本發(fā)明涉及一種有核紅血球的分選方法，尤其涉及利用細(xì)胞的形狀信息、光學(xué)信息及基因信息，確定妊娠母體的血液中的源自胎兒的有核紅血球的有核紅血球的分選方法。

背景技術(shù)：

作為產(chǎn)前診斷，一直以來(lái)進(jìn)行通過(guò)羊膜穿刺術(shù)來(lái)查看羊水中的胎兒細(xì)胞的染色體的羊水檢查。然而，該方法中，作為重大問(wèn)題被指出存在流產(chǎn)的可能性。

另一方面，最近得知胎兒細(xì)胞在妊娠母體(以下，還簡(jiǎn)稱為“母體”)的血液中移動(dòng)，該胎兒細(xì)胞與血液一同在母體中循環(huán)。因此，若能夠利用母血以良好的再現(xiàn)性可靠地分析母血中的胎兒細(xì)胞的染色體的DNA(脫氧核糖核酸：deoxyribonucleic acid)，則能夠?qū)崿F(xiàn)流產(chǎn)可能性較低的安全的產(chǎn)前診斷。

然而，存在于母體的血液中的胎兒細(xì)胞(有核紅血球)在母血數(shù)mL(1mL＝10^-6m³)中僅存在1個(gè)左右?？煽康孬@取如此極少的胎兒細(xì)胞(有核紅血球)對(duì)利用母血進(jìn)行的產(chǎn)前診斷而言是非常重大的課題。

對(duì)這種課題，下述專利文獻(xiàn)1中，記載有對(duì)有核紅血球進(jìn)行濃縮的方法，例如利用密度梯度離心分離去除血漿成分及母親的紅血球成分的技術(shù)。并且，非專利文獻(xiàn)1、非專利文獻(xiàn)2中，記載有利用如下技術(shù)獲取母血中的作為胎兒細(xì)胞的有核紅血球的內(nèi)容，即，利用對(duì)白血球表面的蛋白質(zhì)特異地免疫反應(yīng)的抗體，通過(guò)磁力分離母親的白血球的技術(shù)(MACS法：Magnetic activated cell sorting)、利用對(duì)胎兒血紅蛋白的γ鏈特異地免疫反應(yīng)的抗體與熒光色素分離胎兒的有核紅血球的技術(shù)(FACS法：Fluorescence activated cell sorting)等。

這些方法是有助于增加血液中的源自胎兒的有核紅血球的濃度來(lái)提高獲取目標(biāo)細(xì)胞的概率的技術(shù)。然而，源自胎兒的有核紅血球的周圍仍然存在源自母體的血液細(xì)胞，因此無(wú)法可靠地在短時(shí)間內(nèi)獲取到源自胎兒的有核紅血球。

并且，公開(kāi)有利用光學(xué)信息識(shí)別細(xì)胞種類來(lái)獲取所需要的細(xì)胞的技術(shù)。例如，專利文獻(xiàn)2中記載有如下方法，即，使老鼠胎兒血紅蛋白抗體與涂布于載波片上的包含源自胎兒的有核紅血球的血液反應(yīng)，接著，使其與生物素共軛山羊抗老鼠抗體反應(yīng)，添加ALP(Alkaline Phosphatase)共軛鏈霉親和素，并添加載體藍(lán)色基質(zhì)，通過(guò)該方法從包含源自母體的有核紅血球的母體細(xì)胞分離源自胎兒的有核紅血球。專利文獻(xiàn)3中記載有利用血紅蛋白的最大吸収波長(zhǎng)附近的415nm的波長(zhǎng)的光來(lái)識(shí)別血細(xì)胞種類的裝置。專利文獻(xiàn)4中記載有進(jìn)行利用生物組織的光學(xué)性質(zhì)的生物信息分析的內(nèi)容，并記載有利用氧化血紅蛋白及還原血紅蛋白的光吸收之差來(lái)檢測(cè)組織的供氧狀態(tài)的裝置。專利文獻(xiàn)5中記載有以將血液涂布于載波片，并根據(jù)形態(tài)識(shí)別胎兒細(xì)胞，分別僅采集胎兒細(xì)胞為目的的有核細(xì)胞搜索自動(dòng)化裝置。專利文獻(xiàn)6中記載有用于分析樣品內(nèi)的生物化學(xué)物質(zhì)、微生物、細(xì)胞等的生物化學(xué)檢查裝置。

以往技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：國(guó)際公開(kāi)WO2012/023298號(hào)公報(bào)

專利文獻(xiàn)2：日本特表2002-514304號(hào)公報(bào)

專利文獻(xiàn)3：日本特開(kāi)昭58-115346號(hào)公報(bào)

專利文獻(xiàn)4：日本特開(kāi)2014-14485號(hào)公報(bào)

專利文獻(xiàn)5：日本特開(kāi)2004-248619號(hào)公報(bào)

專利文獻(xiàn)6：日本特開(kāi)2004-361158號(hào)公報(bào)

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1：Y.L.Zheng et.al.“Prenatal diagnosis from maternal blood:simultaneous immunophenotypingand FISH of fetal nucleated erythrocytes isolated by negative magnetic cell sorting”J Med.Genet.1993Dec；30(12):1051-1056

非專利文獻(xiàn)2：Y.L.Zheng et.al.“Flow sorting of fetal erythroblasts using intracytoplasmicanti-fetal haemoglobin:preliminary observations on maternal samples”P(pán)renat Diagn.1995Oct；15(10):897-905

發(fā)明的概要

發(fā)明要解決的技術(shù)課題

專利文獻(xiàn)2～5中記載的發(fā)明作為能夠分離有核紅血球的技術(shù)而有效，但是專利文獻(xiàn)2中，由于血紅蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)，因此被細(xì)胞膜與外部隔開(kāi)，無(wú)從得知源自胎兒的有核紅血球是否以高效產(chǎn)生免疫反應(yīng)。專利文獻(xiàn)3中，在溶液中分離紅血球與白血球，但未能充分進(jìn)行分離，產(chǎn)生紅血球與白血球的混入。專利文獻(xiàn)4及專利文獻(xiàn)5為利用細(xì)胞的形狀、光學(xué)信息來(lái)分離細(xì)胞的技術(shù)，但并未記載分離源自母體及源自胎兒的源自不同個(gè)體的有核紅血球的內(nèi)容。因此，仍然存在可靠地分離源自胎兒的有核紅血球的課題。并且，除了將有核紅血球分離為源自胎兒的有核紅血球的情況以外，有時(shí)還選擇白血球作為有核紅血球的候選細(xì)胞，因此需要從候選細(xì)胞分離紅血球與白血球。

本發(fā)明是鑒于這種情況而完成的，其目的在于提供一種能夠可靠地從母血分離源自胎兒的有核紅血球的有核紅血球的分選方法。

用于解決技術(shù)課題的手段

為了實(shí)現(xiàn)所述目的，本發(fā)明提供一種分選方法，其具有：候選細(xì)胞選擇工序，根據(jù)細(xì)胞的形狀選擇有核紅血球的候選細(xì)胞；白血球選擇工序，設(shè)定包含候選細(xì)胞的搜索范圍，選擇搜索范圍內(nèi)的白血球；有核紅血球確定工序，通過(guò)候選細(xì)胞與白血球之間的血紅蛋白的分光特性的比較，確定候選細(xì)胞為有核紅血球；及分選工序，通過(guò)有核紅血球確定工序之后的有核紅血球中包含的等位基因與在候選細(xì)胞選擇工序中未被選擇的白血球或在白血球選擇工序中被選擇的白血球中包含的等位基因的比較，將有核紅血球分選為源自母體的有核紅血球或者源自胎兒的有核紅血球。

根據(jù)本發(fā)明的有核紅血球的分選方法，通過(guò)選擇有核紅血球的候選細(xì)胞，將包含該有核紅血球的候選細(xì)胞的范圍設(shè)定為搜索范圍，并搜索該搜索范圍內(nèi)的白血球，進(jìn)行候選細(xì)胞與白血球的比較，由此能夠進(jìn)行候選細(xì)胞是否為有核紅血球的判斷。

