m/z比，其中一系列的每一m/z比表示單個(gè)完整蛋白質(zhì)或多肽分子的相應(yīng)不同電荷態(tài)，即不同質(zhì)子化程度。舉例來(lái)說(shuō)，參見圖9C，其描繪兩個(gè)不同系列的行，分別由包絡(luò)905和包絡(luò)906表示。在電離之后以及在PTR反應(yīng)之后，具有質(zhì)量m_p的每一蛋白質(zhì)或多肽分子M表示為至少一種(且可能若干不同)蛋白質(zhì)或多肽陽(yáng)離子物質(zhì)。由特定分子M形成的相關(guān)系列的每一此類陽(yáng)離子物質(zhì)可由化學(xué)式(M+zH)^z+表示，其中整數(shù)z是加合到原始分子的質(zhì)子的數(shù)目或是在PTR步驟之后在蛋白質(zhì)上剩余的質(zhì)子的數(shù)目。在此實(shí)例中，僅考慮單同位素離子，質(zhì)荷比(m/z)_ion因此如下給出：

(m/z)_ion≈(m_p+z×1.007)/z≈(m_p+z)/z≈m_p/z(等式1)

其中最終近似是得自m_p>>z的事實(shí)。因此，僅表示質(zhì)子化的不同狀態(tài)的此系列的離子物質(zhì)可通過實(shí)時(shí)使用自動(dòng)軟件以確定單同位素離子而容易辨識(shí)。一旦已經(jīng)辨識(shí)出此系列，便可實(shí)時(shí)辨別母代蛋白質(zhì)或多肽分子的分子質(zhì)量m_p。也可以使用平均或單同位素質(zhì)量將類似方法應(yīng)用于較大分子量的分子。

由PTR過程產(chǎn)生的m/z值或替代地從PTR產(chǎn)物離子獲得的分子量可隨后對(duì)照含有個(gè)別病原體標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，所述標(biāo)準(zhǔn)含有來(lái)自已知參考標(biāo)準(zhǔn)/患者樣本的觀測(cè)m/z值或分子量。通過匹配來(lái)自含有個(gè)別參考病原體的數(shù)據(jù)庫(kù)的這些m/z值或分子量，獲得可能的病原體識(shí)別的小子集。可通過確定特定質(zhì)量準(zhǔn)確性、將個(gè)別峰的強(qiáng)度加權(quán)和/或通過在給定評(píng)分系統(tǒng)中按質(zhì)量計(jì)將分子量值加權(quán)來(lái)限制所述子集。圖3A的步驟402中說(shuō)明此情況。在某些情況下，m/z或分子量匹配可提供與特定病原體識(shí)別的直接匹配。然而，在所有概率中，m/z分子量信息將大體上減少可使用串連質(zhì)譜法明確地識(shí)別的可能病原體識(shí)別的數(shù)目。在國(guó)際(PCT)專利申請(qǐng)公開案WO 2013/166169 A1中最初描述此過程以與步驟302、304、306和308-310結(jié)合使用。另外，可采用貝葉斯、邏輯回歸或基于決策樹的方法以進(jìn)一步精煉病原體的識(shí)別。在優(yōu)選實(shí)施例中，在數(shù)據(jù)獲取期間(即，在正分析樣本時(shí))實(shí)時(shí)執(zhí)行此m/z或分子量搜索。替代地，也可在獲取后(即，在已分析樣本)之后執(zhí)行搜索。蛋白質(zhì)的少量m/z值或分子量(3到10個(gè))與參考數(shù)據(jù)庫(kù)的比較將一般足以顯著減少病原體識(shí)別的候選數(shù)目為五個(gè)或更少。圖3A的步驟404說(shuō)明此情況。

圖3B示意性地說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明教示的第二示范性方法方法370的流程圖。方法370(圖3B)的步驟302-314相同于方法300(圖3A)的類似編號(hào)的步驟，且因此此處不重復(fù)這些步驟的描述。方法370不同于方法300之處僅關(guān)于在步驟314中產(chǎn)生質(zhì)譜之后的步驟。根據(jù)早先描述的方法300，PTR產(chǎn)物離子的此質(zhì)譜假定足以檢測(cè)或定量所關(guān)注的蛋白質(zhì)和多肽。然而，在許多情況下，可能在PTR反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)生之后必須執(zhí)行串連質(zhì)譜法(有時(shí)稱為MS/MS或MSⁿ)以便解析特定蛋白質(zhì)或多肽分子的辨識(shí)中的剩余不明確性。在此些情形中，PTR反應(yīng)產(chǎn)物可視為包括第一代反應(yīng)產(chǎn)物，其隨后分段以形成第二代產(chǎn)物離子。第一代反應(yīng)產(chǎn)物的特定m/z比與片段離子的一或多個(gè)特定m/z比的組合在許多情況下可允許與給定病原體相關(guān)聯(lián)的特定蛋白質(zhì)或多肽分子的識(shí)別。在許多情況下，以特定病原體識(shí)別的蛋白質(zhì)也可以在其它類似病原體中找到。為了正確地識(shí)別單個(gè)病原體，可能需要對(duì)以給定PTR分?jǐn)?shù)或同一樣本的多個(gè)PTR分?jǐn)?shù)存在的一樣多的蛋白質(zhì)執(zhí)行方法370(具體地說(shuō)串連質(zhì)譜法)。

因此，方法370(圖3B)的步驟318-322表示應(yīng)用于由PTR形成的離子的串連質(zhì)譜法或選定反應(yīng)監(jiān)視(SRM)的技術(shù)的應(yīng)用。如果特定采用的質(zhì)譜法系統(tǒng)準(zhǔn)許，那么PTR產(chǎn)物離子的一部分可能已經(jīng)存儲(chǔ)(緊接在步驟312之后)在質(zhì)譜儀系統(tǒng)的離子存儲(chǔ)設(shè)備中。在此些情況下，分支步驟315致使步驟317a的執(zhí)行，其中檢索先前存儲(chǔ)的離子用于進(jìn)一步處理。否則，如果質(zhì)量分析步驟(步驟314)耗盡PTR產(chǎn)物離子的先前批次，那么根據(jù)替代的步驟317b，可能需要重新執(zhí)行步驟308-312以便產(chǎn)生此些PTR產(chǎn)物離子的新批次。

在方法370的步驟318中，一特定m/z范圍或多個(gè)特定m/z范圍內(nèi)的某些PTR反應(yīng)產(chǎn)物離子(即，第一代產(chǎn)物離子)通過噴出m/z比不在所關(guān)注的一或多個(gè)范圍內(nèi)的離子而被質(zhì)量隔離。在步驟320中隨后將隔離的離子分段。特定所選的一或多個(gè)范圍將一般響應(yīng)于在步驟316的執(zhí)行之前立即識(shí)別的特定經(jīng)識(shí)別電荷態(tài)序列的細(xì)節(jié)，且所述選擇將一般由計(jì)算機(jī)自動(dòng)做出。因此，用于隔離和分段的一或多個(gè)特定m/z范圍的選擇是所謂的“數(shù)據(jù)相依分析”(或“數(shù)據(jù)相依獲取”等)的實(shí)例。

在涉及幾百到幾千道爾頓的低質(zhì)量分子的大多數(shù)常規(guī)MS/MS分析中，數(shù)據(jù)相依分段包括基于先前MS¹數(shù)據(jù)獲取的信息挑選“最高P數(shù)目的最充足的前驅(qū)體”用于串連質(zhì)量分析，其中數(shù)目P是常數(shù)或可能是由用戶輸入的變量。已發(fā)現(xiàn)此常規(guī)形式的數(shù)據(jù)相依分析當(dāng)在生物聚合物分析物的多組分樣本的分析中使用時(shí)表現(xiàn)并不良好。舉例來(lái)說(shuō)，圖7C說(shuō)明分別由包絡(luò)905和包絡(luò)906表示的兩個(gè)電荷態(tài)分布。在此實(shí)例中，每一包絡(luò)對(duì)應(yīng)于不同的相應(yīng)分析物分子物質(zhì)。因此，由包絡(luò)905和906包含的行的集合可被稱為“分子物質(zhì)相關(guān)電荷態(tài)分布”?？紤]圖7C中的行(個(gè)別m/z值)表示前驅(qū)體離子，則如果P＝10，那么常規(guī)數(shù)據(jù)相依分段技術(shù)將選擇包絡(luò)906下方的十個(gè)最左邊實(shí)心垂直線用于分段。使用常規(guī)技術(shù)，將不選擇對(duì)應(yīng)于包絡(luò)905的點(diǎn)線。常規(guī)程序因此將產(chǎn)生與對(duì)應(yīng)于包絡(luò)906的分子物質(zhì)相關(guān)的冗余信息且不產(chǎn)生與對(duì)應(yīng)于包絡(luò)905的分子物質(zhì)相關(guān)的信息。

