本發(fā)明涉及改變與TRPA1、TRPV1或TRPA1V1受體活性相關(guān)聯(lián)的感知的化合物、組合物和方法。本發(fā)明還涉及用于識(shí)別和/或評(píng)估TRPA1、TRPV1或TRPA1V1感覺(jué)受體的激動(dòng)劑或拮抗劑的功效的方法。
背景技術(shù)：
：瞬時(shí)受體電位(TRP)錨蛋白1(TRPA1)和香草醛1(TRPV1)受體與咳嗽和傷害感受的調(diào)節(jié)聯(lián)系在一起。TRPA1和TRPV1在動(dòng)物和人類(lèi)的疼痛、溫度、炎癥和咳嗽的感覺(jué)方面具有重要的作用。TRPV1由熱溫度(高于43℃)、質(zhì)子和有毒化學(xué)品諸如辣椒堿和樹(shù)酯毒素活化。TRPA1由冷溫度(低于17℃)和多種多樣的刺激和疼痛刺激性化學(xué)品諸如丙烯醛(存在于煙中)、福爾馬林、芥子油和大蒜素(存在于洋蔥和大蒜中)以及肉桂醛(從肉桂中提取)活化。偶爾，TRPA1和/或TRPV1響應(yīng)于潛在有利的化合物，從而可能形成可阻止有益產(chǎn)品的使用的刺激、灼熱或疼痛的感覺(jué)。認(rèn)為功能性TRP通道是四聚物，其可能是同源四聚物或甚至異源四聚物。在體內(nèi)，已知TRPA1在與TRPV1相同的感覺(jué)神經(jīng)元中表達(dá)并且已經(jīng)建立了兩種受體之間的藥理學(xué)交互作用。產(chǎn)生這兩個(gè)通道之間的異源四聚物的直接交互作用已經(jīng)使用CHO細(xì)胞中兩種受體的瞬時(shí)共表達(dá)來(lái)展示。然而，刺激、灼熱和疼痛的體外模型趨于關(guān)注TRPA1或TRPV1而不是TRPA1V1。仍然需要修改與有益產(chǎn)品相關(guān)聯(lián)的令人不悅的感覺(jué)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：在一些方面，本發(fā)明涉及用于篩選用于調(diào)節(jié)TRPA1V1活性的化合物的方法。該方法可包括提供穩(wěn)定共表達(dá)TRPA1和TRPV1的細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞系可包含TRPA1同源四聚物或TRPV1同源四聚物中的至少一種以及TRPA1V1異源四聚物。所述方法可包括測(cè)量所述細(xì)胞系的基線鈣離子通道活性。所述方法可包括使細(xì)胞系暴露于測(cè)試組合物。所述方法可包括在暴露于測(cè)試化合物之后，測(cè)量細(xì)胞系的離子通道活性。在一些方面，本發(fā)明涉及用于篩選用于調(diào)節(jié)TRPA1或TRPV1活性的化合物的方法。所述方法可包括提供穩(wěn)定共表達(dá)TRPA1和TRPV1的細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞系可包含TRPA1同源四聚物或TRPV1同源四聚物中的至少一種以及TRPA1V1異源四聚物。所述方法可包括測(cè)量所述細(xì)胞系的基線鈣離子通道活性。所述方法可包括使細(xì)胞系暴露于測(cè)試組合物。所述方法可包括在暴露于測(cè)試化合物之后，測(cè)量細(xì)胞系的離子通道活性。在一些方面，本發(fā)明涉及減少來(lái)自暴露于口腔護(hù)理或局部用組合物的灼熱、刺激或疼痛的感知的方法。所述方法可包括提供包含TRPA1和/或TRPV1的激動(dòng)劑的口腔護(hù)理或局部用組合物。所述方法可包括將選自下列的TRPA1V1調(diào)節(jié)劑摻入口腔護(hù)理或局部用組合物中：3-(2-呋喃)丙酸異戊酯、3-羥基辛酸乙酯、香葉醇、5-氧代癸酸、香草丙酮、N-甲基鄰氨基苯甲酸異丁酯、2-乙基丁酸、癸酸、對(duì)甲酚、惕各酸1-乙基己酯、乙基乙烯基酮、3,7-二甲基-7-辛烯-1-醇、2-糠酸辛酯、順式-3-壬烯-1-醇、胡椒堿、葡糖酸、單鉀鹽、酒石酸、反式,反式-2,4-十一碳二烯-1-醛、3,5,5-三甲基己醛、(E)-2-壬烯醛、香茅醇、5-苯基-1-戊醇、3-甲基-5-丙基-2-環(huán)己烯-1-酮、苯甲醛丙二醇縮醛、香草醛丙二醇縮醛、玫瑰醇、(E,E)-2,4-十二碳二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、2-己烯-4-酮、紅沒(méi)藥烯、10-十一烯醛、3-甲基-1-苯基-3-戊醇、以及它們的組合。所述TRPA1V1調(diào)節(jié)劑可以相對(duì)于TRPA1和/或TRPV1的活化有效減少TRPA1V1的活化的量存在。附圖說(shuō)明圖1A和圖1B示出與實(shí)施例1相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞培養(yǎng)物的外觀。圖2是示出在不同生長(zhǎng)條件下細(xì)胞的熒光的圖，如實(shí)施例1中所述。具體實(shí)施方式雖然異源四聚物受體的現(xiàn)有觀察包括TRPA1和TRPV1亞單位，但先前對(duì)研究體外潛在刺激性的努力關(guān)注于TRPA1和TRPV1受體，但不關(guān)于TRPA1V1異源四聚物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在使用TRPV1(SEQIDNO:1)和TRPA1(SEQIDNO:2)共表達(dá)細(xì)胞來(lái)研究化合物的潛在刺激性的價(jià)值，因?yàn)門(mén)RPA1V1活化不可基于TRPA1和/或TRPV1活化來(lái)預(yù)測(cè)。