以往，作為候選細(xì)胞，無(wú)法防止白血球的混入時(shí)，有時(shí)候選細(xì)胞全部為源自白血球的細(xì)胞。此時(shí)，確認(rèn)基因信息，若確認(rèn)到不存在有核紅血球尤其是源自胎兒的有核紅血球，則不得不再次從候選細(xì)胞的分選重新進(jìn)行，低效且花費(fèi)時(shí)間。

根據(jù)上述有核紅血球的分選方法，通過(guò)有核紅血球確定工序確定候選細(xì)胞為有核紅血球，候選細(xì)胞中沒(méi)有源自白血球的細(xì)胞的混入，因此能夠更快且以更低的成本更可靠地在下一工序中確定源自胎兒的有核紅血球。

并且，分選工序中，比較有核紅血球確定工序之后的有核紅血球與分選工序之前的工序中已知的白血球之間的等位基因。白血球?yàn)樵醋阅阁w的血液成分，因此能夠?qū)⒕哂信c白血球不同的等位基因的有核紅血球分選為源自胎兒的有核紅血球，并將具有與白血球大致相同的等位基因的有核紅血球分選為源自母體的有核紅血球。

為了實(shí)現(xiàn)所述目的，本發(fā)明提供一種有核紅血球的分選方法，其具有：候選細(xì)胞選擇工序，根據(jù)細(xì)胞的形狀選擇有核紅血球的候選細(xì)胞；白血球選擇工序，設(shè)定包含候選細(xì)胞的搜索范圍，選擇搜索范圍內(nèi)的白血球；有核紅血球確定工序，通過(guò)候選細(xì)胞與白血球之間的血紅蛋白的分光特性的比較，確定候選細(xì)胞為有核紅血球；及分選工序，通過(guò)確認(rèn)是否存在有核紅血球確定工序之后的有核紅血球中包含的Y染色體，將有核紅血球分選為源自母體的有核紅血球或者源自胎兒的有核紅血球。

根據(jù)本發(fā)明的有核紅血球的分選方法，選擇有核紅血球的候選細(xì)胞，將包含該有核紅血球的候選細(xì)胞的范圍設(shè)定為搜索范圍，搜索該搜索范圍內(nèi)的白血球，并進(jìn)行候選細(xì)胞與白血球的比較，由此能夠進(jìn)行候選細(xì)胞是否為有核紅血球的判斷。

并且，胎兒為男嬰時(shí)，分選工序中通過(guò)確認(rèn)在有核紅血球確定工序之后的有核紅血球中的Y染色體的存在，能夠分選為有核紅血球?yàn)樵醋蕴旱挠泻思t血球。

本發(fā)明的另一方式中，優(yōu)選搜索范圍為從候選細(xì)胞根據(jù)候選細(xì)胞的大小逐步地設(shè)定的范圍，白血球選擇工序中選擇搜索范圍內(nèi)的白血球，根據(jù)所選擇的白血球的數(shù)量擴(kuò)大搜索范圍。

該方式中規(guī)定設(shè)定搜索范圍的方法，搜索范圍能夠根據(jù)候選細(xì)胞的大小逐步地設(shè)定。逐步地設(shè)定搜索范圍，在最初設(shè)定的搜索范圍內(nèi)，當(dāng)無(wú)法選擇所希望的白血球的數(shù)量時(shí)，通過(guò)逐步地?cái)U(kuò)大搜索范圍，能夠使白血球的數(shù)量成為所希望的值。通過(guò)增加白血球的數(shù)量，能夠?qū)Π籽虻墓鈱W(xué)信息進(jìn)行平均，因此能夠?qū)Τ蔀榕c所分選的有核紅血球之間的差異的基準(zhǔn)進(jìn)行平均，從而能夠抑制偏差。

本發(fā)明的另一方式中，優(yōu)選搜索范圍從與候選細(xì)胞的距離最近的白血球依次選擇距離變遠(yuǎn)的白血球，是白血球的選擇數(shù)量成為2個(gè)以上且20個(gè)以下的范圍。

該方式規(guī)定設(shè)定搜索范圍的另一方法，搜索范圍能夠從與候選細(xì)胞的距離最近的白血球依次選擇。作為白血球的數(shù)量，為2個(gè)以上且20個(gè)以下。通過(guò)設(shè)為該范圍，能夠平均化白血球的光學(xué)信息，并且，白血球的數(shù)量越多越能夠平均化光學(xué)信息，因此優(yōu)選，但若數(shù)量變得過(guò)多，則白血球的測(cè)定花費(fèi)時(shí)間，因此更優(yōu)選設(shè)為3個(gè)以上且10個(gè)以下。

另外，“候選細(xì)胞至白血球的距離”是指候選細(xì)胞的中心與白血球的中心之間的距離或候選細(xì)胞的重心與白血球的重心之間的距離。

本發(fā)明的另一方式中，優(yōu)選分光特性為選自400～650nm的光波長(zhǎng)區(qū)域中包含的波長(zhǎng)的至少1個(gè)單色光中的吸光度。

血紅蛋白在400～650nm的光波長(zhǎng)區(qū)域中示出光吸收，因此通過(guò)使用400～650nm的光波長(zhǎng)區(qū)域中包含的波長(zhǎng)中的吸光度，當(dāng)候選細(xì)胞為有核紅血球時(shí)，能夠明確與白血球之間的吸光度的差異。因此，通過(guò)比較候選細(xì)胞與白血球，能夠進(jìn)行是否為有核紅血球的判斷。

本發(fā)明的另一方式中，優(yōu)選候選細(xì)胞選擇工序包括第1工序，所述第1工序中選擇如下細(xì)胞，即，將細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)的面積設(shè)為C，將細(xì)胞的細(xì)胞核的面積設(shè)為N時(shí)，細(xì)胞的細(xì)胞核的面積相對(duì)于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)的面積的比率滿足(1)式(還稱為式1)。

0.25＜N/C＜1.0 (1)

本發(fā)明的另一方式中，優(yōu)選候選細(xì)胞選擇工序包括第2工序，所述第2工序中選擇如下細(xì)胞，即，將細(xì)胞的細(xì)胞核的面積設(shè)為N，將與細(xì)胞的細(xì)胞核外接的圓形的直徑長(zhǎng)度或橢圓形的長(zhǎng)徑長(zhǎng)度設(shè)為L(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞核的面積相對(duì)于圓形的直徑或橢圓形的長(zhǎng)徑的長(zhǎng)度的平方的比率滿足(2)式(還稱為式2)。

0.65＜N/(L×L)＜0.785 (2)

上述方式通過(guò)候選細(xì)胞選擇工序中的細(xì)胞的形狀規(guī)定選擇候選細(xì)胞的具體條件，(1)式規(guī)定細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與核的面積比率，(2)式規(guī)定核的圓形程度。具有上述(1)式及(2)式的條件的核的細(xì)胞為紅血球的可能性較高，因此能夠提高候選細(xì)胞為有核紅血球的可能性。

發(fā)明效果

根據(jù)本發(fā)明的有核紅血球的分選方法，根據(jù)細(xì)胞的形狀選擇成為有核紅血球的候選的細(xì)胞，根據(jù)分光特性確定為紅血球之后，根據(jù)基因信息將有核紅血球分選為源自胎兒或源自母體。根據(jù)基因信息進(jìn)行分選時(shí)，能夠獲取沒(méi)有混入源自白血球的細(xì)胞的有核紅血球，因此能夠更快且以更低的成本更可靠地確定源自胎兒的有核紅血球。

附圖說(shuō)明

圖1是表示胎兒的染色體的檢查方法的步驟的流程圖。

圖2是表示確定工序的步驟的流程圖。

圖3是表示候選細(xì)胞選擇工序的步驟的流程圖。

圖4A是表示欲選擇的細(xì)胞的形狀的示意圖。

圖4B是表示欲排除的細(xì)胞的形狀的示意圖。

圖5是說(shuō)明根據(jù)白血球的數(shù)量設(shè)定搜索范圍的方法的圖。

圖6是表示根據(jù)白血球的數(shù)量設(shè)定搜索范圍的步驟的流程圖。

圖7是說(shuō)明對(duì)白血球根據(jù)候選細(xì)胞的面積設(shè)定搜索范圍的圖。

圖8是表示對(duì)白血球根據(jù)候選細(xì)胞的面積設(shè)定搜索范圍的步驟的流程圖。

圖9是表示根據(jù)光學(xué)特性進(jìn)行的有核紅血球確定工序的步驟的流程圖。

具體實(shí)施方式

以下，根據(jù)附圖，對(duì)本發(fā)明所涉及的有核紅血球的分選方法進(jìn)行說(shuō)明。另外，本說(shuō)明書(shū)中，“～”以作為下限值及上限值包含記載于其前后的數(shù)值的含義使用。