為了克服當(dāng)應(yīng)用于高分子量分子時(shí)常規(guī)數(shù)據(jù)相依分段的缺點(diǎn)，本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)本文使用的新穎“最高P個(gè)唯一分析物特定群集”數(shù)據(jù)相依技術(shù)以便替換先前的“最高P數(shù)目的最充足的前驅(qū)體”邏輯以應(yīng)用于高分子量分子。每一分子物質(zhì)相關(guān)電荷態(tài)分布是根據(jù)新穎“最高P個(gè)唯一分析物特定群集”邏輯解譯為全部從單個(gè)唯一分子產(chǎn)生的相關(guān)質(zhì)譜線(m/z值)的集合。每一分子物質(zhì)相關(guān)電荷態(tài)分布將被指示為在電離之前已經(jīng)從單個(gè)分子產(chǎn)生的各種電荷態(tài)和同位素群集分組在一起。然而，分子物質(zhì)相關(guān)分布排除了在數(shù)據(jù)分析之前移除的加成物。根據(jù)所述新穎方法，僅對(duì)給定分子物質(zhì)相關(guān)電荷態(tài)分布包絡(luò)的一個(gè)(或可能更多)選定代表執(zhí)行分段，從而避免上文與常規(guī)數(shù)據(jù)相依分段方法相關(guān)聯(lián)所述的冗余。根據(jù)新穎“最高P個(gè)唯一分析物特定群集”邏輯，在已針對(duì)第一分子物質(zhì)相關(guān)電荷態(tài)分布選擇代表性m/z比(或多個(gè)比率)之后，任何進(jìn)一步分段是針對(duì)下一所確定的分子物質(zhì)相關(guān)電荷態(tài)分布的代表性m/z比，以此類推。

如先前描述，在方法370的步驟318中執(zhí)行的隔離可通過以下方式實(shí)現(xiàn)：跨離子阱的電極對(duì)施加補(bǔ)充AC電壓以使得m/z比不在所關(guān)注的一或多個(gè)范圍內(nèi)的離子從阱噴出，而m/z比在所述一或多個(gè)范圍內(nèi)的那些離子保持在阱內(nèi)。在一些情況下，用于質(zhì)量隔離的離子阱可相同于在步驟314中用以進(jìn)行全掃描質(zhì)量分析的質(zhì)量分析器。

施加于用于質(zhì)量隔離的離子阱的補(bǔ)充AC電壓可包括疊加頻率的求和以使得兩個(gè)或更多個(gè)非鄰接m/z范圍內(nèi)的離子被同時(shí)隔離。在后續(xù)步驟320中，經(jīng)質(zhì)量隔離的第一代產(chǎn)物離子通過例如碰撞誘導(dǎo)解離(CID)等合適的離子分段技術(shù)分段。所述分段可通過用已知方式將第一代產(chǎn)物離子(由原始前驅(qū)體離子的PTR形成的產(chǎn)物離子)傳送到專用分段單元而實(shí)現(xiàn)，所述傳送的離子在所述分段單元內(nèi)分段以便產(chǎn)生片段離子，這些片段離子包括第二代反應(yīng)產(chǎn)物。任選地，在任選的步驟321中可存儲(chǔ)片段產(chǎn)物離子的一部分以用于可能的未來(lái)額外分段。

在方法370(圖3B)的步驟322中，由質(zhì)譜儀的質(zhì)量分析器對(duì)步驟320中產(chǎn)生的片段進(jìn)行質(zhì)量分析。如果第二代產(chǎn)物離子是在具體來(lái)說(shuō)專用于分段目的的分段單元內(nèi)產(chǎn)生，那么在步驟322的執(zhí)行之前所述離子必須首先傳送到質(zhì)量分析器。在步驟322中可采用離子阱質(zhì)量分析器以分析第二代產(chǎn)物離子，在此情況下用于步驟322的質(zhì)量分析器可相同于步驟314的用于進(jìn)行全掃描質(zhì)量分析的質(zhì)量分析器。替代地，可采用能夠以10ppm或更好的準(zhǔn)確性測(cè)量質(zhì)荷比的準(zhǔn)確質(zhì)量分析器用于步驟322，例如FT-ICR質(zhì)量分析器、飛行時(shí)間(TOF)質(zhì)量分析器或Orbitrap^TM型靜電阱質(zhì)量分析器。

如所已知，經(jīng)受分段的某一選定離子物質(zhì)的m/z值與由分段產(chǎn)生的一或多個(gè)片段離子物質(zhì)的m/z值(或多個(gè)值)之間的相關(guān)可足以自動(dòng)確定(在步驟402b中)選定離子物質(zhì)的化學(xué)身份。在此情況下，選定離子物質(zhì)是在步驟318中經(jīng)質(zhì)量隔離的在步驟312中產(chǎn)生的PTR反應(yīng)產(chǎn)物物質(zhì)。少量(即，3到10種)此類蛋白質(zhì)的識(shí)別將一般足以唯一地識(shí)別微生物物質(zhì)(任選的步驟404b)。然而，單個(gè)階段的分段可能不足以用于執(zhí)行化學(xué)物質(zhì)識(shí)別。在此類情況下，第二代產(chǎn)物離子可進(jìn)一步分段以便形成下一代產(chǎn)物離子，由從步驟322返回至步驟318的任選的重復(fù)(以虛線指示)指示，其中片段產(chǎn)物離子的選定子集根據(jù)其m/z值而被隔離，且如此隔離的片段離子被進(jìn)一步分段。更一般化地，可選擇n^th代產(chǎn)物離子的子集用于通過任何合適的離子分段方法而進(jìn)一步分段，例如(但不限于)碰撞引起的分段、較高能量碰撞解離、電子轉(zhuǎn)移解離、電子捕獲解離、負(fù)電子轉(zhuǎn)移解離、電子分離解離、源中分段、表面引起的解離或光致解離，從而形成(n+1)^th代產(chǎn)物離子。質(zhì)量分析步驟322的結(jié)果可形成關(guān)于是否需要每一額外分段以及如果需要?jiǎng)t哪些m/z值對(duì)應(yīng)于待分段的離子物質(zhì)的自動(dòng)決策的基礎(chǔ)。

上文所論述的圖3A中描繪的方法300提供了樣本分析的相對(duì)簡(jiǎn)單且直接的方法，其可適用于相對(duì)低復(fù)雜性的樣本，例如當(dāng)在將層析部分引入到質(zhì)譜儀中(步驟308)之前已執(zhí)行高度解析層析分離(步驟306)時(shí)。然而，簡(jiǎn)單方法300可能不適合于更復(fù)雜的樣本，且此些樣本的分析可能存在一些挑戰(zhàn)。首先，復(fù)雜混合物中存在的蛋白質(zhì)具有廣泛范圍的分子量。第二，由大量離胺酸、精胺酸、組胺酸殘余的存在引起的大量電荷態(tài)可導(dǎo)致多個(gè)重疊的峰集合，每一峰集合對(duì)應(yīng)于不同化學(xué)物質(zhì)。第三，如果質(zhì)量分析(步驟314)具有充分高分辨率，那么任何給定電荷態(tài)的同位素分布的解析峰的存在會(huì)混淆大多數(shù)數(shù)據(jù)處理算法。最后，多個(gè)電荷態(tài)當(dāng)中以及可能多個(gè)同位素狀態(tài)當(dāng)中可用離子的分布必定減少質(zhì)量分析中的任何解析峰的信號(hào)強(qiáng)度。

為了解決復(fù)雜樣本的分析中的上述挑戰(zhàn)，在圖3C中說(shuō)明其示意性流程圖的方法380提供了進(jìn)行多個(gè)PTR階段的機(jī)會(huì)。在早先描述的方法300下，假定第一代PTR反應(yīng)產(chǎn)物(步驟312中產(chǎn)生)的(在步驟314中)獲得的質(zhì)譜展現(xiàn)信噪比的足夠改進(jìn)以及同量異位干擾的足夠減少，以使得可辨識(shí)電荷態(tài)順序且可識(shí)別蛋白質(zhì)或多肽。如果質(zhì)譜質(zhì)量中的此改進(jìn)在第一PTR反應(yīng)事件之后仍不足以用于此目的，那么可執(zhí)行方法380(圖3C)的額外精煉步驟327-330。此外，PTR階段中的一或多者可利用“離子停車”的已知技術(shù)以便簡(jiǎn)化電荷態(tài)分布，如先前段落中所提到。離子停車是禁止離子阱內(nèi)的特定選定離子/離子反應(yīng)的技術(shù)。實(shí)際上，跨離子阱的電極對(duì)、離子導(dǎo)向器或其它離子存儲(chǔ)裝置施加諧振激發(fā)波形，其振幅不足以造成離子排出但足以增加具有選定m/z值的離子的速度。此激發(fā)過程增加了激發(fā)離子(陽(yáng)離子，出于本論述的目的)與反應(yīng)劑陰離子之間的相對(duì)速度，且據(jù)信此相對(duì)速度增加造成激發(fā)陽(yáng)離子與反應(yīng)劑陰離子之間的反應(yīng)速率的減少。

在PTR過程期間，陽(yáng)離子與反應(yīng)劑陰離子之間的反應(yīng)速率隨著各種陽(yáng)離子的電荷數(shù)的平方而變化，其中反應(yīng)劑離子上的陰離子電荷等于-1。因此，無(wú)離子停車存在下，PTR過程導(dǎo)致高度帶電陽(yáng)離子的數(shù)目的快速減少。在反應(yīng)的過程中，從單個(gè)分子物質(zhì)M(具有質(zhì)量m_p的蛋白質(zhì)或多肽分子)導(dǎo)出的陽(yáng)離子的電荷態(tài)的分布朝向較低電荷態(tài)移位。具有中間電荷態(tài)的每一離子物質(zhì)的群體將首先隨著較高帶電前驅(qū)體離子失去質(zhì)子而增加，并且然后隨著每一相應(yīng)物質(zhì)丟失更多質(zhì)子而減小，隨后其從較高帶電陽(yáng)離子的遞減數(shù)量得益。如果允許PTR反應(yīng)前進(jìn)到完成，那么最終結(jié)果是所有此些陽(yáng)離子的完全中和以及所有質(zhì)譜信號(hào)的全損耗。