除了可能通過(guò)TRPA1或TRPV1活化劑下調(diào)TRPA1V1之外，在一些情況下，存在三種受體類(lèi)型中響應(yīng)的協(xié)同增加，并且另外，存在可激活TRPA1V1但不激活TRPA1或TRPV1的化合物。這對(duì)刺激性數(shù)據(jù)的實(shí)際應(yīng)用是重要的，因?yàn)閾?jù)信TRPA1V1活化是刺激性的更好的預(yù)測(cè)因子，因?yàn)門(mén)RPA1V1異源四聚物在感覺(jué)神經(jīng)中比TRPA1或TRPV1同源四聚物更普遍。TRPA1和TRPV1在許多感覺(jué)細(xì)胞中(包括在存在于整個(gè)人體外部從頭到腳的感覺(jué)細(xì)胞中，以及在呼吸道和胃腸道的黏膜中)共表達(dá)。據(jù)信TRPA1和TRPV1與由多種多樣的刺激物，包括食物、藥物、環(huán)境條件、疾病和局部治療觸發(fā)的刺激相關(guān)聯(lián)。在表達(dá)TRPA1和TRPV1兩者的許多細(xì)胞中，也觀察到TRPA1V1異源四聚物。如本文所用，“分離的化合物”是指已純化或合成使得單一化學(xué)實(shí)體占主體，排除任何溶劑的組合物。相比之下，如本文所用，“復(fù)合提取物”是指除了任何溶劑之外，還包含兩種或更多種化學(xué)實(shí)體的組合物，并且可包含數(shù)十種或數(shù)百種不同化學(xué)實(shí)體。復(fù)合提取物可通過(guò)其源材料和提取方法，而不是通過(guò)其化學(xué)組成來(lái)表征。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“激動(dòng)劑”或“活化劑”是指激活感覺(jué)受體的組合物。感覺(jué)受體TRPA1、TRPV1和TRPA1V1的活化可通過(guò)如實(shí)施例1中所述的鈣通量來(lái)測(cè)量，或適宜的可供選擇的方法，其包括但不限于，測(cè)量膜電位變化、細(xì)胞鈣成像、電生理方法、或用于觀察離子通道的活化的其它方法。激動(dòng)劑或活化劑產(chǎn)生比生理相關(guān)基線多至少20％，優(yōu)選地至少25％的受體活性。示例性基線描述于實(shí)施例1中。相比之下，“拮抗劑”是指降低感覺(jué)受體的活性的組合物。拮抗劑產(chǎn)生比生理相關(guān)基線少至少20％，優(yōu)選地至少25％的受體活性。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)劑”是指可通過(guò)相對(duì)于對(duì)照條件增加或降低感覺(jué)受體的活性來(lái)改變感覺(jué)受體的活性的組合物。除非另外指明，下文中所用的所有百分比和比率均按總組合物的重量計(jì)。除非另外指明，本文提及的成分的所有百分比、比例和含量均基于該成分的實(shí)際含量，并且不包括在可商購(gòu)獲得的產(chǎn)品中可與這些成分一起使用的溶劑、填料或其它物質(zhì)。除非另外指明，本文所涉及的所有測(cè)量均在25℃下進(jìn)行。如本文所用，字詞“或”在用作兩個(gè)或更多個(gè)元素的連詞時(shí)，是指包括單獨(dú)的所述元素或所述元素的組合；例如X或Y是指X或Y或二者。所謂“個(gè)人護(hù)理組合物”是指在常規(guī)使用過(guò)程中被施用至身體表面或與身體表面接觸以提供有益效果的產(chǎn)品。身體表面包括皮膚，例如表皮或粘膜；身體表面還包括與身體表面相關(guān)聯(lián)的結(jié)構(gòu)，例如毛發(fā)、牙齒、或指/趾甲。個(gè)人護(hù)理組合物的示例包括被施用于人體以改善外觀、清潔、和氣味控制或整體美觀的產(chǎn)品。個(gè)人護(hù)理組合物的非限制性示例包括毛發(fā)著色組合物、口腔護(hù)理組合物、剃須后凝膠和霜膏、剃須前制劑、剃刮凝膠、霜膏或泡沫、保濕劑和洗劑、咳嗽和感冒組合物、免洗型皮膚洗劑和霜膏、洗發(fā)劑、調(diào)理劑、沐浴凝膠、條皂、盥洗室條皂、止汗劑、除臭劑、脫毛劑、口紅、粉底、睫毛膏、防曬美黑霜和防曬乳液。如本文所用，所謂“口腔護(hù)理組合物”是指在一般使用過(guò)程中不是被故意吞咽以用于特定治療劑的全身給藥的目的，而是在口腔中保留足夠長(zhǎng)的時(shí)間以接觸牙齒表面或口腔組織的產(chǎn)品?？谇蛔o(hù)理組合物的示例包括潔齒劑、漱口水、摩絲、泡沫、口噴劑、錠劑、咀嚼片、口香糖、牙貼白、牙線及牙線涂層、口氣清新可溶解條帶、或義齒護(hù)理或粘合劑產(chǎn)品。所述口腔護(hù)理組合物還可摻入到條或膜上，用于直接施用或粘附到口腔表面。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“潔齒劑”包括牙齒或齦下糊劑、凝膠、或液體制劑，除非另外指明。潔齒劑組合物可以是單相組合物，或可以是兩種或更多種單獨(dú)潔齒劑組合物的組合。潔齒劑組合物可呈任何期望的形式，如深條紋的、淺條紋的、多層的、糊劑周?chē)心z的、或它們的任意組合。