[胎兒的染色體的檢查方法]

作為本發(fā)明所涉及的有核紅血球的分選方法，利用胎兒的染色體的檢查方法進(jìn)行說(shuō)明。

圖1是表示胎兒的染色體的檢查方法的步驟的流程圖。胎兒的染色體的檢查方法具有：采集工序(步驟S12)，從妊娠母體采集母血；濃縮工序(步驟S14)，對(duì)母血中的有核紅血球進(jìn)行濃縮；確定工序(步驟S16)，從通過(guò)濃縮工序已濃縮有核紅血球的母血中，根據(jù)細(xì)胞的形狀及核的形狀、血紅蛋白的分光特性確定有核紅血球；擴(kuò)增工序(步驟S18)，至少擴(kuò)增確定工序中確定的有核紅血球的染色體的核酸；分選工序(步驟S20)，通過(guò)將通過(guò)擴(kuò)增工序擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物的等位基因與源自母體的白血球進(jìn)行比較，或通過(guò)確認(rèn)是否存在通過(guò)擴(kuò)增工序擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物的Y染色體，分選為源自母體的有核紅血球或者源自胎兒的有核紅血球；及決定工序(步驟S22)，通過(guò)所確定的擴(kuò)增產(chǎn)物的量與母體的染色體或已知沒(méi)有異常的胎兒的染色體的擴(kuò)增產(chǎn)物的量之間的比較，決定是否存在源自胎兒的染色體的數(shù)量異常。本發(fā)明的有核紅血球的分選方法包括確定工序(步驟S16)及分選工序(步驟S20)。

＜采集工序(步驟S12)＞

采集工序?yàn)椴杉鳛檠涸嚵系哪秆墓ば?。作為母血，?yōu)選不會(huì)造成侵入的妊娠母體的外周血。

母體的外周血中，除了源自母體的嗜酸性細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等白血球或無(wú)核的成熟紅血球以外，還包含源自母體的有核紅血球及源自胎兒的有核紅血球。認(rèn)為源自胎兒的有核紅血球在妊娠之后從6周左右開(kāi)始存在于母血中。進(jìn)行產(chǎn)前診斷的本實(shí)施方式中，檢查妊娠后6周左右以后的母體的外周血。

源自胎兒的有核紅血球?yàn)橥ㄟ^(guò)胎盤(pán)而存在于母體的血液中的紅血球前體。母體在妊娠期間，胎兒的紅血球有可能有核。該紅血球中存在染色體，因此能夠以侵入性較低的方法獲得源自胎兒的染色體及胎兒基因。認(rèn)為該源自胎兒的有核紅血球以在母血中的細(xì)胞的每10⁶個(gè)中存在1個(gè)的比例存在，母體的外周血中的存在概率非常小。

＜濃縮工序(步驟S14)＞

接著，通過(guò)濃縮工序，對(duì)在采集工序中采集的母血中的有核紅血球進(jìn)行濃縮。濃縮工序優(yōu)選通過(guò)密度梯度離心分離法進(jìn)行。

〔密度梯度離心分離法〕

密度梯度離心分離法為根據(jù)血液中的成分的密度之差進(jìn)行分離的方法，通過(guò)以?shī)A著所分離的成分的密度值的方式選擇第1介質(zhì)及第2介質(zhì)，能夠在離心分離之后的第1介質(zhì)與第2介質(zhì)之間的界面聚集目標(biāo)成分(本實(shí)施方式中，為源自胎兒的有核紅血球)。并且，通過(guò)采集存在于該第1介質(zhì)與第2介質(zhì)之間的界面的組分，能夠獲得已濃縮有核紅血球的血液。

具體而言，能夠通過(guò)包括如下工序的方法進(jìn)行有核紅血球的濃縮：在離心管的底部注入第1介質(zhì)的工序；冷卻收集到第1介質(zhì)的離心管的工序；在離心管內(nèi)的已冷卻的第1介質(zhì)上層疊第2介質(zhì)的工序；在離心管內(nèi)的第2介質(zhì)上層疊作為血液試料的母體的外周血的工序；對(duì)容納于離心管的第1介質(zhì)、第2介質(zhì)及血液試料施以離心分離的工序；及從離心分離之后的第1介質(zhì)與第2介質(zhì)之間的層采集包含源自胎兒的有核紅血球的組分的工序。

國(guó)際公開(kāi)WO2012/023298號(hào)公報(bào)中記載有包含胎兒的有核紅血球的母體的血液密度。根據(jù)該記載，所設(shè)想的源自胎兒的有核紅血球的密度為1.065～1.095g/mL左右，母體的血細(xì)胞的密度為，紅血球?yàn)?.070～1.120g/mL左右，嗜酸性粒細(xì)胞為1.090～1.110g/mL左右，中性粒細(xì)胞為1.075～1.100g/mL左右，嗜堿性粒細(xì)胞為1.070～1.080g/mL左右，淋巴細(xì)胞為1.060～1.080g/mL左右，單核細(xì)胞為1.060～1.070g/mL左右。關(guān)于密度數(shù)值，從以克每毫升[g/mL]表示的單位向SI單位系統(tǒng)的換算較為容易，1克每毫升[g/mL]為1000千克每立方米[kg/m³]。

關(guān)于所層疊的介質(zhì)(第1介質(zhì)及第2介質(zhì))的密度，為了分離密度為1.065～1.095g/mL左右的源自胎兒的有核紅血球與母體中的其他血細(xì)胞成分而設(shè)定。源自胎兒的有核紅血球的中心密度為1.080g/mL左右，因此制作夾著該密度的兩個(gè)不同密度的介質(zhì)并相鄰層疊，由此能夠在其界面收集所希望的源自胎兒的有核紅血球。優(yōu)選將第1介質(zhì)的密度設(shè)為1.08g/mL以上且1.10g/mL以下，第2介質(zhì)的密度設(shè)定為1.06g/mL以上且1.08g/mL以下。更優(yōu)選第1介質(zhì)的密度為1.08g/mL以上且1.09g/mL以下，第2介質(zhì)的密度為1.065g/mL以上且1.08g/mL以下。作為具體例，通過(guò)將第1介質(zhì)的密度設(shè)定為1.085g/mL，將第2介質(zhì)的密度設(shè)定為1.075g/mL，能夠從回收的所希望的組分中分離血漿成分及嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞。并且，還能夠分離紅血球、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的一部分。本發(fā)明中，只要能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的效果，則并不限制第1介質(zhì)與第2介質(zhì)，兩者可以是相同種類也可以是不同種類，但使用相同種類的介質(zhì)是優(yōu)選方式。

作為濃縮工序中使用的第1介質(zhì)及第2介質(zhì)，可使用用聚乙烯吡咯烷酮涂布的直徑15～30nm的硅酸膠體粒子分散液即Percoll(注冊(cè)商標(biāo))、富含于側(cè)鏈的由蔗糖制成的中性的親水性聚合物即基于多聚蔗糖與泛影酸鈉的溶液即Histopaque(注冊(cè)商標(biāo))等介質(zhì)。本實(shí)施方式中，能夠優(yōu)選使用Percoll(注冊(cè)商標(biāo))及Histopaque(注冊(cè)商標(biāo))。Percoll(注冊(cè)商標(biāo))市售有密度(比重)1.130的產(chǎn)品，能夠通過(guò)稀釋制備目標(biāo)密度(比重)的介質(zhì)。Histopaque(注冊(cè)商標(biāo))能夠利用市售的密度1.077的介質(zhì)與密度1.119的介質(zhì)將第1介質(zhì)及第2介質(zhì)制備為所希望的密度。