當(dāng)在PTR反應(yīng)期間應(yīng)用離子停車技術(shù)時(shí)，則電荷減少過程基本上停止在電荷態(tài)z₁，其對(duì)應(yīng)于由施加的AC波形諧振激發(fā)的離子的特定質(zhì)荷比(例如，m_p/z₁)。從具有初始電荷態(tài)z以使得z>z₁的分子物質(zhì)M導(dǎo)出的那些前驅(qū)體陽(yáng)離子將失去質(zhì)子，直到其電荷態(tài)減少到z₁，在此之后將禁止進(jìn)一步反應(yīng)和質(zhì)子損失。從具有初始電荷狀態(tài)z以使得z<z₁的分子物質(zhì)M導(dǎo)出的那些前驅(qū)體陽(yáng)離子將被完全中和。因此，在具有離子停車的PTR反應(yīng)之后，在質(zhì)譜中將通過具有電荷態(tài)z₁的單個(gè)離子物質(zhì)表示分子M的原始質(zhì)子化分子離子(即，前驅(qū)體離子)的顯著部分。分子物質(zhì)M的此“集中”到單個(gè)電荷態(tài)中可有利地放大與所述物質(zhì)相關(guān)聯(lián)的質(zhì)譜信號(hào)，從而改善信噪比且降低檢測(cè)下限以及任選地降低物質(zhì)的定量下限。此外，從分子物質(zhì)M產(chǎn)生的離子的許多同位素變體將具有對(duì)應(yīng)于所施加AC諧振激發(fā)波形的值范圍之外的m/z值。此些同位素變體將被中和以便不干擾所關(guān)注的離子的質(zhì)譜識(shí)別。其它同位素變體包括在對(duì)應(yīng)于所施加AC諧振激發(fā)波形的值范圍內(nèi)的m/z值。此些同位素變體離子的同位素分布圖案將相對(duì)于原始前驅(qū)體離子中觀測(cè)到的同位素分布極大地簡(jiǎn)化，因?yàn)樗鼈儗⒋蟛糠稚婕皬姆肿覯產(chǎn)生的離子的單個(gè)電荷態(tài)z₁。

返回到圖3C中概括的方法380的論述，應(yīng)注意方法380的步驟302-310相同于方法300(圖3A)的類似編號(hào)的步驟且此處不再描述。隨后，在步驟328中，前驅(qū)體離子經(jīng)受PTR，任選地由離子停車技術(shù)改質(zhì)。如前文所述，通過跨離子阱的一對(duì)電極施加補(bǔ)充AC激發(fā)波形而執(zhí)行步驟328，樣本導(dǎo)出的陽(yáng)離子在所述離子阱內(nèi)與反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)達(dá)預(yù)定時(shí)間段。如上文所描述，此“離子停車”程序的采用將使從任何特定蛋白質(zhì)或多肽導(dǎo)出的離子的分布集中于m/z值的特定受限范圍中。這將一般將從任何特定蛋白質(zhì)或多肽導(dǎo)出的離子限制到特定電荷態(tài)中，從而簡(jiǎn)化所得質(zhì)譜且增加對(duì)應(yīng)于特定蛋白質(zhì)或多肽的任何質(zhì)譜峰的強(qiáng)度。離子受限于其中的m/z值的特定范圍可包括從不同相應(yīng)分子物質(zhì)導(dǎo)出的不同相應(yīng)電荷態(tài)的離子。在一些實(shí)施例中，用以實(shí)現(xiàn)離子停車的所施加AC波形可包括不同相應(yīng)頻率的波形的求和，以使得所求和波形致使PTR反應(yīng)產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于兩個(gè)或更多個(gè)非鄰接m/z范圍的PTR產(chǎn)物離子的最終群體。

在后續(xù)步驟330中，對(duì)在步驟328中產(chǎn)生的PTR產(chǎn)物離子的群體進(jìn)行質(zhì)量分析。在此質(zhì)量分析之前，可存儲(chǔ)PTR產(chǎn)物離子的一部分(步驟329)以準(zhǔn)備用于可能的后續(xù)PTR反應(yīng)。取決于PTR產(chǎn)物離子的質(zhì)量分析的結(jié)果，可做出自動(dòng)決策以使PTR產(chǎn)物離子經(jīng)受此進(jìn)一步PTR反應(yīng)，如由圖3C中所示的虛線任選路徑指示。所述決策也可以基于質(zhì)量分析的結(jié)果而做出以僅使PTR產(chǎn)物離子的選定子集經(jīng)受后續(xù)PTR反應(yīng)。在此些情況下，執(zhí)行步驟327。如果在步驟330中采用的質(zhì)量分析器是檢測(cè)通過離子阱或其它離子存儲(chǔ)裝置內(nèi)的循環(huán)離子運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的鏡像電流的類型，例如FT-ICR質(zhì)量分析器或Orbitrap^TM質(zhì)量分析器，那么PTR反應(yīng)步驟可有利地減少目標(biāo)蛋白質(zhì)或多肽分子的碰撞分布以使得這些分子在阱中保持穩(wěn)定達(dá)足夠時(shí)間長(zhǎng)度以產(chǎn)生高質(zhì)量質(zhì)譜。在足夠數(shù)目的PTR反應(yīng)步驟之后，接著可通過匹配于已知分子質(zhì)量的數(shù)據(jù)庫(kù)而快速辨別蛋白質(zhì)或多肽的化學(xué)身份(在步驟402c中)。少量(3到10種)蛋白質(zhì)的識(shí)別將一般足以唯一地識(shí)別微生物物質(zhì)(任選的步驟404c)。識(shí)別也可經(jīng)由如先前所論述使用應(yīng)用于PTR數(shù)據(jù)的分類器而實(shí)現(xiàn)，其包含(但不限于)貝葉斯、邏輯回歸或基于決策樹的方法。

圖3D到3E以流程圖形式說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明教示的另一方法方法390。方法390的步驟302-330在圖3D中所示且相同于方法380(圖3C)的先前論述類似編號(hào)的步驟，因此，此處不再描述這些步驟。并非從步驟330直接前進(jìn)到識(shí)別步驟402d(如圖3C的方法380中)，方法390(圖3D到3E)的執(zhí)行從步驟330前進(jìn)到質(zhì)量選擇和隔離步驟332。在步驟332中，根據(jù)選定m/z比隔離通過PTR程序的一或多次應(yīng)用而產(chǎn)生的PTR產(chǎn)物離子的子集。關(guān)于在此步驟期間將隔離的特定m/z比的決策可基于在步驟330中獲得的質(zhì)譜結(jié)果而自動(dòng)執(zhí)行。圖3E中說(shuō)明的步驟332-338表示離子分段程序，其可經(jīng)迭代以便產(chǎn)生多代分段產(chǎn)物離子。這些步驟332-338類似于圖3B中說(shuō)明的方法370的步驟318-322且因此不詳細(xì)論述。

在分段和質(zhì)量分析步驟的執(zhí)行之后，執(zhí)行方法390(圖3E)的肽識(shí)別步驟402d。方法300(圖3A)的識(shí)別步驟402a僅利用包括質(zhì)子化或多質(zhì)子化分析物分子的離子物質(zhì)的m/z比(或分子量)，而方法390的識(shí)別步驟402d還考慮了這些離子物質(zhì)的片段(可能多代)的m/z比。因此，在蛋白質(zhì)或多肽的復(fù)雜混合物的情況下，較大置信度可與使用方法390進(jìn)行的識(shí)別的結(jié)果相關(guān)聯(lián)。根據(jù)一些實(shí)施例通過如上所述利用實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)解卷積可實(shí)時(shí)執(zhí)行對(duì)實(shí)驗(yàn)的控制。在步驟402d中對(duì)少量(3到10個(gè))蛋白質(zhì)物質(zhì)的識(shí)別將一般足以在步驟404d中唯一地識(shí)別微生物物質(zhì)。

圖3F以流程圖形式概略地說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明教示的另一方法方法395。方法395(圖3F)中的大多數(shù)步驟類似于方法370(圖3B)中類似地編號(hào)的步驟且不再詳細(xì)地描述這些步驟。類似于方法370，方法395包含使原始前驅(qū)體離子經(jīng)受PTR電荷減少的步驟(步驟312)，隨后是隔離選定PTR產(chǎn)物離子物質(zhì)且使隔離的離子物質(zhì)經(jīng)受分段以便形成片段產(chǎn)物離子物質(zhì)的步驟(步驟318和320)。方法395通過提供使片段離子經(jīng)受PTR電荷減少的額外步驟步驟340而不同于方法370。由于從原始前驅(qū)體離子產(chǎn)生的各種PTR產(chǎn)物離子物質(zhì)可為多電荷的且可以各種程度的質(zhì)子化在物質(zhì)當(dāng)中分布，因此由其形成的片段離子本身可在多個(gè)質(zhì)子化狀態(tài)當(dāng)中分布。在步驟340中碎片離子物質(zhì)的PTR電荷減少可在步驟341中的其質(zhì)量分析之前簡(jiǎn)化片段離子的電荷態(tài)分布。任選地，PTR步驟(步驟312和步驟340)中的任一者可采用離子停車。

實(shí)例A

圖4A和4B提供由單個(gè)PTR反應(yīng)步驟提供的質(zhì)譜信號(hào)增強(qiáng)的實(shí)例(例如，如圖3A中所示的方法300中)。在第一應(yīng)用(圖4A，4B)中，經(jīng)由直接輸注分析來(lái)自病原體大腸桿菌的提取物，圖4A中示出第一代電噴射產(chǎn)生的離子的質(zhì)譜。正如期望，存在以各種m/z值重疊的許多蛋白質(zhì)，導(dǎo)致近似m/z＝780與m/z＝1420之間存在寬譜區(qū)域，其內(nèi)檢測(cè)到許多離子但在可辨別的蛋白質(zhì)電荷態(tài)分布方面只有極少的可用信息。接著，具有寬度2Th且以m/z＝750為中心的第一代離子的m/z“窗口”被隔離，且所得隔離的離子群體經(jīng)受PTR反應(yīng)。圖4A中所示的m/z位置412a指示隔離窗口的中心位置。