在包括兩種或更多種單獨(dú)潔齒劑組合物的潔齒劑中，每種潔齒劑組合物均可被包含于物理上獨(dú)立的分配器隔室中，并且并排分配。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“局部的”在涉及組合物時(shí)包括旨在施用到皮膚，包括頭皮、毛發(fā)或指/趾甲的任何組合物。示例性局部用組合物包括：洗劑；保濕劑；防曬劑；香料；有色化妝品諸如胭脂、粉底或眼影；毛發(fā)處理劑包括毛發(fā)染料，洗發(fā)劑，調(diào)理劑，質(zhì)地改性劑諸如松弛劑、卷發(fā)產(chǎn)品和增加體積或光澤的處理劑，以及造型助劑諸如發(fā)膠和噴發(fā)劑；指/趾甲油或指/趾甲增強(qiáng)劑；角質(zhì)層油；皂、洗滌劑、和沐浴乳；用于剃刮的組合物，包括剃刮凝膠或泡沫和剃刮后處理劑；爽膚水；和藥物。如本文所用，“藥物”是促進(jìn)從受傷或生病恢復(fù)的任何試劑，包括鎮(zhèn)痛藥。如本文所用，“毒性”是指在暴露包括暴露的持續(xù)時(shí)間、暴露的性質(zhì)(例如，呼吸、攝取)以及組合物或物質(zhì)的濃度的相關(guān)條件下，能夠損壞組織的組合物或物質(zhì)。如本文所用，“胃腸癥狀”是指在具有或不具有相關(guān)組織損傷的情況下不期望的胃腸事件，包括胃氣脹、痙攣、嘔吐、痢疾、過(guò)量氣體產(chǎn)生。如本文所用，“穩(wěn)定共表達(dá)”是指產(chǎn)生對(duì)TRPV1(辣椒堿或合適的替代形式)和TRPA1(異硫氰酸烯丙酯或合適的替代形式)的已知激動(dòng)劑的一致的、可再現(xiàn)的響應(yīng)的細(xì)胞系。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“刺激”、“灼熱”和“疼痛”是指不期望的感知，其對(duì)于能夠報(bào)道它們的人類(lèi)受檢者是顯著的，或可通過(guò)離子通道活化或可比的分析方法來(lái)測(cè)量。這些感覺(jué)與TRPA1和TRPV1等受體相關(guān)聯(lián)。詞語(yǔ)刺激、灼熱和疼痛可不同地由人類(lèi)受檢者使用來(lái)描述他們對(duì)已知激活TRPA1和/或TRPV1的刺激物的感知。刺激、灼熱和疼痛可與至少短期的或低濃度、安全的刺激物相關(guān)聯(lián)。例如，熱表面可形成顯著的足以觸發(fā)遠(yuǎn)離該熱表面的身體的非隨意運(yùn)動(dòng)的灼熱或疼痛的感覺(jué)，即使該表面實(shí)際上不足夠熱以由間接或非常短的接觸造成組織損傷。如果刺激具有有益效果，諸如美容或醫(yī)學(xué)有益效果，則可能期望減少或完全覆蓋與刺激物相關(guān)聯(lián)的刺激、灼熱或疼痛的感知。在一些方面，本發(fā)明涉及減少來(lái)自暴露于口腔護(hù)理或局部用組合物的灼熱、刺激或疼痛的感知的方法。所述方法可包括提供包含TRPA1和/或TRPV1的激動(dòng)劑的口腔護(hù)理或局部用組合物。所述方法可包括將TRPA1V1調(diào)節(jié)劑，具體地講減少TRPA1V1的可測(cè)量活性的調(diào)節(jié)劑摻入口腔護(hù)理或局部用組合物中。TRPA1V1調(diào)節(jié)劑可選自：3-(2-呋喃)丙酸異戊酯、3-羥基辛酸乙酯、香葉醇、5-氧代癸酸、香草丙酮、N-鄰氨基苯甲酸異丁基酯、2-乙基丁酸、癸酸、對(duì)甲酚、惕各酸1-乙基己基酯、乙基乙烯基酮、3,7-二甲基-7-辛烯-1-醇、2-糠酸辛酯、順式-3-壬烯-1-醇、胡椒堿、葡糖酸、單鉀鹽、酒石酸、反式,反式-2,4-十一碳二烯-1-醛、3,5,5-三甲基己醛、(E)-2-壬烯醛、香茅醇、5-苯基-1-戊醇、3-甲基-5-丙基-2-環(huán)己烯-1-酮、苯甲醛丙二醇縮醛、香草醛丙二醇縮醛、玫瑰醇、(E,E)-2,4-十二碳二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、2-己烯-4-酮、紅沒(méi)藥烯、10-十一烯醛、3-甲基-1-苯基-3-戊醇、以及它們的組合。所述TRPA1V1調(diào)節(jié)劑可以相對(duì)于TRPA1和/或TRPV1的活化有效減少TRPA1V1的活化的量存在于組合物中。所述TRPA1V1調(diào)節(jié)劑可以為反式,反式-2,4-十一碳二烯-1-醛。所述方法可與可攝取或不可攝取的口腔組合物一起使用。感興趣的口腔組合物可包括漱口液、食物、飲料、藥物、潔齒劑等。所述方法可與局部用組合物一起使用。示例性局部用組合物包括保濕劑；藥物；爽膚水；脫毛劑；有色化妝品；旨在處理毛發(fā)或頭皮的組合物，包括洗發(fā)劑、調(diào)理劑、毛發(fā)染料、定型助劑和/或質(zhì)地改性劑；以及它們的組合。在這些示例性組合物中的任一種中，所述TRPA1V1調(diào)節(jié)劑可以為反式,反式-2,4-十一碳二烯-1-醛。在一些方面，本發(fā)明涉及用于隔離受檢者的三叉神經(jīng)響應(yīng)的方法。所述方法可包括使受檢者暴露于不調(diào)節(jié)TRPV1或TRPA1V1的TRPA1活化劑。所述方法可包括使受檢者暴露于不調(diào)節(jié)TRPA1或TRPA1V1活性的TRPV1活化劑。所述方法可包括使受檢者暴露于不調(diào)節(jié)TRPA1或TRPV1活性的TRPA1V1活化劑。