〔其他濃縮方法〕

作為對(duì)有核紅血球進(jìn)行濃縮的方法，除了上述的密度梯度離心分離法以外，還能夠利用與作為通常的白血球抗原的CD45(CD:Cluster of Differentiation)(基于CD分類的單克隆抗體的分類編號(hào))特異鍵合的抗體，利用磁力效果分離白血球，由此對(duì)有核紅血球進(jìn)行濃縮。

＜確定工序(步驟S16)＞

確定工序?yàn)閺耐ㄟ^(guò)濃縮工序已濃縮有核紅血球的母血中根據(jù)細(xì)胞的形狀選擇有核紅血球的候選細(xì)胞，并確定該候選細(xì)胞為有核紅血球的工序。

包含在濃縮工序中被濃縮的有核紅血球的外周血中，除了有核紅血球以外，還包含白血球等其他血液成分。其他血液成分能夠通過(guò)濃縮工序從母血去除，但很難完全去除。并且，單核的白血球能夠根據(jù)下述所示的(1)式、(2)式去除，但對(duì)該白血球也很難完全去除。因此，進(jìn)行了分選為有核紅血球的細(xì)胞的基因分析，但當(dāng)為源自白血球的細(xì)胞時(shí)，需要從分析用標(biāo)本的制作重新進(jìn)行，分析的效率較低。因此，通過(guò)確定工序確定為有核紅血球，由此防止這種情況，能夠高效地進(jìn)行之后的分析。

圖2是表示確定工序的步驟的流程圖。確定工序具有：候選細(xì)胞選擇工序(步驟S32)，根據(jù)細(xì)胞的形狀選擇有核紅血球的候選細(xì)胞；白血球選擇工序(步驟S34)，選擇成為在接下來(lái)的有核紅血球確定工序中將候選細(xì)胞確定為有核紅血球時(shí)的基準(zhǔn)的白血球；及有核紅血球確定工序(步驟S36)，通過(guò)候選細(xì)胞與白血球之間的分光特性的比較，確定候選細(xì)胞為有核紅血球。

確定工序利用將包含在濃縮工序中被濃縮的有核紅血球的外周血涂布于透明基板，優(yōu)選涂布于載波片上來(lái)制作的分析用標(biāo)本來(lái)進(jìn)行確定。

(根據(jù)細(xì)胞的形狀信息進(jìn)行的分選)

《候選細(xì)胞選擇工序(步驟S32)》

確定工序利用上述的分析用標(biāo)本，首先根據(jù)細(xì)胞的形狀信息(以下，還稱為“細(xì)胞的形狀”)分選成為有核紅血球的候選的有核紅血球的候選細(xì)胞。

作為根據(jù)細(xì)胞的形狀進(jìn)行的分選，能夠舉出核區(qū)域的面積相對(duì)于細(xì)胞質(zhì)的面積的比例、核的圓形程度、核區(qū)域的面積、核的明度、核的變平方式等。其中，優(yōu)選將具有滿足核區(qū)域的面積相對(duì)于細(xì)胞質(zhì)的面積的比例及核的圓形程度的條件的細(xì)胞分選為源自胎兒的有核紅血球候選。細(xì)胞質(zhì)的面積及核區(qū)域的面積為分析用標(biāo)本的觀察面中的面積。

圖3是表示確定工序中的根據(jù)細(xì)胞的形狀(核的形狀)進(jìn)行分選的候選細(xì)胞選擇工序的一例的步驟的流程圖。

根據(jù)細(xì)胞的形狀進(jìn)行的分選中，首先提取細(xì)胞(步驟S42)。利用二值化圖像判斷是否為細(xì)胞。利用規(guī)定的閾值，將利用白色光光源拍攝分析用標(biāo)本來(lái)獲得的圖像的亮度信息生成為二值化圖像，從所生成的二值化圖像提取具有點(diǎn)狀及島狀的連續(xù)區(qū)域的區(qū)域即提取被任意的閉合曲線包圍的區(qū)域作為細(xì)胞。另外，二值化的圖像可在實(shí)施Erosion·Dilation等形態(tài)學(xué)處理來(lái)調(diào)整連續(xù)區(qū)域的形狀的基礎(chǔ)上，求出大小。

接著，根據(jù)核的有無(wú)分選在步驟S42中提取的細(xì)胞(步驟S44)。核的有無(wú)根據(jù)細(xì)胞內(nèi)是否存在核(點(diǎn)狀物)來(lái)決定。對(duì)于核的有無(wú)的判斷也能夠利用二值化圖像。作為細(xì)胞而提取的區(qū)域中存在具有小于作為細(xì)胞提取的區(qū)域面積的被任意的閉合曲線包圍的區(qū)域時(shí)，能夠提取該區(qū)域作為核。

接著，提取細(xì)胞的核的大小(點(diǎn)狀及島狀的連續(xù)區(qū)域的大小)為1～5μm的細(xì)胞(步驟S46)。選擇具有1～5μm大小的核的細(xì)胞有助于分選有核紅血球。另外，“點(diǎn)狀及島狀的連續(xù)區(qū)域的大小”能夠使表示核的外形的閉合曲線近似于圓形或橢圓形，并設(shè)為近似于核的外形的圓形的直徑或近似于核的外形的橢圓形的長(zhǎng)徑。

作為近似于核的外形的圓形的例子，可舉出與表示核的外形的閉合曲線外接的圓形中直徑最小的圓形。作為近似于核的外形的橢圓形的例子，可舉出與表示核的外形的閉合曲線外接的橢圓形中長(zhǎng)徑最小的橢圓。提取近似于核的外形的圓形的直徑或近似于核的外形的橢圓形的長(zhǎng)徑為1～5μm的細(xì)胞。

接著，根據(jù)核的形狀分選細(xì)胞(步驟S48)。圖4A是表示欲選擇的細(xì)胞的形狀的示意圖，圖4B是表示欲排除的細(xì)胞的形狀的示意圖。作為根據(jù)核的形狀進(jìn)行分選的具體例，對(duì)具有根據(jù)核區(qū)域的面積相對(duì)于細(xì)胞質(zhì)的面積的比例進(jìn)行分選的第1工序及根據(jù)核的圓形程度進(jìn)行分選的第2工序的方法進(jìn)行說(shuō)明。作為第1工序，核區(qū)域的面積相對(duì)于細(xì)胞質(zhì)的面積的比例滿足下述(1)式時(shí)，細(xì)胞被選為有核紅血球的候選細(xì)胞。將細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)的面積設(shè)為C，將細(xì)胞的核的面積設(shè)為N時(shí)，具有N相對(duì)于C的比例超過(guò)0.25且小于1.0的核的細(xì)胞被選為有核紅血球的候選細(xì)胞。

0.25＜(N/C)＜1.0 (1)

并且，作為第2工序，作為滿足核的圓形程度的選擇條件的情況，可舉出滿足下述(2)式的情況。將核的直徑或核的長(zhǎng)徑設(shè)為L(zhǎng)時(shí)，具有核的面積相對(duì)于核的直徑或核的長(zhǎng)徑的平方的比例超過(guò)0.65且小于0.785的核的細(xì)胞被選為有核紅血球的候選細(xì)胞。另外，作為核的直徑或核的長(zhǎng)徑，能夠通過(guò)與在步驟S44中求出核的大小的情況相同的方法求出。

0.65＜(N/(L×L))＜0.785 (2)

根據(jù)細(xì)胞的形狀進(jìn)行的分選中，通過(guò)在基于步驟S42～步驟S46的第1工序中進(jìn)行粗篩，在基于步驟S48的第2工序中根據(jù)核的形狀進(jìn)行分選，能夠減少通過(guò)圖像處理進(jìn)行分選的候選細(xì)胞的數(shù)量，能夠有效地進(jìn)行候選細(xì)胞的分選。

根據(jù)形狀進(jìn)行的分選需要滿足步驟S42～步驟S48的所有條件。步驟S42～步驟S48的條件中，只要不滿足其中一個(gè)條件，則不會(huì)被選為候選細(xì)胞。