圖4B展示大腸桿菌提取物的前驅(qū)體離子的PTR反應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)譜。實(shí)行PTR反應(yīng)，其中在遞送到如圖2中所說(shuō)明的相同一般配置的質(zhì)譜儀的離子光學(xué)元件內(nèi)含有的輝光放電反應(yīng)劑離子源的氮?dú)饬髦袕?ppm的六氟化硫(SF₆)導(dǎo)出的反應(yīng)劑陰離子。如同大多數(shù)PTR產(chǎn)物離子光譜，圖4B中所示的質(zhì)譜在原始第一代離子隔離窗口的位置(如位置412b指示)處展現(xiàn)相對(duì)強(qiáng)烈的隔離峰。在隔離窗口的位置處的這些峰一般指示在隔離的位置處偶然發(fā)生的殘余單電荷第一代離子(一般不關(guān)注)的存在。圖4B的譜中的其它峰表示從PTR反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物離子。這些產(chǎn)物離子一般包括相關(guān)離子的重疊集合，每一集合對(duì)應(yīng)于包括來(lái)自原始隔離窗口內(nèi)的原始多電荷前驅(qū)體離子的電荷態(tài)分布的離子。一種此類可能的電荷態(tài)分布圖案由包絡(luò)413近似指示。圖4A和4B中所示的結(jié)果展示PTR反應(yīng)過程一般顯著簡(jiǎn)化譜且減少背景干擾。但是，由于許多蛋白質(zhì)導(dǎo)出或肽導(dǎo)出的前驅(qū)體離子可能存在于原始隔離窗口中，因此電荷態(tài)分布圖案可能重疊。可能需要數(shù)學(xué)分解(有時(shí)稱為“解卷積”)來(lái)辨識(shí)個(gè)別圖案。

實(shí)例B

圖5A和5B說(shuō)明由包含PTR反應(yīng)的兩個(gè)階段的程序執(zhí)行的大腸桿菌提取物的分析的實(shí)例(例如，參見圖3C中的方法380的步驟327、328、329和330)。圖5A說(shuō)明來(lái)自以m/z＝1200為中心的5Th質(zhì)量窗口內(nèi)的PTR產(chǎn)物離子譜產(chǎn)生的隔離第一代前驅(qū)體離子，由圖5A中的位置711指示。在此實(shí)例中，初始PTR譜不包含經(jīng)充分良好解析以實(shí)現(xiàn)樣本中的任何蛋白質(zhì)的識(shí)別的峰。因此，針對(duì)來(lái)自以m/z＝1320為中心的5Th質(zhì)量窗口內(nèi)的PTR的第二階段隔離第一代PTR產(chǎn)物離子的子集，由圖5A中的位置712a和圖5B中的位置712b指示。在圖5B中以大于1320的m/z比發(fā)生的第二代PTR產(chǎn)物離子展示可成功地用于樣本中蛋白質(zhì)的識(shí)別的清楚電荷態(tài)分布圖案。

圖6A到6G說(shuō)明由包含通過PTR反應(yīng)的產(chǎn)物離子形成的第一階段隨后是PTR反應(yīng)產(chǎn)物離子的CID的后續(xù)階段的程序(例如，參見圖3B中的方法370的步驟312到322)執(zhí)行的大腸桿菌提取物分析的實(shí)例。圖6A說(shuō)明來(lái)自以m/z＝640為中心的5Th質(zhì)量窗口內(nèi)的PTR產(chǎn)物離子譜產(chǎn)生的隔離第一代前驅(qū)體離子，由圖6A中的位置811指示。PTR產(chǎn)物離子以比圖6A中位置811指示的情況更大的m/z比發(fā)生。圖6A中分別位于833、926和917的m/z比處且有質(zhì)譜峰813、814和815指示的三種最強(qiáng)烈PTR產(chǎn)物離子隨后被個(gè)別地隔離且單獨(dú)地經(jīng)受碰撞引起的解離以便產(chǎn)生第二代產(chǎn)物離子的三個(gè)集合。圖6B和6C分別描繪在m/z＝833處的隔離PTR產(chǎn)物離子以及通過隔離PTR產(chǎn)物離子的CID產(chǎn)生的第二代產(chǎn)物離子(片段離子)。同樣，圖6D和6E分別描繪在m/z＝926處的隔離PTR產(chǎn)物離子以及通過在m/z＝926處的隔離PTR產(chǎn)物離子的CID產(chǎn)生的第二代產(chǎn)物離子。同樣，圖6F和6G分別描繪在m/z＝917處的隔離PTR產(chǎn)物離子以及通過在m/z＝917處的隔離PTR產(chǎn)物離子的CID產(chǎn)生的第二代產(chǎn)物離子。

實(shí)例C

如從先前論述將顯而易見，任何蛋白質(zhì)或多肽分子的陽(yáng)離子電噴射電離將由于原始分子的不同程度質(zhì)子化而產(chǎn)生包括不同相應(yīng)電荷態(tài)(即，電荷數(shù)目)的多個(gè)離子。+50或更多的電荷態(tài)或者可能的及每一電荷態(tài)將由表示不同程度的自然同位素取代的多個(gè)質(zhì)譜線表示。另一并發(fā)情況從以下事實(shí)產(chǎn)生：對(duì)于大多數(shù)自然生物樣本，多肽分子的許多不同蛋白質(zhì)可在質(zhì)譜中表示。又一并發(fā)情況從以下事實(shí)產(chǎn)生：不一定關(guān)注的許多其它分子可能存在于樣本中。

在許多面向基本研究的研究中，多個(gè)分析物和多個(gè)干擾物質(zhì)的上述并發(fā)因素可以通過在將每一分離化合物個(gè)別地引入質(zhì)譜儀中之前執(zhí)行色度分離而部分地或完全地解析。然而，臨床分析常常會(huì)在緊張的時(shí)間約束下執(zhí)行，這并不允許傳統(tǒng)的耗時(shí)層析分離。臨床時(shí)間約束可僅允許使用固相萃取(SPE)、尺寸排阻層析或上述快速部分層析分離(FPCS)的方法的不完全或部分分離。因此，當(dāng)采用這些部分分離程序時(shí)，任何特定蛋白質(zhì)或多肽的質(zhì)譜特征可以擴(kuò)展到寬質(zhì)荷比之外，且可與其它化合物的質(zhì)譜特征復(fù)雜地重疊。由于由電噴射設(shè)備提供的可用電荷將在許多不同類型的離子上擴(kuò)展，因此大多數(shù)觀測(cè)到的質(zhì)譜線將共存且可能隱藏于一般密集群體且低強(qiáng)度或不良界定的譜“背景”中，這由圖7A到7B中的譜包絡(luò)902示意性地指示。

發(fā)明人已經(jīng)實(shí)現(xiàn)任何特定蛋白質(zhì)、多肽或其它生物相關(guān)高分子量分析物的質(zhì)譜特征可通過以下方式假設(shè)地放大：同時(shí)隔離同一原始分子的多個(gè)電荷態(tài)，并且然后使多個(gè)態(tài)的集合與PTR反應(yīng)劑離子反應(yīng)以便將所述集合同時(shí)減少到在幾個(gè)電荷態(tài)值上分布的少量電荷態(tài)，這些電荷態(tài)值相對(duì)于原始電荷態(tài)經(jīng)減少。此概念由圖7A中上覆于一般電荷態(tài)包絡(luò)902上所示的垂直方框904a-904g說(shuō)明。每一此垂直方框表示特定前驅(qū)體離子物質(zhì)且表示經(jīng)選擇為對(duì)應(yīng)于特定分析物的特定電荷態(tài)(且可能包含幾個(gè)同位素變體)的m/z值的小范圍。假設(shè)地，如果可排除對(duì)應(yīng)于垂直方框的范圍之外的所有離子且僅來(lái)自所指示范圍內(nèi)的離子混合在一起，那么后續(xù)PTR將基本上提供來(lái)自各種原始的多個(gè)電荷態(tài)的信號(hào)的求和。多個(gè)前驅(qū)體離子物質(zhì)的此多物質(zhì)隔離的使用可使分析的靈敏度增加多達(dá)N倍，其中N是經(jīng)選擇且同時(shí)隔離的m/z范圍的數(shù)目。

當(dāng)在線性離子阱(例如在圖2中說(shuō)明的低壓線性阱單元217b)中執(zhí)行時(shí)此多物質(zhì)隔離相當(dāng)容易實(shí)現(xiàn)，因?yàn)橛靡耘懦霾幌Ｍ碾x子的諧振激發(fā)波形可構(gòu)造有多個(gè)缺口。每一此缺口對(duì)應(yīng)于不同的相應(yīng)m/z窗口，其內(nèi)將不排出離子(且因此隔離)。因此，在一些實(shí)施例中，可通過同時(shí)隔離全部多個(gè)前驅(qū)體離子物質(zhì)而執(zhí)行多個(gè)電噴射產(chǎn)生(第一代)前驅(qū)體離子物質(zhì)的共同隔離。進(jìn)行此的一種方式是通過將寬帶諧振排出頻率波形應(yīng)用于從電噴射源接收的離子已經(jīng)引入其中的離子阱，其中所述波形包括多個(gè)求和的正弦頻率分量，其中包含的頻率分量對(duì)應(yīng)于希望從阱排出的離子的m/z范圍且排除的頻率分量對(duì)應(yīng)于希望在阱內(nèi)保持的離子的m/z范圍。在此程序中，省略的頻率界定排出頻率波形中的一或多個(gè)頻率缺口?？赏ㄟ^首先挑選所需的多缺口波形并且然后計(jì)算所需波形的傅里葉逆變換而計(jì)算所述頻率分量。