通過(guò)比較對(duì)TRPA1、TRPV1和TRPA1V1活化劑的響應(yīng)，可隔離三叉神經(jīng)響應(yīng)。通過(guò)研究已知僅特異性激活TRPA1、TRPV1和TRPA1V1受體中一種的獨(dú)立化合物的三叉神經(jīng)效應(yīng)，可隔離對(duì)那些受體中每一種的特異性三叉神經(jīng)響應(yīng)。不調(diào)節(jié)TRPV1或TRPA1V1的示例性TRPA1活化劑是對(duì)羥基苯甲酸丙酯。不調(diào)節(jié)TRPA1或TRPA1V1的適宜TRPV1活化劑包括但不限于2,4,5-三甲基-3-噁唑啉、庚醛、2-乙基呋喃、脫氧膽酸、蘋(píng)果酸、異戊酸2-甲基丁酯、以及它們的組合。正如刺激、灼熱和疼痛可與安全的刺激物相關(guān)聯(lián)，一些危險(xiǎn)的刺激物可不與刺激、灼熱或疼痛相關(guān)聯(lián)?？赡苁强捎玫牡珜?duì)攝取或用裸露的皮膚觸摸而言是危險(xiǎn)的示例性組合物包括許多家庭清潔劑、或不適用于攝取的局部用藥物。如果組合物在觸摸或攝取時(shí)是危險(xiǎn)的，則可能期望增加與觸摸或攝取該組合物相關(guān)聯(lián)的刺激、灼熱、或疼痛的感知。在一些方面，本發(fā)明涉及用于增加與局部暴露于組合物相關(guān)聯(lián)的灼熱、刺激或疼痛的感知的方法。所述方法可包括提供期望阻止組合物與皮膚或頭皮之間的接觸的組合物，并且將TRPA1V1活化劑摻入所述組合物中。TRPA1V1活化劑也可激活TRPA1或TRPV1。TRPA1V1活化劑也可激活TRPA1和TRPV1。所述組合物可以是毒性的。所述組合物可導(dǎo)致皮膚的不期望的美容變化，諸如變色。所述組合物不必要在不添加TRPA1V1活化劑的情況下提供灼熱、刺激或疼痛的顯著感知，但在一些情況下，所述組合物將引起由添加TRPA1V1活化劑加強(qiáng)的一些不適。在一些方面，本發(fā)明涉及用于增加與口服暴露于組合物相關(guān)聯(lián)的灼熱、刺激或疼痛的感知的方法。所述方法可包括提供期望阻止組合物與口、黏膜或消化道之間的接觸的組合物，并且將TRPA1V1活化劑摻入所述組合物中。TRPA1V1活化劑也可激活TRPA1或TRPV1。TRPA1V1活化劑也可激活TRPA1和TRPV1。所述組合物可以是毒性的。如果攝取，則所述組合物可引起胃腸癥狀。所述組合物不必要在不添加TRPA1V1活化劑的情況下提供灼熱、刺激或疼痛的顯著感知，但在一些情況下，所述組合物將引起由添加TRPA1V1活化劑加強(qiáng)的一些不適。在一些方面，本發(fā)明涉及包含TRPA1V1拮抗劑的組合物。所述組合物可為口腔護(hù)理或局部用組合物。所述組合物可以包含TRPA1和/或TRPV1的激動(dòng)劑。與直覺(jué)相反，TRPA1V1拮抗劑可有助于減少來(lái)自口腔護(hù)理或與組合物的局部接觸的刺激、灼熱或疼痛的感知，即使所用的特定拮抗劑是TRPA1和/或TRPV1的激動(dòng)劑。在一些方面，本發(fā)明涉及包含下調(diào)TRPV1活性的TRPA1激動(dòng)劑的組合物。在一些方面，本發(fā)明涉及包含下調(diào)TRPA1活性的TRPV1激動(dòng)劑的組合物。在一些方面，本發(fā)明涉及包含TRPA1V1激動(dòng)劑的組合物。所述組合物可為口腔護(hù)理或局部用組合物。所述組合物可以是毒性的，或可導(dǎo)致不期望的皮膚的美容變化，或可在攝取時(shí)導(dǎo)致胃腸癥狀。所述組合物可以包含TRPA1和/或TRPV1的拮抗劑。與直覺(jué)相反，TRPA1V1激動(dòng)劑可增加來(lái)自口腔護(hù)理或與組合物的局部接觸的刺激、灼熱或疼痛的感知(從而阻止長(zhǎng)期接觸或攝取)，即使所用的特定激動(dòng)劑是TRPA1和/或TRPV1的拮抗劑。在一些方面，本發(fā)明涉及包含激活TRPV1的TRPA1拮抗劑的組合物。在一些方面，本發(fā)明涉及包含激活TRPA1的TRPV1激動(dòng)劑的組合物。在一些方面，本發(fā)明涉及用于篩選用于調(diào)節(jié)TRPA1活性的化合物的方法。所述方法可包括提供穩(wěn)定共表達(dá)TRPA1、TRPV1、和/或TRPA1V1的細(xì)胞系。所述方法可包括測(cè)量所述細(xì)胞系的基線離子通道活性。所述基線離子通道活性在暴露于任何對(duì)照物質(zhì)(例如，具有可預(yù)測(cè)的效應(yīng)的已知調(diào)節(jié)劑)或測(cè)試組合物之前測(cè)量。相對(duì)于TRPA1、TRPV1和TRPA1V1，離子通道活性可測(cè)量為整個(gè)細(xì)胞膜的鈣通量。鈣通量測(cè)量的合適的替代形式包括膜電位變化的測(cè)量、細(xì)胞鈣成像、電生理方法和觀察離子通道活化的其它方法。鈣通量的測(cè)量是熟知的并且可與可商購(gòu)獲得的試劑盒，諸如實(shí)施例1中所述的試劑盒一起使用。TRPA1活性可區(qū)別于如本領(lǐng)域中所已知的TRPV1和TRPA1V1活性。例如，通過(guò)使用僅表達(dá)TRPA1或TRPV1的細(xì)胞，可篩選特異性激活TRPA1或TRPV1的化合物。所述方法可包括使細(xì)胞系暴露于測(cè)試組合物。