作為利用細(xì)胞的形狀信息分選成為源自胎兒的有核紅血球候選的有核紅血球的系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)例，可舉出安裝有光學(xué)顯微鏡、數(shù)碼相機(jī)、載玻片用載物臺(tái)、光傳輸系統(tǒng)、圖像處理PC(personal computer)、控制PC、顯示器的系統(tǒng)。光傳輸系統(tǒng)具備物鏡與CCD(Charge Coupled Device)相機(jī)，圖像處理PC可舉出具備進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、數(shù)據(jù)存儲(chǔ)的處理系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)?？刂芇C可舉出具備載玻片用載物臺(tái)的位置控制或控制整體處理的控制系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)。

(根據(jù)光學(xué)特性進(jìn)行的分選)

根據(jù)光學(xué)特性進(jìn)行的分選能夠利用源于紅血球中包含的血紅蛋白的分光特性。利用在候選細(xì)胞選擇工序中選擇的有核紅血球的候選細(xì)胞與存在于該候選細(xì)胞的周圍的白血球之間的分光特性的差異，確定候選細(xì)胞為有核紅血球。例如，通過(guò)利用涂布于玻璃基板上的血液成分，利用有核紅血球的候選細(xì)胞與存在于該候選細(xì)胞附近的白血球之間的分光特性的差異，確定候選細(xì)胞是否為有核紅血球。

有核紅血球與作為血液中的1種有核細(xì)胞的白血球的不同點(diǎn)在于有無(wú)血紅蛋白。優(yōu)選光學(xué)信息為源于血紅蛋白的信息的方式，優(yōu)選為源于選自400～650nm的光波長(zhǎng)區(qū)域中包含的波長(zhǎng)的至少1個(gè)單色光中的吸光度的差異的信息。有核紅血球由于具有血紅蛋白，因此在400～650nm的光波長(zhǎng)區(qū)域中示出較高的吸收系數(shù)。白血球由于不具有血紅蛋白，因此在這種波長(zhǎng)區(qū)域中，吸收系數(shù)變低。其中，吸收系數(shù)是表示光入射到某一介質(zhì)時(shí)，該介質(zhì)吸收多少光的常數(shù)。

光波長(zhǎng)區(qū)域進(jìn)一步優(yōu)選為400～450nm的光波長(zhǎng)區(qū)域或525～580nm的光波長(zhǎng)區(qū)域。關(guān)于這些光波長(zhǎng)區(qū)域的吸收系數(shù)，由于存在血紅蛋白，在有核紅血球中示出較高的值，因此能夠加大與白血球的細(xì)胞質(zhì)的吸收系數(shù)之間的差。由此，能夠明確有核紅血球與白血球之差，精度良好地辨別是否為有核紅血球。

并且，還能夠在各光波長(zhǎng)區(qū)域中以多個(gè)波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，并利用這些吸光度的平均值進(jìn)行有核紅血球的判別。通過(guò)根據(jù)吸光度的平均值進(jìn)行分選，能夠降低吸光度的測(cè)定值中包含的噪聲的影響。

作為根據(jù)分光特性確定為有核紅血球的方法，通過(guò)比較存在于有核紅血球的候選細(xì)胞周圍的白血球與候選細(xì)胞，決定候選細(xì)胞是否為有核紅血球。例如，對(duì)白血球，以與有核紅血球的候選細(xì)胞相同波長(zhǎng)的單色光測(cè)定吸光度，求出候選細(xì)胞的吸光度相對(duì)于白血球的吸光度之比(候選細(xì)胞的吸光度/白血球的吸光度)。候選細(xì)胞為有核紅血球時(shí)，示出較高的吸光度，因此吸光度的比變得大于“1”。并且，候選細(xì)胞為白血球時(shí)，候選細(xì)胞的吸光度變得與白血球的吸光度大致相等，因此吸光度的比接近“1”。因此，多個(gè)候選細(xì)胞中，測(cè)定吸光度的比，從數(shù)值較大的細(xì)胞對(duì)有可能是有核紅血球的可能性進(jìn)行排序來(lái)進(jìn)行基因分析，由此能夠提高進(jìn)行基因分析的候選細(xì)胞為有核紅血球的可能性。

《白血球選擇工序(步驟S34)：白血球的選擇方法》

能夠通過(guò)以下方法進(jìn)行白血球的選擇。圖5～8是說(shuō)明選擇白血球的方法的圖，圖5是說(shuō)明根據(jù)白血球的數(shù)量設(shè)定搜索范圍的方法的圖，圖6是表示根據(jù)白血球的數(shù)量設(shè)定搜索范圍的步驟的流程圖。并且，圖7是說(shuō)明根據(jù)候選細(xì)胞的面積設(shè)定搜索范圍的方法的圖，圖8是表示根據(jù)候選細(xì)胞的面積設(shè)定搜索范圍的步驟的流程圖。

{根據(jù)白血球的數(shù)量設(shè)定搜索范圍的方法}

圖5、6是根據(jù)白血球的數(shù)量設(shè)定搜索范圍的方法的說(shuō)明圖。首先，決定有核紅血球的候選細(xì)胞30(圖6的步驟S72)。如之前說(shuō)明，有核紅血球的候選細(xì)胞30能夠通過(guò)候選細(xì)胞選擇工序決定。接著，設(shè)定所搜索的白血球的數(shù)量(圖6的步驟S74)。圖5中說(shuō)明將所搜索的白血球設(shè)為5個(gè)的情況。接著，以候選細(xì)胞30為中心選擇白血球32，直至成為已設(shè)定的所搜索的白血球的數(shù)量(圖6的步驟S76)。白血球32以候選細(xì)胞30的中心至白血球32的中心為止的距離D從近到遠(yuǎn)的順序選擇。

候選細(xì)胞30的中心能夠設(shè)為使候選細(xì)胞30的平面形狀近似于圓形時(shí)的圓形的中心。同樣地，白血球32的中心能夠設(shè)為使白血球32的平面形狀近似于圓形時(shí)的圓形的中心。以下的說(shuō)明中也相同。并且，可以按候選細(xì)胞30的重心至白血球32的重心為止的距離從近到遠(yuǎn)的順序選擇白血球。

另外，圖5中，將白血球的選擇數(shù)量設(shè)為5個(gè)來(lái)進(jìn)行說(shuō)明，但是白血球的選擇數(shù)量?jī)?yōu)選為2個(gè)以上且20個(gè)以下。通過(guò)將白血球的選擇數(shù)量設(shè)為上述范圍，獲取多個(gè)白血球的光學(xué)信息并進(jìn)行平均，從而能夠均勻地決定成為與候選細(xì)胞之間的差異的基準(zhǔn)。并且，白血球的選擇數(shù)量更優(yōu)選設(shè)為3個(gè)以上且10個(gè)以下。白血球的數(shù)量越多，越能夠平均化光學(xué)信息，因此優(yōu)選，但若數(shù)量增多，則參考紅血球的測(cè)定中花費(fèi)時(shí)間，因此優(yōu)選設(shè)為上述范圍。

另外，作為所選擇的白血球32，在候選細(xì)胞選擇工序中選擇具有核但不滿足上述式(1)、(2)的細(xì)胞。血液中，作為具有核的細(xì)胞存在有核紅血球與白血球，但通過(guò)選擇不滿足式(1)、(2)的細(xì)胞，能夠提高白血球的可能性。

{根據(jù)候選細(xì)胞的面積設(shè)定搜索范圍的方法}

圖7、8是根據(jù)候選細(xì)胞的面積設(shè)定搜索范圍的方法的說(shuō)明圖。該方法中，與根據(jù)白血球的數(shù)量設(shè)定搜索范圍的方法相同，首先決定有核紅血球的候選細(xì)胞30(圖8的步驟S82)。接著，設(shè)定白血球32的搜索范圍36(圖8的步驟S84)。圖7中，通過(guò)實(shí)線圖示搜索范圍36。圖7所示的搜索范圍36設(shè)為候選細(xì)胞30的100細(xì)胞量(10×10細(xì)胞量)。