替代地，可通過使用施加于離子阱的相應(yīng)單缺口波形在常規(guī)意義上每次一種離子物質(zhì)地隔離個(gè)別前驅(qū)體離子物質(zhì)而執(zhí)行所述多個(gè)前驅(qū)體離子物質(zhì)的共同隔離。個(gè)別地隔離的前驅(qū)體離子物質(zhì)可一次一個(gè)地傳送到離子存儲(chǔ)組件(例如在圖2中說(shuō)明的多極離子導(dǎo)向器214)，其中各種選定且隔離的離子物質(zhì)隨時(shí)間而積聚。作為又一替代例，可通過使從電噴射源接收的多個(gè)離子通過四極濾質(zhì)器，同時(shí)所述四極濾質(zhì)器的帶通經(jīng)循序地調(diào)諧以又優(yōu)先發(fā)射對(duì)應(yīng)于特定前驅(qū)體離子物質(zhì)的每一m/z范圍而執(zhí)行所述多個(gè)前驅(qū)體離子物質(zhì)的共同隔離。通過四極濾質(zhì)器的經(jīng)過濾離子隨后傳遞到離子存儲(chǔ)組件，所述組件積聚來(lái)自所有優(yōu)先發(fā)射的m/z范圍的離子。舉例來(lái)說(shuō)，在圖2中說(shuō)明的質(zhì)譜儀150a中，四極濾質(zhì)器208可執(zhí)行過濾步驟的序列且每一發(fā)射m/z范圍的離子可發(fā)射到多極離子導(dǎo)向器214內(nèi)且在其內(nèi)積聚。積聚的前驅(qū)體離子物質(zhì)接著可傳送返回至低壓?jiǎn)卧?17b用于PTR反應(yīng)。

采用同時(shí)的多物質(zhì)隔離的上述程序假定先驗(yàn)已知的適當(dāng)隔離范圍904a-904g。關(guān)于將采用的正確隔離范圍的此知識(shí)在目標(biāo)分析的某些例子中當(dāng)待搜索的分析物的身份(和關(guān)于其的其它信息)已經(jīng)已知且分析的目的是確定所述分析物存在或不存在或者確定所述分析物的數(shù)量或濃度時(shí)是可用的。然而，在其中分析物的身份可能不是事先已知的調(diào)查分析的情況下以上假設(shè)可為無(wú)效的。在后面的這些情況下，可通過如圖7B中示意性地描繪隔離第一代離子的隨機(jī)質(zhì)量范圍903并且然后使隔離的離子與PTR反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)而執(zhí)行初始隨機(jī)調(diào)查。如先前在圖4A和4B中說(shuō)明，此程序可提供與一或多個(gè)分析物的電荷態(tài)分布相關(guān)的經(jīng)解析、可解譯的質(zhì)譜線。在許多情況下，可通過相關(guān)線的m/z值與用于連續(xù)整數(shù)z的某一序列的等式1的相互一致性來(lái)辨識(shí)相關(guān)線的集合。線位置的一致性的程度可通過計(jì)算機(jī)分析自動(dòng)執(zhí)行以使得此些相關(guān)線的重疊集合可在數(shù)學(xué)上經(jīng)分解且辨識(shí)。

作為以上類型分析的實(shí)例，通過m/z范圍903內(nèi)的前驅(qū)體離子的隔離和反應(yīng)而產(chǎn)生的PTR產(chǎn)物離子線的數(shù)學(xué)分解可導(dǎo)致對(duì)如圖7C中所說(shuō)明由包絡(luò)905和包絡(luò)906描繪的兩個(gè)重疊線集合的辨識(shí)。借助通過此初始調(diào)查程序提供的信息，可選擇適當(dāng)且一致的m/z值集合，其可用于后續(xù)同時(shí)的多物質(zhì)隔離和反應(yīng)程序中。舉例來(lái)說(shuō)，可能可以自動(dòng)選擇包絡(luò)905下方的線的某些解析實(shí)例的m/z值。對(duì)應(yīng)于這些所選m/z值的前驅(qū)體離子的后續(xù)多物質(zhì)隔離和PTR反應(yīng)將隨后提供放大的譜，所述譜可用以確定由包絡(luò)905表示的特定分子的數(shù)量或濃度。此程序可稍后使用相關(guān)聯(lián)包絡(luò)906重復(fù)以便確定另一分子的數(shù)量或濃度。所確定的數(shù)量或濃度在絕對(duì)意義上可能不是準(zhǔn)確的，但所確定的數(shù)量或濃度的比率可提供與相對(duì)數(shù)量或濃度相關(guān)的有用信息。上文概述的此整個(gè)程序可使用不同隨機(jī)選擇的m/z范圍903重復(fù)多次，從而提供若干化合物的相對(duì)數(shù)量或濃度的確定。如先前陳述，可利用實(shí)時(shí)光譜解卷積的結(jié)果以數(shù)據(jù)相依方式實(shí)現(xiàn)對(duì)此些實(shí)驗(yàn)的控制。

圖8提供使用上文概括的通過PTR反應(yīng)劑離子與來(lái)自多個(gè)非鄰接m/z范圍的第一代離子的反應(yīng)的PTR信號(hào)放大進(jìn)行調(diào)查分析的示范性方法方法397的一般流程圖。方法397的步驟302、304、306、308、309、312、314、316、402和404相同于在圖3A中說(shuō)明的方法300的類似編號(hào)的步驟且因此此處不再描述。并且，新步驟311類似于方法300的先前描述的步驟310，但步驟311僅涉及第一代離子的隨機(jī)m/z范圍(例如圖7C中所描繪的范圍903)的質(zhì)量隔離，而不涉及如針對(duì)先前方法300描述的“一或多個(gè)隨機(jī)或預(yù)定m/z范圍”。在初始調(diào)查PTR反應(yīng)(步驟312)和電荷態(tài)序列的識(shí)別(步驟316)之后，執(zhí)行步驟323，其中隔離且積聚第一代離子的多個(gè)非鄰接m/z范圍，其中所述非鄰接m/z范圍對(duì)應(yīng)于經(jīng)識(shí)別電荷態(tài)序列?？蓮南惹按鎯?chǔ)的此些離子的批次獲得第一代離子(先前步驟319a)，或替代地(先前步驟319b)，可能需要重復(fù)樣本引入和電噴射離子產(chǎn)生步驟。

在第一代離子的多個(gè)非鄰接m/z范圍的隔離和積聚(步驟323)之后，使積聚的離子與PTR反應(yīng)劑離子反應(yīng)(步驟324)。所得放大的譜將一般具有高質(zhì)量，從而促進(jìn)例如對(duì)應(yīng)于多個(gè)非鄰接m/z范圍的分子的準(zhǔn)確分子量或者此分子的準(zhǔn)確數(shù)量、濃度或相對(duì)豐度的導(dǎo)出(步驟325)。如果步驟316的緊鄰在前的執(zhí)行識(shí)別出相關(guān)m/z比的多于一個(gè)集合，那么可使用對(duì)應(yīng)于不同經(jīng)識(shí)別電荷態(tài)序列的非鄰接m/z范圍的新集合再次執(zhí)行步驟319a或319b和步驟323-325(跟隨步驟326的最左邊“Y”分支)。如果針對(duì)可能的額外分析物的搜索將繼續(xù)，那么執(zhí)行可返回到步驟311(跟隨步驟326的最右邊“Y”分支)，在此選擇不同的隨機(jī)m/z范圍。

實(shí)例D

依據(jù)根據(jù)本發(fā)明教示的利用質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的樣本復(fù)雜性減少的另一方法，采用PTR的質(zhì)譜分析可與層析法直接關(guān)聯(lián)以便簡(jiǎn)化且檢測(cè)原本將錯(cuò)過的額外蛋白質(zhì)。在此實(shí)施例中，采取全掃描質(zhì)譜且使用實(shí)時(shí)解卷積程序計(jì)算蛋白質(zhì)分子量。接著，選擇具有經(jīng)界定寬度的隔離窗口，且使所述窗口中的m/z值的子集經(jīng)受PTR反應(yīng)。

舉例來(lái)說(shuō)，圖9A展示在大腸桿菌提取物的十分鐘梯度反相液相層析分離的過程期間在10分鐘30秒的滯留時(shí)間下從溶離液產(chǎn)生的第一代離子的全掃描質(zhì)譜。如圖9A中的括號(hào)指示，此全掃描質(zhì)譜展現(xiàn)分別具有35.1和31.1kDa的近似分子量的兩種蛋白質(zhì)的相異光譜特征。對(duì)于下一步驟，具有10Th寬度且以750Th為中心的m/z隔離窗口510內(nèi)的m/z值的離子群體被隔離。隨后使隔離的離子群體經(jīng)受與陰離子反應(yīng)劑六氟化硫的PTR反應(yīng)達(dá)10ms。圖9B中所示的所得產(chǎn)物離子質(zhì)譜展現(xiàn)了具有11220.07Da和24599.56Da的分子量的全掃描質(zhì)譜中未見的兩種額外蛋白質(zhì)的質(zhì)譜特征。另外，在全掃描質(zhì)譜中先前觀測(cè)到的35.1kDa蛋白質(zhì)組分也展現(xiàn)PTR產(chǎn)物離子譜中的譜特征，其包含對(duì)應(yīng)于在749的標(biāo)稱m/z值處的+47電荷態(tài)的線，在方框520中描繪。在749Th處的線表示35.1kDa蛋白質(zhì)的甚至更高電荷態(tài)的電荷減少。在11.2和24.6kDa處觀測(cè)到的蛋白質(zhì)在反相層析運(yùn)行的此實(shí)例中無(wú)PTR步驟存在下將不會(huì)被識(shí)別，原因是復(fù)雜的譜重疊以及來(lái)自大量單電荷背景離子的干擾噪聲。