測(cè)試組合物可以為對(duì)感興趣的受體具有未知效應(yīng)(如果有的話)的物質(zhì)?？梢?00nM至5mM，更優(yōu)選地350nM至1mM，更優(yōu)選地100μM至1mM的摩爾濃度的濃度范圍將測(cè)試組合物加入細(xì)胞培養(yǎng)物中。如果測(cè)試組合物是復(fù)合提取物或出于任何其它理由不能由摩爾濃度便利地測(cè)量，則可以0.0002％至0.008％范圍的濃度將測(cè)試組合物加入細(xì)胞培養(yǎng)物中。應(yīng)當(dāng)理解，在加入細(xì)胞培養(yǎng)物中時(shí)，測(cè)試組合物將進(jìn)一步稀釋。對(duì)懸浮于測(cè)試試劑中的細(xì)胞系的100μL等分試樣建議所提供的示例性范圍。顯著更大或更小的細(xì)胞系等分試樣可需要不同的測(cè)試組合物濃度。細(xì)胞系可與測(cè)試組合物一起培養(yǎng)。細(xì)胞系可與測(cè)試組合物一起培養(yǎng)15-60分鐘，更優(yōu)選地20-40分鐘。所述方法可包括在暴露于所述測(cè)試化合物(或與其一起培養(yǎng))之后，測(cè)量細(xì)胞系的離子通道活性。使用穩(wěn)定共表達(dá)TRPA1、TRPV1、和TRPA1V1的細(xì)胞系篩選用于調(diào)節(jié)TRPA1活性的化合物可有利于識(shí)別先前未意識(shí)到的這些受體和/或其激動(dòng)劑之間的交互作用?？赏ㄟ^(guò)使用穩(wěn)定共表達(dá)TRPA1、TRPV1、和/或TRPA1V1的細(xì)胞系篩選用于調(diào)節(jié)TRPV1或TRPA1V1活性的化合物獲得相似的有益效果?？蓪?duì)測(cè)試組合物測(cè)得的響應(yīng)與公布的、預(yù)測(cè)的或先前獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。在TRPV1-表達(dá)細(xì)胞中，對(duì)超過(guò)30℃的熱的暴露可增加TRPV1的基礎(chǔ)活性，并且還可與細(xì)胞凝結(jié)和貧細(xì)胞健康的其它信號(hào)相關(guān)聯(lián)。圖1A示出在37℃下培養(yǎng)的TRPV1-表達(dá)細(xì)胞。圖1B示出在25℃下培養(yǎng)的TRPV1-表達(dá)細(xì)胞。一些激動(dòng)劑，諸如辣椒堿還可加劇細(xì)胞在高溫下凝結(jié)的趨勢(shì)。因此，可能期望在使細(xì)胞系暴露于對(duì)照激動(dòng)劑和/或測(cè)試組合物之前，在介于22℃和30℃之間的溫度下預(yù)培養(yǎng)TRPV1-表達(dá)細(xì)胞?？稍谑辜?xì)胞系暴露于對(duì)照激動(dòng)劑和/或測(cè)試組合物之前，將細(xì)胞系在介于22℃和30℃之間預(yù)培養(yǎng)15-60分鐘，更優(yōu)選地20-40分鐘。甚至在表達(dá)兩種或更多種相關(guān)受體的細(xì)胞系中，也可使用本領(lǐng)域已知的方法區(qū)分與一個(gè)受體相關(guān)聯(lián)的離子通道活性相對(duì)于與另一個(gè)或多個(gè)受體相關(guān)聯(lián)的離子通道活性。例如，相關(guān)離子通道的活性的平行篩選可用于消除激活多種類(lèi)型的離子通道的化合物的正活化結(jié)果。另一種示例性方法是在所述特定受體的已知拮抗劑的存在下，測(cè)試顯現(xiàn)為特定受體的激動(dòng)劑的化合物，以檢查響應(yīng)的減少。關(guān)于示例性方法的更多細(xì)節(jié)包括在Zhang,Y.；Sreekrishna,K.；Lin,Y.；Huang,L.；Eickhoff,D.；Degenhardt,D.；XuT.，ModulationofTransientReceptorPotential(TRP)ChannelsbyChineseHerbalExtracts.Phytother.Res.2011，25，1666-1670中。實(shí)施例1材料異硫氰酸烯丙酯(AITC)、肉桂醛、辣椒堿、和鈣離子載體(A23187和離子霉素)得自SigmaAldrich(StLouis，MO)。所用的所有緩沖液、表達(dá)載體、抗生素、鈣染料(Fluo-3AM和Fluo-4AM)和其它試劑購(gòu)自LifeTechnologies(Carlsbad，CA)。GRAS化合物庫(kù)購(gòu)自Evotec(SanFrancisco，CA)。TRPV1、TRPA1、TRPA1V1和pcDNA3對(duì)照細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)人TRPV1(所用的序列以SEQIDNO:1示出)、人TRPA1(所用的序列以SEQIDNO:2示出)的細(xì)胞，以及共表達(dá)兩種受體(TRPA1V1)的細(xì)胞，和對(duì)照(pcDNA3)細(xì)胞已經(jīng)在前文描述。Sadofsky,L.R.；Campi,B.；Trevisani,M.；Compton,S.J.；Morice,A.H.Transientreceptorpotentialvanilloid-1-mediatedcalciumresponsesareinhibitedbythealkylamineantihistaminesdexbrompheniramineandchlorpheniramine.ExpLungRes.2008，34，681-693。