關(guān)于搜索范圍36，優(yōu)選設(shè)為以有核紅血球的候選細(xì)胞30為中心的1邊為候選細(xì)胞30的10細(xì)胞量的正方形或直徑為10細(xì)胞量的圓形。并且，優(yōu)選預(yù)先逐步地設(shè)定搜索范圍36，當(dāng)搜索范圍36內(nèi)未觀察到白血球時(shí)，逐漸擴(kuò)大搜索范圍36。例如，搜索范圍36設(shè)為一邊為候選細(xì)胞30的10細(xì)胞量的正方形或直徑為10細(xì)胞量的圓形時(shí)，未觀察到白血球32時(shí)，優(yōu)選將搜索范圍進(jìn)一步擴(kuò)大至1邊為20細(xì)胞量的正方形或直徑為20細(xì)胞量的圓形來(lái)決定白血球。

接著，搜索搜索范圍36內(nèi)的白血球32，選擇白血球(圖8的步驟S86)。選為白血球32的基準(zhǔn)以白血球32的中心或重心是否進(jìn)入到搜索范圍36內(nèi)來(lái)判斷。并且，對(duì)于在此選擇的白血球，也與根據(jù)白血球的數(shù)量設(shè)定搜索范圍時(shí)相同，將具有核但不滿足上述式(1)、(2)的細(xì)胞選為白血球32。

另外，對(duì)于白血球32的選擇數(shù)量及搜索范圍36的面積，并無(wú)特別限定，能夠任意設(shè)定。

并且，作為選擇白血球的方法，例示了圖5及圖6中圖示的根據(jù)白血球的選擇數(shù)量設(shè)定搜索范圍來(lái)選擇白血球的方法、圖7及圖8中圖示的根據(jù)候選細(xì)胞的面積設(shè)定搜索范圍來(lái)選擇白血球的方法，但并不限定于此，還能夠以組合這些的方法進(jìn)行分選。例如，預(yù)先根據(jù)候選細(xì)胞的面積決定搜索范圍，該范圍內(nèi)包含的白血球數(shù)超過(guò)預(yù)先設(shè)定的個(gè)數(shù)時(shí)，能夠測(cè)定全部，也能夠選擇預(yù)先設(shè)定的個(gè)數(shù)來(lái)進(jìn)行測(cè)定。作為選擇方法，如上述，從候選細(xì)胞與白血球的中心彼此的距離較近或重心彼此的距離較近的細(xì)胞依次選擇。并且，搜索范圍內(nèi)的白血球的數(shù)量少于預(yù)先設(shè)定的個(gè)數(shù)時(shí)，在判定出低于該個(gè)數(shù)的時(shí)點(diǎn)，擴(kuò)大搜索范圍，檢測(cè)通過(guò)擴(kuò)大而增加的面積中包含的白血球。優(yōu)選反復(fù)進(jìn)行該操作，直至獲得預(yù)先確定的個(gè)數(shù)的白血球。

《有核紅血球確定工序(步驟S36)》

圖9是表示有核紅血球確定工序的步驟的流程圖。

選擇白血球32之后，以所選擇的波長(zhǎng)對(duì)(1)有核紅血球的候選細(xì)胞30、(2)白血球32、(3)候選細(xì)胞30及白血球32的周圍34(圖5、7中以虛線表示)測(cè)定吸光度(圖9的步驟S92)。候選細(xì)胞30及白血球32的周圍34在圖5、7中為成為對(duì)象的候選細(xì)胞30及白血球32的9細(xì)胞量(3×3細(xì)胞量)的范圍。另外，候選細(xì)胞30及白血球32的周圍34內(nèi)也存在白血球，因此周圍34的吸光度的測(cè)定中，測(cè)定周圍34內(nèi)的白血球以外的區(qū)域的吸光度。

測(cè)定吸光度之后，從候選細(xì)胞30的吸光度減去候選細(xì)胞30的周圍34的吸光度，由此求出(4)候選細(xì)胞30的吸光度的真值。并且，從白血球32的吸光度減去白血球的各個(gè)周圍34的吸光度，由此求出(5)白血球的吸光度的真值(步驟S94)。

接著，求出候選細(xì)胞30的吸光度相對(duì)于白血球32的吸光度之比(步驟S96)。另外，選擇多個(gè)白血球32時(shí)，將白血球32的吸光度設(shè)為各個(gè)白血球的吸光度的平均值。白血球中由于不存在血紅蛋白，因此候選細(xì)胞30為有核紅血球時(shí)，候選細(xì)胞30的吸光度變得高于白血球32的吸光度，吸光度之比變得大于“1”。并且，候選細(xì)胞30為白血球時(shí)，候選細(xì)胞30的吸光度變得與白血球32的吸光度大致相等，從而吸光度之比示出接近“1”的數(shù)值。因此，通過(guò)求出吸光度之比，能夠辨別候選細(xì)胞30是否為有核紅血球，能夠確定是否為有核紅血球(步驟S98)。

并且，求出吸光度之比，能夠從吸光度之比大于“1”的候選細(xì)胞按有核紅血球的可能性從高到低的順序進(jìn)行排序。通過(guò)從位次較高的候選細(xì)胞30確認(rèn)基因信息，能夠高效地進(jìn)行有核紅血球的確定、基因分析。

并且，上述中，對(duì)通過(guò)求出候選細(xì)胞30的吸光度與白血球32的吸光度之間的比例(比)，從而辨別候選細(xì)胞30是否為有核紅血球的方法進(jìn)行了說(shuō)明，但還能夠通過(guò)取候選細(xì)胞30的吸光度與白血球的吸光度之間的差值來(lái)辨別有核紅血球。此時(shí)，能夠取候選細(xì)胞30的吸光度與白血球的吸光度的差值，以該數(shù)值的絕對(duì)值較大的候選細(xì)胞30為有核紅血球的可能性較高，該數(shù)值的絕對(duì)值較小的候選細(xì)胞為白血球的可能性較高的方式進(jìn)行排序。

通過(guò)以上的方法，能夠選擇候選細(xì)胞并確定該候選細(xì)胞是否為有核紅血球。

＜擴(kuò)增工序(步驟S18)＞

擴(kuò)增工序是對(duì)通過(guò)確定工序確定為有核紅血球的細(xì)胞的染色體中包含的核酸進(jìn)行擴(kuò)增的工序。并且，接下來(lái)的分選工序(步驟S20)中，通過(guò)比較等位基因，決定有核紅血球是源自胎兒的有核紅血球還是源自母體的有核紅血球時(shí)，優(yōu)選對(duì)在候選細(xì)胞選擇工序中未被選擇的白血球或在白血球選擇工序中被選擇的白血球也進(jìn)行染色體中包含的核酸的擴(kuò)增。

通過(guò)確定工序確定為有核紅血球的細(xì)胞利用顯微操縱器從標(biāo)本分離。自從標(biāo)本分離來(lái)獲取的細(xì)胞中提取DNA，進(jìn)行全基因組擴(kuò)增。全基因組擴(kuò)增能夠利用市售的套件進(jìn)行。

作為本實(shí)施方式中利用的全基因組擴(kuò)增法，利用如下基因組DNA，即，從所獲取的細(xì)胞，通過(guò)經(jīng)過(guò)作為通常方法的利用界面活性劑的細(xì)胞溶解、利用蛋白酶K等的蛋白質(zhì)分解工序而從細(xì)胞溶出來(lái)獲得。

作為全基因組擴(kuò)增試劑，能夠利用基于聚合酶連鎖反應(yīng)(PCR：polymerase chain reaction)的試劑Single cell WGA kit(New England Biolabs公司)、GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification kit(Sigma-Aldrich公司)，作為全基因組擴(kuò)增法，能夠使用MALBAC法(Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles)(記載于國(guó)際公開(kāi)WO2012/166425A2號(hào)公報(bào))。并且，同樣能夠利用基于鏈置換型DNA合成反應(yīng)的試劑GenomiPhi(GENERAL ELECTRIC COMPANY)、REPLI-g(QIAGEN公司)。本實(shí)施方式中，優(yōu)選利用Single cell WGA kit(New England Biolabs公司)。

通過(guò)全基因組擴(kuò)增獲得的DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物優(yōu)選通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)有無(wú)擴(kuò)增。進(jìn)一步優(yōu)選利用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN公司)對(duì)全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行提純。

并且，優(yōu)選利用NanoDrop(Thermo Fisher Scientific公司)、BioAnalyzer(Agilent公司)，對(duì)通過(guò)全基因組擴(kuò)增獲得的DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度進(jìn)行測(cè)定。