圖10A和10B展示來(lái)自六十分鐘梯度溶離運(yùn)行的在42分鐘30秒的滯留時(shí)間下從溶離液獲得的類似層析法/MS實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。如圖10A中所示，在此溶離時(shí)間下的高背景造成識(shí)別全掃描譜中的分析物峰的困難。然而，圖10B中標(biāo)繪的PTR產(chǎn)物離子譜更容易經(jīng)受解譯和質(zhì)譜解卷積。PTR產(chǎn)物離子譜展現(xiàn)原本將觀測(cè)不到的三種相異蛋白質(zhì)(具體地說(shuō)具有11165.92Da、13480.28Da和18727.23Da的分子量)的質(zhì)譜特征。在此實(shí)例中，從10Th寬度的以m/z 750為中心的質(zhì)譜窗口(圖10A中由方框610指示)產(chǎn)生的隔離前驅(qū)體離子產(chǎn)生PTR產(chǎn)物離子。通過對(duì)在單個(gè)實(shí)驗(yàn)過程期間在各種不同滯留時(shí)間下溶離的溶離液執(zhí)行此類型的分析，可辨識(shí)足夠數(shù)目的樣本肽以便實(shí)現(xiàn)在物質(zhì)、亞種或菌株層級(jí)的對(duì)微生物的識(shí)別。如圖9A到9B中所示的結(jié)果也指示，如果存在來(lái)自隔離窗口內(nèi)的全質(zhì)譜的蛋白質(zhì)離子的m/z重疊，那么所述蛋白質(zhì)將也在PTR產(chǎn)物離子質(zhì)譜中見到。

有趣的是，全掃描質(zhì)譜和PTR產(chǎn)物離子質(zhì)譜可提供互補(bǔ)信息，如圖11A和11B中所說(shuō)明，其表示在三十分鐘層析分離的過程中從在18分鐘9秒的滯留時(shí)間下溶離的溶離液獲得的質(zhì)譜結(jié)果。在此實(shí)例中，全掃描質(zhì)譜(圖11A)展現(xiàn)具有9534.3Da的分子量的基本上單個(gè)蛋白質(zhì)的強(qiáng)質(zhì)譜特征，然而，當(dāng)PTR產(chǎn)物離子譜是從在以m/z 750Th為中心的10Th寬窗口(方框530)內(nèi)隔離的離子產(chǎn)生時(shí)，質(zhì)譜特征包括來(lái)自具有14965.5Da的分子量的蛋白質(zhì)(由在近似1247Th處的+12電荷態(tài)的峰535最佳表示)以及具有12669.8Da、14150.0Da、14236.1Da、14965.5Da和15117.5Da的分子量的五個(gè)其它微小蛋白質(zhì)的強(qiáng)信號(hào)。圖11C是在同一層析分離期間從在22分鐘27秒的滯留時(shí)間下溶離的溶離液獲得的全掃描質(zhì)譜。所述譜包含指示具有24961.3Da的分子量的蛋白質(zhì)的存在的峰。在隔離窗口540內(nèi)隔離的離子的PTR反應(yīng)后，獲得圖11D中所示的PTR產(chǎn)物離子譜。PTR產(chǎn)物離子譜中的質(zhì)譜特征包含來(lái)自具有28461.5Da的分子量的蛋白質(zhì)(由在近似1294Th處的+22電荷態(tài)的峰545最佳表示)以及具有18590.5Da和20168.0Da的分子量的兩個(gè)其它蛋白質(zhì)的相對(duì)強(qiáng)信號(hào)。因此，僅從這兩個(gè)滯留時(shí)間處的數(shù)據(jù)，有可能檢測(cè)十一種不同蛋白質(zhì)的存在和分子量。

額外實(shí)例

以下段落列出根據(jù)本發(fā)明教示的各種具體實(shí)施例的額外具體實(shí)例。

實(shí)例1.一種用于識(shí)別液體樣本內(nèi)的蛋白質(zhì)或多肽分析物化合物的存在或不存在的方法，所述液體樣本包括化合物的混合物，所述混合物包含多種蛋白質(zhì)化合物或多種多肽化合物或多種蛋白質(zhì)和多肽化合物，所述方法包括：

(a)將所述液體樣本的一部分引入到質(zhì)譜儀的電噴射電離源中；

(b)通過電噴射電離形成所述液體樣本的所述部分的所述化合物混合物的帶正電離子，所述帶正電離子包括多個(gè)離子物質(zhì)；

(c)隔離包括第一質(zhì)荷比(m/z)比率范圍的所述離子物質(zhì)的第一子集，所述范圍包含所述分析物化合物的特定預(yù)定多質(zhì)子化分子物質(zhì)的m/z比；

(d)通過致使所述隔離的離子物質(zhì)的第一子集在預(yù)定持續(xù)時(shí)間中與反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)而從所述隔離的離子物質(zhì)的第一子集產(chǎn)生多個(gè)第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)，所述反應(yīng)劑陰離子在反應(yīng)后從一或多個(gè)離子物質(zhì)中的包括蛋白質(zhì)或多肽化合物的質(zhì)子化分子物質(zhì)的每一者提取質(zhì)子；

(e)使用質(zhì)量分析器產(chǎn)生所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)或從所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)產(chǎn)生的第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)的質(zhì)譜；

(f)進(jìn)行對(duì)所述第一代或所述第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)的所述質(zhì)譜的搜索以找到作為所述蛋白質(zhì)或多肽分析物化合物的診斷的一或多個(gè)m/z比的集合；以及

(g)如果在所述質(zhì)譜中識(shí)別出一或多個(gè)m/z比的所述集合，那么識(shí)別所述樣本內(nèi)的所述分析物化合物的存在。

實(shí)例2.根據(jù)實(shí)例1所述的方法，其進(jìn)一步包括第二次重復(fù)所述步驟(a)到(e)，其中在所述步驟(a)到(e)的所述第二次執(zhí)行期間或之前執(zhí)行所述步驟(f)和(g)。

實(shí)例3.根據(jù)實(shí)例1所述的方法，其進(jìn)一步包括多次重復(fù)執(zhí)行步驟(a)到(g)，其中步驟(a)的每一重復(fù)包括將來(lái)自對(duì)應(yīng)于相應(yīng)滯留時(shí)間的層析柱的溶離液引入到所述電噴射電離源中。

實(shí)例4.根據(jù)實(shí)例1所述的方法，其中所述步驟(f)包括進(jìn)行對(duì)所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)的所述質(zhì)譜的搜索以找到對(duì)應(yīng)于所述分析物化合物的多質(zhì)子化離子物質(zhì)序列的一系列m/z比，所述多質(zhì)子化離子物質(zhì)序列相對(duì)于所述特定預(yù)定多質(zhì)子化分子物質(zhì)的電荷態(tài)漸進(jìn)地電荷減少。

實(shí)例5.根據(jù)實(shí)例1所述的方法，其中：

所述步驟(c)包括進(jìn)一步隔離所述離子物質(zhì)的第二子集，所述第二子集包括第二m/z比范圍，所述范圍包含第二蛋白質(zhì)或多肽分析物化合物的特定預(yù)定多質(zhì)子化分子物質(zhì)的m/z比；

所述步驟(f)包括進(jìn)行對(duì)所述第一代或所述第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)的所述質(zhì)譜的額外搜索以找到作為所述第二蛋白質(zhì)或多肽分析物化合物的診斷的一或多個(gè)m/z比的第二集合；以及

所述步驟(g)包括如果在所述質(zhì)譜中識(shí)別出m/z比的所述第二集合，那么識(shí)別所述樣本內(nèi)的所述第二分析物化合物的存在。

實(shí)例6.根據(jù)實(shí)例5所述的方法，其中所述第一m/z比范圍相同于所述第二m/z比范圍。

實(shí)例7.根據(jù)實(shí)例5所述的方法，其中所述步驟(c)包括同時(shí)隔離包括所述第一m/z比范圍的所述離子物質(zhì)的所述第一子集以及包括所述第二m/z比范圍的所述離子物質(zhì)的所述第二子集以使得所述第一和第二m/z比范圍是非鄰接的。

實(shí)例8.根據(jù)實(shí)例1所述的方法，其中產(chǎn)生多個(gè)第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)的所述步驟(d)包括致使所述隔離的離子物質(zhì)的第一子集和反應(yīng)劑陰離子在一持續(xù)時(shí)間中反應(yīng)，所述持續(xù)時(shí)間致使在步驟(e)中的所述質(zhì)譜的后續(xù)產(chǎn)生期間所述產(chǎn)物離子物質(zhì)穩(wěn)定而不會(huì)分解。

實(shí)例9.根據(jù)實(shí)例8所述的方法，其中所述步驟(e)包括使用質(zhì)量分析器產(chǎn)生所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)的質(zhì)譜，所述質(zhì)量分析器通過檢測(cè)由離子阱內(nèi)所述產(chǎn)物離子物質(zhì)的所述離子的運(yùn)動(dòng)造成的鏡像電流來(lái)產(chǎn)生所述質(zhì)譜。