Mitchell,J.E.；Campbell,A.P.；New,N.E.；Sadofsky,L.R.；Kastelik,J.A.；Mulrennan,S.A.；Compton,S.J.；Morice,A.H.，Expressionandcharacterizationoftheintracellularvanilloidreceptor(TRPV1)inbronchifrompatientswithchroniccough.ExpLungRes.2005，31，295-306。Sadofsky,L.R.；Sreekrishna,K.；Morice,A.H，CharacterisationofaHEK293celllinepermanentlyco-expressingthecoughreceptorsTransientReceptorPotentialAnkyrin1andVanilloid1(TRPA1andTRPV1).TheSixthLondonInternationalSymposiumonCough:Atranslationalapproach，London24-26，2010年6月，(Chung,K.F.；Widdicombe,J)[Abstracts/PulmonaryPharmacologyandTherapeutics2011，24，e8]。對(duì)于由GRAS化合物活化TRA1V1、TRPA1和TRPV1細(xì)胞測(cè)量細(xì)胞內(nèi)鈣TRPV1、TRPA1、TRPA1V1和pcDNA3細(xì)胞在33℃和5％CO2的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)箱中在75cm2燒瓶中的15mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基[補(bǔ)充有10％FBS(胎牛血清)，100μg/ml青霉素/鏈霉素，100μg/mlG418的高葡萄糖DMEM(Dulbecco'sModificationofEagle'sMedium)]中生長(zhǎng)3天。TRP細(xì)胞與8mLPBS(不具有鈣或鎂)分離；對(duì)于pcDNA3細(xì)胞而言，將胰蛋白酶用于釋放細(xì)胞。分離的細(xì)胞以低速旋轉(zhuǎn)(800-900rpm并持續(xù)3分鐘)以將細(xì)胞制粒。輕輕地除去PBS培養(yǎng)基，并且將細(xì)胞粒重新懸浮于1mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基中；加入溶解于5μLPluronicF-127(20％的DMSO溶液)中的12.5μgFluo-4AM鈣染料并且在室溫下在輕輕振蕩的情況下培養(yǎng)30分鐘。通過(guò)低速離心(800-900rpm并持續(xù)3min)用45mL測(cè)試緩沖液(1xHBSS，20mMHEPES)將細(xì)胞洗滌一次，并且重新懸浮于試劑儲(chǔ)存器中的11mL測(cè)試緩沖液中。將100μL(大約5×104細(xì)胞)的等分試樣分配到96孔板(BDFalcon微量分析板#353948)的每個(gè)孔中。將所述板在室溫下靜置30分鐘。在FLIPRTETRA儀(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)中在λex488nm和λem514nm下讀取所述板以記錄基線熒光，此后，以對(duì)GRAS庫(kù)中的純化合物而言1mM或100μM的最終濃度或?qū)τ谔崛∥锒?.004％的最終濃度加入20μL測(cè)試材料。使用FLIPR提供的分配器，將下列物質(zhì)加入每個(gè)孔中：就激動(dòng)劑而言，辣椒堿350nM和30μMAITC；并且就對(duì)照物而言，離子霉素10μM和單獨(dú)的緩沖液。每2秒記錄數(shù)據(jù)點(diǎn)共計(jì)10分鐘。在減去基線之后分析數(shù)據(jù)，如先前在Smart等人，CharacterizationusingFLIPRofhumanvanilloidVR1receptorpharmacology.EurJPharmacol2001，417，51–58，以及Zhang等人，ModulationofTransientReceptorPotential(TRP)ChannelsbyChineseHerbalExtracts.Phytother.Res.2011，25，1666-1670中所述。由GRAS庫(kù)化合物活化TRPA1V1、TRPA1和TRPV1細(xì)胞觀察到在數(shù)代細(xì)胞培養(yǎng)期間，在37℃下培養(yǎng)的TRPV1細(xì)胞趨于形成團(tuán)塊，并且由于TRPV1的高基礎(chǔ)活性推測(cè)是不健康的(圖1A)，然而，在25℃下生長(zhǎng)的細(xì)胞不形成團(tuán)塊并且看起來(lái)健康(圖1B)。在與在33℃或37℃下預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行比較時(shí)，在添加辣椒堿之前，在25℃下預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞30分鐘給予優(yōu)異的響應(yīng)(圖2)。