優(yōu)選在擴(kuò)增工序中，對(duì)從在確定工序中確定為有核紅血球的多個(gè)細(xì)胞獲取的核酸進(jìn)行擴(kuò)增。本實(shí)施方式中，預(yù)先設(shè)想產(chǎn)前診斷的適用，因此需要分選源自胎兒的有核紅血球。確定工序之后，不確定有核紅血球是源自胎兒的有核紅血球還是源自母體的有核紅血球，因此優(yōu)選對(duì)從多個(gè)有核紅血球獲取的核酸進(jìn)行擴(kuò)增，并在接下來(lái)的分選工序中進(jìn)行分選。

＜分選工序(步驟S20)＞

分選工序是將通過(guò)確定工序確定的有核紅血球分選為源自胎兒的有核紅血球與源自母體的有核紅血球的工序。

(基因分析)

〔基于等位基因的分析〕

通過(guò)擴(kuò)增工序進(jìn)行全基因組擴(kuò)增之后，決定等位基因的序列，由此能夠決定有核紅血球是源自胎兒的有核紅血球還是源自母體的有核紅血球。

對(duì)確定為有核紅血球，并通過(guò)聚合酶連鎖反應(yīng)擴(kuò)增的DNA，且成為是源自胎兒的有核紅血球還是源自母體的有核紅血球的檢查對(duì)象的染色體，通過(guò)定序器求出具有預(yù)先決定的100～150bp(base pair：基對(duì))區(qū)域的序列的DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物的量。本實(shí)施方式中，成為檢查對(duì)象的染色體優(yōu)選為13號(hào)染色體。源自胎兒的有核紅血球通常從父親及母親各繼承1組染色體，除了性染色體以外，具有各2條染色體。通過(guò)分析這些1組染色體的等位基因，確認(rèn)源自父親的基因的存在，能夠決定有核紅血球是源自胎兒的有核紅血球還是源自母體的有核紅血球。

確認(rèn)源自父親的基因的存在時(shí)，對(duì)源自母親的細(xì)胞也同時(shí)進(jìn)行基因分析，存在源自母親的細(xì)胞中不存在等位基因時(shí)，能夠確認(rèn)該等位基因?yàn)樵醋愿赣H的基因。確認(rèn)到源自父親的基因時(shí)，能夠分選為該有核紅血球?yàn)樵醋蕴旱挠泻思t血球。對(duì)于源自母親的細(xì)胞，對(duì)在候選細(xì)胞選擇工序中未被選擇的白血球或在白血球選擇工序中被選擇的存在于標(biāo)本(載波片上)的白血球進(jìn)行DNA分析。

所分析的等位基因優(yōu)選分析單核苷酸多態(tài)性(SNP(SNPs)：Single Nucleotide Polymorphism)或串聯(lián)重復(fù)序列(STR：short tandem repeat)。

胎兒的基因從父母各繼承一對(duì)基因，遺傳信息以4種堿基化學(xué)物質(zhì)的序列記錄。人體中有約30億個(gè)堿基，以1000～2000個(gè)中1個(gè)的比例，存在因人而異的序列部分，將此稱為單核苷酸多態(tài)性。如果通過(guò)分析該單核苷酸多態(tài)性，并與作為源自母體的細(xì)胞的白血球進(jìn)行比較，若能夠在有核紅血球中確認(rèn)到單核苷酸多態(tài)性的序列，則能夠分選為有核紅血球?yàn)樵醋蕴骸?/p>

DNA中，某一DNA序列成為一個(gè)單位，具有該DNA排列串聯(lián)而重復(fù)序列的區(qū)域，該重復(fù)區(qū)域?yàn)榇?lián)重復(fù)序列。胎兒從父親及母親繼承串聯(lián)重復(fù)序列，因此能夠分選為具有與源自母體的白血球不同的串聯(lián)重復(fù)序列的有核紅血球?yàn)樵醋蕴旱挠泻思t血球。

〔基于Y染色體的分析〕

胎兒為男嬰時(shí)，通過(guò)擴(kuò)增工序進(jìn)行全基因組擴(kuò)增之后，確認(rèn)是否存在Y染色體，由此能夠分選有核紅血球是源自胎兒的有核紅血球還是源自母體的有核紅血球。

Y染色體僅存在于男性，源自母體的有核紅血球中不存在。因此，胎兒為男嬰時(shí)，若能夠確認(rèn)存在Y染色體，則能夠分選為有核紅血球?yàn)樵醋蕴旱挠泻思t血球。

＜決定工序(步驟S22)＞

決定工序是比較通過(guò)分選工序分選的源自胎兒的有核紅血球的DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物的量，由此決定是否存在源自胎兒的染色體的數(shù)量異常的工序。

作為決定是否存在源自胎兒的染色體的數(shù)量異常的基準(zhǔn)(或者參考)，選擇數(shù)量異常的檢查對(duì)象染色體以外的染色體，通過(guò)定序器求出具有預(yù)先決定的100～150bp區(qū)域的序列的DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增量。作為成為基準(zhǔn)的染色體(基準(zhǔn)染色體)，從如下方式選擇：從源自胎兒的有核紅血球的染色體中選擇數(shù)量異常的檢查對(duì)象染色體以外的染色體的至少1個(gè)；或選擇存在于鑒定為源自母體的有核紅血球的細(xì)胞的染色體。本實(shí)施方式中，優(yōu)選選擇存在于鑒定為源自母體的有核紅血球的細(xì)胞的染色體。

接著，根據(jù)數(shù)量異常的檢查對(duì)象染色體的DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物的量與基準(zhǔn)染色體的DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物的量之間的比例，決定源自胎兒的染色體是否存在數(shù)量異常。若胎兒為正常狀態(tài)，則預(yù)測(cè)檢查數(shù)量異常的源自胎兒的對(duì)象染色體的DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物的量與基準(zhǔn)染色體的DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物的量大致成為1:1的量比。正常情況下為2條的染色體存在3條的三染色體性的數(shù)量異常的情況下，預(yù)測(cè)會(huì)成為1.0:1.5(或者2：3)的比。

并且，還能夠在決定工序之前，預(yù)先求出以下結(jié)果分布：求出多個(gè)從多個(gè)妊娠母體采集的、源自胎兒的染色體的DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物的量與妊娠正常胎兒時(shí)的源自母體的染色體的DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物的量的比；求出多個(gè)源自胎兒的DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物的量與妊娠三染色體胎兒的母體的源自母親的DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物的量的比，并預(yù)先在該兩個(gè)分布不會(huì)重疊的區(qū)域設(shè)定截止值，比較該截止值與DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物的量之比，決定是否存在數(shù)量異常。此時(shí)，能夠如下解釋檢查結(jié)果，即，若DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物的量之比為截止值以下，則胎兒為正常，若為截止值以上，則為三染色體的數(shù)量異常。

[實(shí)施例]

＜實(shí)施例1＞

以下舉出實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。但是，本發(fā)明并不限定于該實(shí)施例。

(采集工序[外周血液試料的獲取工序])

在7mL采血管中，作為抗凝劑添加10.5mg的EDTA(乙二胺四乙酸)的鈉鹽之后，獲得母體志愿者的知情同意之后，在采血管內(nèi)作為志愿者血獲得了外周血7mL。之后，利用生理鹽水稀釋了血液。

(濃縮工序[有核紅血球的濃縮工序])