實(shí)例10.根據(jù)實(shí)例1所述的方法，其中產(chǎn)生多個(gè)第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)的所述步驟(d)包含跨越離子阱的電極施加補(bǔ)充AC電壓，在所述離子阱內(nèi)所述隔離的離子物質(zhì)的第一子集與反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)，其中所述補(bǔ)充AC電壓的頻率使得禁止所述反應(yīng)劑陰離子與選定的第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)之間的離子-離子反應(yīng)。

實(shí)例11.根據(jù)實(shí)例10所述的方法，其中所述補(bǔ)充AC電壓的所述頻率使得在步驟(d)的執(zhí)行之后，由所述分析物化合物形成的產(chǎn)物離子大體上作為具有特定電荷態(tài)的單個(gè)離子物質(zhì)而存在。

實(shí)例12.根據(jù)實(shí)例11所述的方法，其中：

所述步驟(e)包括產(chǎn)生所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)的質(zhì)譜；以及

其中所述單個(gè)離子物質(zhì)的質(zhì)量大于20,000Da且所述單個(gè)離子物質(zhì)的電荷態(tài)充分大以使得可在所述質(zhì)譜的產(chǎn)生期間通過四極質(zhì)量分析器、傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀或靜電阱質(zhì)量分析器檢測(cè)所述單個(gè)離子物質(zhì)的離子。

實(shí)例13.根據(jù)實(shí)例1所述的方法，其中產(chǎn)生質(zhì)譜的所述步驟(e)包括產(chǎn)生第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)的質(zhì)譜，其中所述第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)是通過以下步驟產(chǎn)生：

隔離包括特定產(chǎn)物離子m/z比范圍的所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)的子集；以及

使所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)的所述隔離的子集分段以便形成片段離子物質(zhì)，其中所述片段離子物質(zhì)包括所述第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)。

實(shí)例14.根據(jù)實(shí)例1所述的方法，其中產(chǎn)生質(zhì)譜的所述步驟(e)包括產(chǎn)生第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)的質(zhì)譜，其中所述第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)是通過以下步驟產(chǎn)生：

致使所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)在第二預(yù)定持續(xù)時(shí)間中與所述反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)，其中所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)與所述反應(yīng)劑陰離子之間的反應(yīng)的產(chǎn)物包括所述第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)。

實(shí)例15.根據(jù)實(shí)例14所述的方法，其中跨越離子阱的電極施加補(bǔ)充AC電壓，在所述離子阱內(nèi)所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)與所述反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)，其中所述補(bǔ)充AC電壓的頻率使得禁止所述反應(yīng)劑陰離子與選定產(chǎn)物離子物質(zhì)之間的離子-離子反應(yīng)。

實(shí)例16.根據(jù)實(shí)例1到15中的任一者所述的方法，其進(jìn)一步包括通過包括以下各項(xiàng)的程序產(chǎn)生包括所述化合物混合物的所述液體樣本：

(i)培養(yǎng)微生物或細(xì)胞；

(ii)裂解所述經(jīng)培養(yǎng)的微生物或細(xì)胞；以及

(iii)從經(jīng)培養(yǎng)的微生物或細(xì)胞的所述裂解物提取蛋白質(zhì)。

實(shí)例17.根據(jù)實(shí)例16所述的方法，其中從所述裂解物提取所述液體樣本的所述步驟(iii)包含使所述裂解物通過固相提取設(shè)備。

實(shí)例18.一種識(shí)別樣本中的微生物類型的存在或不存在的方法，其包括：

(i)識(shí)別在所述樣本中的同時(shí)存在是所述樣本中的所述微生物類型的存在的診斷的分析物化合物的列表，所述分析物化合物的列表包括蛋白質(zhì)化合物、多肽化合物或蛋白質(zhì)和多肽化合物兩者；

(ii)從所述樣本提取包括從樣本導(dǎo)出的蛋白質(zhì)和多肽的混合物的液體溶液；

(iii)對(duì)于所述列表中的每一相應(yīng)分析物化合物，執(zhí)行以下步驟：

(a)將所述液體溶液的一部分引入到質(zhì)譜儀的電噴射電離源中；

(b)通過電噴射電離形成所述液體溶液的所述部分的所述化合物混合物的帶正電離子，所述帶正電離子包括多個(gè)離子物質(zhì)；

(c)隔離包括第一質(zhì)荷比(m/z)比率范圍的所述離子物質(zhì)的第一子集，所述范圍包含所述相應(yīng)分析物化合物的特定預(yù)定多質(zhì)子化分子物質(zhì)的m/z比；

(d)通過致使所述隔離的離子物質(zhì)的第一子集在預(yù)定持續(xù)時(shí)間中與反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)而從所述隔離的離子物質(zhì)的第一子集產(chǎn)生多個(gè)第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)，所述反應(yīng)劑陰離子在反應(yīng)后從一或多個(gè)離子物質(zhì)中的包括蛋白質(zhì)或多肽化合物的質(zhì)子化分子物質(zhì)的每一者提取質(zhì)子；

(e)使用質(zhì)量分析器產(chǎn)生所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)或從所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)產(chǎn)生的第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)的質(zhì)譜；

(f)進(jìn)行對(duì)所述第一代或所述第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)的所述質(zhì)譜的搜索以找到作為所述相應(yīng)分析物化合物的診斷的一或多個(gè)m/z比的集合；以及

(g)如果在所述質(zhì)譜中識(shí)別出一或多個(gè)m/z比的所述集合，那么識(shí)別所述液體溶液內(nèi)的所述相應(yīng)分析物化合物的存在；以及

(iv)如果在所述液體溶液內(nèi)識(shí)別出所述分析物化合物列表的每一和每個(gè)分析物化合物的存在，那么識(shí)別所述樣本內(nèi)的所述微生物類型的存在。

實(shí)例19.一種識(shí)別樣本中的微生物類型的存在或不存在的方法，其包括：

(i)識(shí)別在所述樣本中的同時(shí)存在是所述樣本中的所述微生物類型的存在的診斷的分析物化合物的列表，所述分析物化合物的列表包括蛋白質(zhì)化合物、多肽化合物或蛋白質(zhì)和多肽化合物兩者；

(ii)從所述樣本提取包括從樣本導(dǎo)出的蛋白質(zhì)和多肽的混合物的液體溶液；

(iii)將所述液體溶液的至少第一部分引入到質(zhì)譜儀的電離源中；

(iv)從所述電離源處的所述液體溶液的所述至少第一部分產(chǎn)生所述化合物混合物的帶正電離子，所述帶正電離子包括多個(gè)離子物質(zhì)；

(v)隔離所述多個(gè)離子物質(zhì)的至少第一子集，所述至少第一隔離的子集的每一隔離的子集包括相應(yīng)質(zhì)荷比(m/z)比率范圍；

(vi)通過使離子物質(zhì)的每一所述隔離的子集在預(yù)定持續(xù)時(shí)間中與反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)而從離子物質(zhì)的每一隔離的子集產(chǎn)生多個(gè)第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)，所述反應(yīng)劑陰離子在反應(yīng)后從離子物質(zhì)的所述隔離的子集的一或多個(gè)離子物質(zhì)中的包括蛋白質(zhì)或多肽化合物的質(zhì)子化分子物質(zhì)的每一者提取質(zhì)子；

(vii)使用所述質(zhì)譜儀的質(zhì)量分析器產(chǎn)生第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)或通過所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)的進(jìn)一步反應(yīng)產(chǎn)生的第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)的至少一個(gè)質(zhì)譜；

(viii)對(duì)于所述列表中的每一相應(yīng)分析物化合物，執(zhí)行以下步驟：

(a)進(jìn)行對(duì)所述第一代或所述第二代產(chǎn)物離子物質(zhì)的所述至少一個(gè)質(zhì)譜的搜索以找到作為所述相應(yīng)分析物化合物的診斷的一或多個(gè)m/z比的集合；以及

(b)如果在所述質(zhì)譜中識(shí)別出一或多個(gè)m/z比的所述集合，那么識(shí)別所述液體溶液內(nèi)的所述相應(yīng)分析物化合物的存在；以及

(ix)如果在所述液體溶液內(nèi)識(shí)別出所述分析物化合物列表的每一和每個(gè)分析物化合物的存在，那么識(shí)別所述樣本內(nèi)的所述微生物類型的存在。

實(shí)例20.根據(jù)實(shí)例19所述的方法，其中與所述步驟(iii)到(vii)中的一或多者的執(zhí)行同時(shí)執(zhí)行所述步驟(a)和(b)的執(zhí)行。

實(shí)例21.根據(jù)實(shí)例19所述的方法，其中所述微生物類型經(jīng)界定為特定細(xì)菌種類，且所述分析物化合物列表包含作為所述特定細(xì)菌種類的診斷的足夠數(shù)目的分析物化合物以實(shí)現(xiàn)所述樣本中所述特定細(xì)菌種類的存在或不存在的識(shí)別。

實(shí)例22.根據(jù)實(shí)例19所述的方法，其中所述微生物類型經(jīng)界定為特定細(xì)菌物質(zhì)，且所述分析物化合物列表包含作為所述特定細(xì)菌物質(zhì)的診斷的足夠數(shù)目的分析物化合物以實(shí)現(xiàn)所述樣本中所述特定細(xì)菌物質(zhì)的存在或不存在的識(shí)別。