在較高溫度下預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞具有成比例的較高基礎(chǔ)活性。因此，為了篩選化合物，對(duì)于所有三種細(xì)胞系，實(shí)施了33℃生長(zhǎng)溫度和25℃預(yù)培養(yǎng)條件。在GRAS化合物庫(kù)篩選中識(shí)別的激動(dòng)劑命中認(rèn)為相對(duì)于針對(duì)A1、V1或A1V1中至少任一種的基準(zhǔn)激動(dòng)劑，賦予至少20％-25％活性的化合物是激動(dòng)劑。在就純化合物而言以1mM或100μM最終劑量并且就提取物而言以0.004％或0.0004％最終濃度篩選的1620種化合物中總共識(shí)別出329種激動(dòng)劑。在這些激動(dòng)劑中，67種激活所有三種受體，并且在41種情況下，A1或V1對(duì)A1V1活性沒(méi)有明顯的效應(yīng)。由此，意味著A1激動(dòng)劑賦予類(lèi)似的A1V1響應(yīng)(表1a)。然而，在其它26種情況下，A1和/或V1影響A1V1響應(yīng)，如表1b中所示。發(fā)現(xiàn)137種化合物激活A(yù)1和A1V1，但不激活V1并且對(duì)于A1和A1V1兩者的活性具有相同或非常相似的水平(表1c)，這表明在大多數(shù)情況下V1對(duì)A1V1活性的非常小的影響或沒(méi)有影響。然而，在39種情況下，V1導(dǎo)致A1V1活性的負(fù)調(diào)節(jié)(表1d)，然而在34種情況下，V1導(dǎo)致A1V1活性的正調(diào)節(jié)(表1e)。還發(fā)現(xiàn)12種化合物激活V1和A1V1，但不激活A(yù)1，其中V1和A1V1活性相當(dāng)(表1f)，這表明在這些情況下A1不影響A1V1活性。在20種情況下，A1增強(qiáng)A1V1響應(yīng)(表1g)，然而在12種情況下，A1不利地影響A1V1響應(yīng)(表1h)。有意思的是，6種化合物僅激活V1，一種化合物僅激活A(yù)1，并且一種化合物激活A(yù)1和V1兩者但不激活A(yù)1V1(表1i)。這些結(jié)果表明，雖然在大多數(shù)情況下，A1V1響應(yīng)與A1或V1響應(yīng)相關(guān)，然而在大量情況下，A1V1的活性以化合物特異性方式通過(guò)A1或V1正地或負(fù)地進(jìn)行調(diào)節(jié)。表1：針對(duì)TRPA1、TRPA1V1和TRPV1細(xì)胞的活性的GRAS化合物庫(kù)篩選的概述。來(lái)自三種獨(dú)立分析板的活性的平均值表示為％的激動(dòng)劑值(就TRPA1而言為30μMAITC，并且就TRPV1而言為350nM辣椒堿。就TRPA1V1而言，取決于化合物是A1激動(dòng)劑還是V1激動(dòng)劑，使用30μMAITC或350nM辣椒堿。就激活A(yù)1和V1兩者的化合物而言，為歸一化使用AITC)。三份之間的變化彼此在10％內(nèi)。就純化合物而言以1mM進(jìn)行測(cè)試，并且就提取物而言以0.004％進(jìn)行測(cè)試。表1(a)：激活所有三種受體的化合物，其中V1對(duì)A1V1沒(méi)有明顯效應(yīng)。表1(b)：激活所有三種受體的化合物，其中A1和/或V1對(duì)A1V1具有效應(yīng)。表1(c)：激活A(yù)1和A1V1的化合物，其具有相似的A1和A1V1的活化水平。表1(d)：僅激活A(yù)1和A1V1的化合物，其中V1對(duì)A1V1活性具有負(fù)效應(yīng)。在A1V1活性比A1值低至少20％-25％的情況下，認(rèn)為V1具有負(fù)效應(yīng)。1mM或100μM的GRAS化合物(*)A1A1V12-乙基丁酸67.7334.875-氧代癸酸乙酯51.0228.24對(duì)甲酚60.9638.52惕各酸1-乙基己酯50.6031.87乙基乙烯基酮79.5040.61玫瑰醇116.2778.752-糠酸辛酯54.3340.60順式-3-壬烯-1-醇55.0041.22N-甲基鄰氨基苯甲酸異丁酯59.7336.71-苯基-1,2-丙二酮*100.571.42-十三碳烯醛*76.343.53-巰基-2-丁酮*68.953.34-(2-甲基-3-呋喃基硫)-5-壬酮*52.534.1(E,E)-2,4-十二碳二烯醛158.855.4苯乙酸異丙酯80.260.92-壬炔酸甲酯100.776.12-巰基丙酸酯101.554.3(E,E)-2,4-癸二烯醛142.346水楊酸乙酯4128里哪醇52.620煙酸己酯72.954.41-(2,2,6-三甲基環(huán)己-2-烯-1-基)-1-戊烯-3-酮97.369.73-戊烯-2-酮64.235乙醛，苯乙基丙基縮醛86.462.2β-石竹烯134.2103.83,7-二甲基-7-辛烯-1-醇93.770.72-己烯-4-酮5324.5紅沒(méi)藥烯(Bisabolene)7746.210-十一碳烯醛61.8283-(甲硫基)丙醛53.832.4乙酸糠醇酯12091.3氫化肉桂酸乙酯72.250.9異戊酸順式-3-己烯酯71.751.63-庚烯-2-酮8259丁酸反式-2-己烯基酯48.920苯甲酸丙酯40.725.7乙酸糠基硫醇酯75.560異丁酸苯氧基乙酯8153.9癸-1-烯-3-醇9069.5表1(e)：僅激活A(yù)1和A1V1的化合物，其中V1對(duì)A1V1活性具有正效應(yīng)。