使用Percoll液(注冊(cè)商標(biāo))，制備密度1.070g/mL與密度1.095g/mL的液體，在離心管的底部添加密度1.095g/mL的液體2ml。接著，在密度1.095g/mL的液體上，緩慢疊加密度1.070g/mL的液體2mL，以避免界面紊亂。之后，在密度1.070g/mL的介質(zhì)上，向離心管中緩慢添加上述中采集的血液的稀釋液11mL。之后，以2000rpm(轉(zhuǎn)速每分鐘)進(jìn)行20分鐘的離心分離。之后，取出離心管，利用移液管采集沉積在密度1.070g/mL與密度1.090g/mL的液體之間的組分。用一只手保持第1玻璃基板，在其一端放置如此所采集的1滴血液的組分。用另一只手拿起另一玻璃基板(第2玻璃基板)，以30度的角度使第2玻璃基板的一端與第1玻璃基板接觸，若使第2玻璃基板的接觸下表面與血液的組分接觸，則通過(guò)毛細(xì)管現(xiàn)象在被2張玻璃包圍的空間擴(kuò)散。接著，在保持角度的狀態(tài)下，使第2玻璃基板向第1玻璃基板的放置血液的區(qū)域的相反區(qū)域的方向滑動(dòng)，從而涂布于第1玻璃基板上。之后，進(jìn)行1小時(shí)以上的送風(fēng)來(lái)使其充分干燥。將該第1玻璃基板在邁格林華染色液中浸漬3分鐘，并浸漬于磷酸緩沖液中清洗之后，在姬姆薩染色液(用磷酸緩沖液稀釋來(lái)設(shè)為濃度3％)中浸漬10分鐘。之后，用純水清洗之后使其干燥。如此，制作了已染色的多張玻璃基板。

(確定工序)

＜候選細(xì)胞選擇工序[根據(jù)細(xì)胞的形狀進(jìn)行分選的工序]＞

(根據(jù)細(xì)胞的形狀進(jìn)行分選的工序)

為了從涂布于玻璃基板上的濃縮處理之后的血液，分選成為源自胎兒的有核紅血球候選的有核紅血球，準(zhǔn)備了以下:電動(dòng)二維載物臺(tái)(以下，記載為XY載物臺(tái)。)；具備物鏡、CCD相機(jī)的光學(xué)顯微鏡的測(cè)定系統(tǒng)；具備XY載物臺(tái)控制部、控制垂直方向(以下，記載為Z方向)移動(dòng)機(jī)構(gòu)的Z方向控制部的控制部；及具備圖像輸入部與圖像處理部及XY位置記錄部的控制單元部。將如上述那樣準(zhǔn)備的、涂布于玻璃基板上的血液細(xì)胞放置于XY載物臺(tái)，對(duì)焦于玻璃基板上并進(jìn)行掃描，讀入通過(guò)光學(xué)顯微鏡獲得的圖像，通過(guò)圖像分析搜索作為目標(biāo)細(xì)胞的有核紅血球。

圖像分析中，檢測(cè)滿足以下的式(1)、式(2)的條件的細(xì)胞，設(shè)定包含與分析對(duì)象的圖像正交的二軸的坐標(biāo)系，記錄將二軸中的一個(gè)設(shè)為X軸并將二軸中的另一個(gè)設(shè)為Y軸時(shí)檢測(cè)到的細(xì)胞的X方向的細(xì)胞位置及Y方向的位置。

0.25＜(N/C)＜1.0 (1)

0.65＜(N/(L×L))＜0.785 (2)

其中，C定義為進(jìn)行圖像分析的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)的面積(用于分析的圖像中的表示細(xì)胞質(zhì)的區(qū)域的面積)，N定義為進(jìn)行圖像分析的細(xì)胞的核的面積(分析圖像中的表示細(xì)胞的核的區(qū)域的面積)，L定義為進(jìn)行圖像分析的細(xì)胞的核的長(zhǎng)徑或直徑(使分析圖像中的表示細(xì)胞的核的區(qū)域近似于橢圓形時(shí)的橢圓形的長(zhǎng)徑或使分析圖像中的表示細(xì)胞的核的區(qū)域近似于圓形時(shí)的圓形的直徑)，即，定義為與呈復(fù)雜的形狀的細(xì)胞核外接的橢圓形的長(zhǎng)徑或圓形的直徑。選擇存在于滿足這些(1)、(2)的載波片基板上的成為源自胎兒的有核紅血球的候選的候選細(xì)胞。

＜白血球選擇工序、有核紅血球確定工序[根據(jù)光學(xué)特性分選有核紅血球的工序]＞

對(duì)于根據(jù)形狀信息選擇的10個(gè)候選細(xì)胞，利用顯微分光裝置進(jìn)行光學(xué)特性的分析。確定10個(gè)載波片基板上的有核紅血球的候選細(xì)胞，對(duì)其中一個(gè)有核紅血球，照射波長(zhǎng)為415nm的單色光，測(cè)定吸光度1。接著，對(duì)位于該候選細(xì)胞的附近位置且核的形狀不滿足上述式(2)的白血球，按與該候選細(xì)胞的距離從近到遠(yuǎn)的順序選擇5個(gè)白血球，同樣地對(duì)每個(gè)白血球照射波長(zhǎng)為415nm的單色光，測(cè)定吸光度，求出其平均作為吸光度2。

通過(guò)相同的方法，對(duì)玻璃基板上的候選細(xì)胞中的剩余9個(gè)細(xì)胞也同樣測(cè)定吸光度1，對(duì)位于各個(gè)候選細(xì)胞的附近位置的5個(gè)白血球測(cè)定吸光度，計(jì)算其平均值作為吸光度2。

根據(jù)該計(jì)算結(jié)果，求出吸光度1相對(duì)于吸光度2之比(吸光度1/吸光度2)，提取吸光度之比為1以上的細(xì)胞，其結(jié)果檢測(cè)出明顯為1以上的6個(gè)細(xì)胞。白血球中由于不存在血紅蛋白，因此候選細(xì)胞為紅血球時(shí)，通過(guò)求出吸光度之比，數(shù)值變高。因此，能夠求出吸光度之比，將值明顯為1以上的候選細(xì)胞確定為有核紅血球。

(細(xì)胞分離工序)

使用顯微操縱器回收上述工序中檢測(cè)到的吸光度之比成為1以上的6個(gè)細(xì)胞。

(擴(kuò)增工序[DNA擴(kuò)增工序])

對(duì)使用顯微操縱器回收的6個(gè)細(xì)胞，利用New England Biolabs公司制造的Single Cell WGA kit進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，根據(jù)說(shuō)明書(shū)的記載，將細(xì)胞中的微量DNA擴(kuò)增為約100萬(wàn)倍。

(分選工序[源自母體或源自胎兒的確定工序])

對(duì)從各細(xì)胞擴(kuò)增的全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行平分，利用其中一部分，利用ILLUMINA公司制造的基因組分析儀Miseq比較13號(hào)染色體的C1QTNF9B基因區(qū)域、PCDH9基因區(qū)域、BRCA2基因區(qū)域、MTRF1基因區(qū)域的SNP(SNP ID：rs3751355、rs1799955、rs2297555、rs9571740)，由此確認(rèn)了6個(gè)細(xì)胞中有1個(gè)細(xì)胞具有不同的SNP信息。另外，用顯微操縱器回收在白血球選擇工序中選擇的細(xì)胞，與確定為有核紅血球的6個(gè)細(xì)胞同樣地?cái)U(kuò)增DNA并調(diào)查了SNP，其結(jié)果確認(rèn)到與5個(gè)細(xì)胞的SNP一致。通過(guò)以上，確認(rèn)到確定為有核紅血球的6個(gè)細(xì)胞中，1個(gè)細(xì)胞為源自胎兒的有核紅血球，5個(gè)細(xì)胞為源自母體的有核紅血球。

＜實(shí)施例2＞

從與在實(shí)施例1中采集的母體不同的母體采集外周血，與實(shí)施例1同樣地在有核紅血球分選工序中回收5個(gè)細(xì)胞，同樣進(jìn)行至擴(kuò)增工序[DNA擴(kuò)增工序]。之后，將從各細(xì)胞擴(kuò)增的全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行平分，利用其中一半進(jìn)行分選工序。

(分選工序)

利用在Y染色體的sex-determining factor(SRY)基因區(qū)域制作的PCR引物，利用Takara Bio Inc.制造的Multiplex PCR Assay Kit進(jìn)行PCR，通過(guò)通常的瓊脂糖凝膠電泳法確認(rèn)有無(wú)Y染色體的PCR擴(kuò)增物，其結(jié)果針對(duì)1個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到了源自Y染色體的信息。確認(rèn)到該細(xì)胞源自胎兒，而且是男嬰。其他4個(gè)細(xì)胞中未觀察到源自Y染色體的信息，認(rèn)為是源自母體的有核紅血球。

符號(hào)說(shuō)明

30-候選細(xì)胞，32-白血球，34-周圍，36-搜索范圍。