實(shí)例23.根據(jù)實(shí)例19所述的方法，其中所述微生物類型經(jīng)界定為特定細(xì)菌子物質(zhì)，且所述分析物化合物列表包含作為所述特定細(xì)菌子物質(zhì)的診斷的足夠數(shù)目的分析物化合物以實(shí)現(xiàn)所述樣本中所述特定細(xì)菌子物質(zhì)的存在或不存在的識(shí)別。

實(shí)例24.根據(jù)實(shí)例19所述的方法，其中所述微生物類型經(jīng)界定為特定病毒菌株，且所述分析物化合物列表包含作為所述特定病毒菌株的診斷的足夠數(shù)目的分析物化合物以實(shí)現(xiàn)所述樣本中所述特定病毒菌株的存在或不存在的識(shí)別。

實(shí)例25.根據(jù)實(shí)例19所述的方法，其中所述微生物類型經(jīng)界定為特定病毒菌株，且所述分析物化合物列表包含作為所述特定病毒菌株的診斷的足夠數(shù)目的分析物化合物以實(shí)現(xiàn)所述樣本中所述特定病毒菌株的存在或不存在的識(shí)別。

實(shí)例26.一種用于識(shí)別樣本內(nèi)的蛋白質(zhì)或多肽分析物化合物的存在或不存在的方法，所述樣本包括化合物的混合物，所述混合物包含多種蛋白質(zhì)化合物或多種多肽化合物或多種蛋白質(zhì)和多肽化合物，所述方法包括：

(a)將所述液體樣本的一部分引入到質(zhì)譜儀的電噴射電離源中；

(b)通過電噴射電離形成所述液體樣本的所述部分的所述化合物混合物的帶正電離子，所述帶正電離子包括多個(gè)第一代離子物質(zhì)；

(c)隔離包括相應(yīng)質(zhì)荷比(m/z)比率范圍的所述第一代離子物質(zhì)的多個(gè)子集，其中每一m/z比范圍包含包括所述分析物化合物的相應(yīng)質(zhì)子化狀態(tài)的離子物質(zhì)的m/z比；

(d)通過致使所述第一代離子物質(zhì)的所述隔離的多個(gè)子集在預(yù)定持續(xù)時(shí)間中與反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)而從所述第一代離子物質(zhì)的所述隔離的多個(gè)子集產(chǎn)生多個(gè)第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)，所述反應(yīng)劑陰離子在反應(yīng)后從包括所述分析物化合物的相應(yīng)質(zhì)子化狀態(tài)的每一離子物質(zhì)提取質(zhì)子；

(e)產(chǎn)生所述第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)的質(zhì)譜；以及

(f)如果所述質(zhì)譜包括在相應(yīng)預(yù)定m/z比處的包括高于預(yù)定閾值的相應(yīng)強(qiáng)度的一或多條線，那么識(shí)別所述樣本內(nèi)的所述分析物化合物的存在，或否則識(shí)別所述樣本內(nèi)的所述分析物化合物的不存在。

實(shí)例27.根據(jù)實(shí)例26所述的方法，其進(jìn)一步包括多次重復(fù)執(zhí)行步驟(a)到(f)，其中步驟(a)的每一重復(fù)包括將來(lái)自對(duì)應(yīng)于相應(yīng)滯留時(shí)間的層析柱的溶離液引入到所述電噴射電離源中。

實(shí)例28.根據(jù)實(shí)例26所述的方法，其中所述步驟(f)進(jìn)一步包括如果所述質(zhì)譜包括在相應(yīng)預(yù)定m/z比處的包括高于預(yù)定閾值的相應(yīng)強(qiáng)度的一或多條線，那么基于所述一或多個(gè)強(qiáng)度確定所述樣本內(nèi)的所述分析物化合物的數(shù)量或濃度。

實(shí)例29.根據(jù)實(shí)例26所述的方法，其進(jìn)一步包括在形成帶正電離子的所述步驟(b)之后且在隔離所述第一代離子物質(zhì)的多個(gè)子集的所述步驟(c)之前的以下步驟：

(b1)隔離包括隨機(jī)選擇的質(zhì)荷比(m/z)比率范圍的所述第一代離子物質(zhì)的子集；

(b2)通過致使所述第一代離子物質(zhì)的所述隔離的子集與反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)而從所述第一代離子物質(zhì)的所述隔離的子集產(chǎn)生多個(gè)產(chǎn)物離子物質(zhì)，所述反應(yīng)劑陰離子在反應(yīng)后從包括所述分析物化合物的相應(yīng)質(zhì)子化狀態(tài)或者另一蛋白質(zhì)或多肽化合物的相應(yīng)質(zhì)子化狀態(tài)的每一離子物質(zhì)提取質(zhì)子；

(b3)產(chǎn)生所述產(chǎn)物離子物質(zhì)的質(zhì)譜；以及

(b4)基于所述產(chǎn)物離子的所述質(zhì)譜自動(dòng)確定在所述后續(xù)步驟(c)中將使用的所述m/z比范圍。

實(shí)例30.根據(jù)實(shí)例28所述的方法，其中所述步驟(b4)包括從所述質(zhì)譜自動(dòng)確定對(duì)應(yīng)于另一蛋白質(zhì)或多肽化合物的多質(zhì)子化離子物質(zhì)的m/z比的集合。

實(shí)例31.一種識(shí)別樣本中的微生物的存在或不存在的方法，其包括：

制作所述樣本的提取物；

重復(fù)執(zhí)行根據(jù)實(shí)例26所述的方法以便在每一執(zhí)行識(shí)別所述樣本提取物內(nèi)的不同相應(yīng)蛋白質(zhì)或多肽分析物化合物的存在或不存在；以及

如果所述樣本提取物內(nèi)每一相應(yīng)蛋白質(zhì)或多肽分析物化合物存在，那么識(shí)別所述樣本內(nèi)的所述微生物的存在，或否則識(shí)別所述樣本內(nèi)的所述微生物的不存在。

結(jié)論

如本文檔中教示的離子-離子反應(yīng)的PTR類型的使用具有若干優(yōu)點(diǎn)用于蛋白質(zhì)或多肽離子的復(fù)雜混合物的分析。通過比較圖3與圖4可容易觀測(cè)到第一顯著優(yōu)點(diǎn)是由極大地改進(jìn)的信噪比提供。即使由于PTR過程而丟失一些電荷(即，完全中和)，由于多電荷蛋白質(zhì)與單電荷陰離子的反應(yīng)也獲得顯著信噪比。此反應(yīng)的速率與電荷的乘積的平方成比例。因此，最初高度帶電分析物離子轉(zhuǎn)換為較少帶電PTR產(chǎn)物離子，其質(zhì)譜特征在顯著較大質(zhì)荷比處出現(xiàn)。相比之下，低電荷態(tài)化學(xué)背景離子在典型實(shí)驗(yàn)反應(yīng)周期期間受PTR過程影響顯著較少，原因是這些離子的反應(yīng)的低速率。此過程基本上從低質(zhì)量、低電荷態(tài)化學(xué)背景“噪聲”移除了蛋白質(zhì)和多肽的質(zhì)譜特征。舉例來(lái)說(shuō)，如圖4中所示，背景離子由在m/z≈642的“左后方”的大的單電荷峰表示。還認(rèn)為仍粘附到大蛋白質(zhì)的加成物或水分子由于由PTR反應(yīng)沉積的發(fā)熱反應(yīng)熱(至少125千卡/摩爾)而移除。此些離子變換為簡(jiǎn)單質(zhì)子化分子可進(jìn)一步增強(qiáng)信噪比特性。潛在地，經(jīng)由此方法獲得的蛋白質(zhì)識(shí)別的數(shù)目可超過利用某一形式的分離技術(shù)的當(dāng)前復(fù)雜的從上到下方法。

與根據(jù)本發(fā)明教示的方法相關(guān)聯(lián)的第二重要優(yōu)點(diǎn)是由極大地改進(jìn)的電荷態(tài)指派提供。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明人已經(jīng)以實(shí)驗(yàn)方式確定，通過采用根據(jù)本發(fā)明教示的方法可正確地指派用于個(gè)別電荷態(tài)的電荷態(tài)指派的近似75％。此改進(jìn)的辨識(shí)電荷態(tài)的能力是得自顯著改進(jìn)的信噪比。這又提供蛋白質(zhì)或多肽的分子量的較準(zhǔn)確確定。此比較適用于經(jīng)常用于實(shí)時(shí)電荷態(tài)確定的當(dāng)前Patterson-FFT電荷態(tài)算法。與根據(jù)本發(fā)明教示的方法相關(guān)聯(lián)的另一重要優(yōu)點(diǎn)是由執(zhí)行快速處理量分析的能力提供。當(dāng)與上文應(yīng)用的快速部分層析分離技術(shù)結(jié)合時(shí)，這些方法允許在一分鐘或更短的時(shí)間尺度上以高處理量方式分析樣本。

本申請(qǐng)中所包括的論述是希望充當(dāng)基本描述。盡管已經(jīng)根據(jù)所展示和描述的各種實(shí)施例描述了本發(fā)明，但所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將容易認(rèn)識(shí)到，可以存在對(duì)這些實(shí)施例的變化，并且那些變化將在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。因此，讀者應(yīng)該知道，具體的論述可以不明確地描述所有可能的實(shí)施例；很多替代方案是隱含的。因此，在不脫離如權(quán)利要求書所描述的本發(fā)明的范圍的情況下，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可做出許多修改。描述和術(shù)語(yǔ)均不希望限制本發(fā)明的范圍。本文中提到的任何專利、專利申請(qǐng)案、專利申請(qǐng)公開案或其它文獻(xiàn)在此被以引用的方式按其相應(yīng)的全部?jī)?nèi)容并入本文中，如同在本文中被充分闡明一般。