在A1V1活性比A1值高至少20％-25％的情況下，認(rèn)為V1具有正效應(yīng)。表1(f)：僅激活V1和A1V1的化合物，其中A1對(duì)A1V1活性不具有影響。1mM的GRAS化合物或就提取物而言為0.004％A1V1V1γ-十一烷酸內(nèi)酯57.864.1ε-癸內(nèi)酯(Epsilon-Decalactone)52.947.74-癸內(nèi)酯(4-Decanolide)35.840.93-庚基二氫-5-甲基呋喃-2(3H)-酮40.545.5單寧酸69.452.7γ-辛醇內(nèi)酯70.272.93-(5-甲基-2-呋喃基)丁醛91.6103.42-呋喃丙烯醛，α-苯基-66.255.7對(duì)叔丁基苯酚108.9110.5吲哚42.953.3辛酸83.473.73-乙?；?2,5-二甲基噻吩84.995.1表1(g)：僅激活V1和A1V1的化合物，其中A1對(duì)A1V1活性具有正效應(yīng)。在A1V1活性比V1值高至少20％-25％的情況下，認(rèn)為A1具有正效應(yīng)。表1(h)：僅激活V1和A1V1的化合物，其中A1對(duì)A1V1活性具有負(fù)效應(yīng)。在A1V1活性比V1值低至少20％-25％的情況下，認(rèn)為A1具有負(fù)效應(yīng)。1mM或100μM的化合物(**)A1V1V1胡椒堿57.1120.1葡糖酸，一鉀鹽14.033.0酒石酸29.655.8L-(+)-酒石酸*38.460.4苯甲醚*34.748.32,4-十二碳二烯醛*53.5199.12,4-十二碳二烯醛*53.5199.12,5-二甲基苯酚34.281.22,6-二甲基苯酚45.872.12-異丙基苯酚83.5108.2(+)-新薄荷醇44.868.83-甲基-1-苯基-3-戊醇70.5100.5表1(i)：僅激活A(yù)1、或A1和V1，但不激活A(yù)1V1的化合物。認(rèn)為小于20％-25％的值是無(wú)活性的。在數(shù)千種篩選的化合物中，在大多數(shù)情況下，由TRPA1V1細(xì)胞觀察到的響應(yīng)反映基于在僅表達(dá)TRPA1或TRPV1的細(xì)胞中觀察到的所預(yù)測(cè)的響應(yīng)。然而，在數(shù)量令人驚奇的情況下，存在TRPA1V1響應(yīng)的化合物依賴(lài)性差異，推測(cè)這是由于TRPA1和/或TRPV1調(diào)節(jié)。因?yàn)檫@些關(guān)鍵受體常常在體內(nèi)在相同感覺(jué)細(xì)胞中共表達(dá)，所以形成異源四聚物的提供TRPA和TRPV1的穩(wěn)定共表達(dá)的體外體系提供能夠識(shí)別異常情況的優(yōu)點(diǎn)，在所述異常情況中TRPA1和TRPV1研究的結(jié)果不反映TRPA1、TRPV1和TRPA1V1受體之間的可能的交互作用。在大量情況下，這些交互作用不產(chǎn)生預(yù)測(cè)的相加的結(jié)果。本文所公開(kāi)的量綱和值不應(yīng)當(dāng)被理解為嚴(yán)格限于所引用的精確值。相反，除非另外指明，否則每個(gè)這樣的量綱旨在表示所述值以及圍繞該值功能上等同的范圍。例如，公開(kāi)為“40mm”的量綱旨在表示“約40mm”。除非明確地排除或以其它方式限制，否則本文所引用的每個(gè)文檔，包括該申請(qǐng)要求其優(yōu)先權(quán)或有益效果的任何交叉引用或相關(guān)的專(zhuān)利或申請(qǐng)和任何專(zhuān)利申請(qǐng)或?qū)＠?，均全文以引用的方式并入本文。任何文獻(xiàn)的引用不是對(duì)其相對(duì)于任何本發(fā)明所公開(kāi)的或本文受權(quán)利要求書(shū)保護(hù)的現(xiàn)有技術(shù)的認(rèn)可，或不是對(duì)其單獨(dú)地或以與任何其它參考文獻(xiàn)或多個(gè)參考文獻(xiàn)的組合提出、建議或公開(kāi)了此類(lèi)發(fā)明的認(rèn)可。此外，如果此文獻(xiàn)中術(shù)語(yǔ)的任何含義或定義與以引用方式并入本文的文獻(xiàn)中相同術(shù)語(yǔ)的任何含義或定義相沖突，將以此文獻(xiàn)中賦予該術(shù)語(yǔ)的含義或定義為準(zhǔn)。雖然已經(jīng)舉例說(shuō)明和描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但是對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的是，在不脫離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的情況下可作出多個(gè)其它改變和修改。因此，本文旨在于所附權(quán)利要求中涵蓋屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些改變和修改。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3