技術領域

本公開涉及基于生物標記的免疫檢測來診斷肝癌。

相關技術的描述

肝臟疾病是人類中最常見的病癥，存在超過100種已知的形式，其中許多都是致命的。尤其，肝細胞癌(HCC)是全世界癌癥相關死亡的第5大原因并且因HCC的死亡率在上升?；加蠬CC的患者通常在后期之前是無癥狀的。因此，患者可以大大受益于早期診斷或檢測。

在臨床實踐中，目前使用幾個參數(shù)檢查肝的正常功能。其中之一是測定在肝細胞中以高濃度出現(xiàn)的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)的水平。當肝細胞由于各種因素，比如有毒物質(zhì)、病毒感染、過量飲酒和肥胖受到破壞時，AST從肝細胞中釋放進入血液。AST催化將L-天冬氨酸鹽和α酮戊二酸鹽分別轉(zhuǎn)化為草酰乙酸鹽和L-谷氨酸鹽的可逆反應，因此用于診斷和監(jiān)測肝臟疾病，尤其導致肝細胞破壞的疾病。

AST以兩種不同的同功酶存在于哺乳動物組織中，一種位于胞漿中(cAST)和另一種位于線粒體中(mAST)。雖然已經(jīng)進行了數(shù)種嘗試，但是同工酶的測定還沒有被廣泛地用于肝臟疾病的臨床診斷。這是由于吡哆醛-5-磷酸(AST的輔酶)，它對測定產(chǎn)生不利影響，導致不準確的結果。AST與肝臟疾病相關的典型用途是測定cAST和mAST的總酶活性。然而，測定結果或許不能代表組織中存在的AST的精確數(shù)量，因為它們被釋放到血液中后它們可能會在血流中被降解或修飾。

根據(jù)之前的研究，肝臟、心臟、骨骼肌、腎臟和大腦是AST的主要來源，但沒有公開關于cAST和mAST的各自分布或存在。

韓國專利公開號2002-0053113涉及定量測定血清中的酶，比如AST的免疫學方法。然而，沒有提及關于cAST和mAST的各自測定，用于用于肝臟疾病的診斷。

美國專利號7,981,627涉及監(jiān)測和診斷肝硬化的方法，包括測定受試者的血液中的AST水平。

美國專利公開號2006-0172286涉及診斷肝癌的方法，包括確定受試者的血清或血液中生物標記，比如AST的活性。

然而，他們沒有公開分別測定與肝臟疾病的診斷相關的AST的胞漿和線粒體同種型。

技術實現(xiàn)要素：

本公開涉及cAST和/或mAST用于檢測肝臟疾病的用途，因此提供了用于肝臟疾病的診斷、預后或監(jiān)測而檢測生物樣品，比如血液中cAST和/或mAST的水平的方法、試劑盒和組合物。

在本公開的一個方面中，提供了肝臟疾病的診斷、預后或監(jiān)測的試劑盒或組合物，所述試劑盒或組合物包括用于檢測生物樣品中的胞漿天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(cAST)和線粒體天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(mAST)的至少一種的水平的試劑。

本發(fā)明的試劑盒或組合物可用于分析生物樣品，包括例如全血、血漿或血清中存在的生物標記。在一個實施方式中，使用血清。

在本發(fā)明的方法、組合物或試劑盒中所使用的試劑是用于定量或定性分析的材料。在一個實施方式中，所述試劑包括用于分析的試劑，所述分析包括如蛋白質(zhì)印跡、ELISA、放射免疫測定、免疫擴散測定、免疫層析法、免疫電泳、免疫染色、免疫沉淀反應、補體結合試驗、質(zhì)譜分析或蛋白質(zhì)微陣列，但不限于此。在其他實施方式中，所述試劑是特異性識別所述cAST或mAST的單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段、適配體、親和力多聚體(Avimer(avidity multimer))受體、模擬肽、受體、配體或輔因子，但不限于此。

在其他實施方式中，本公開中所使用的抗體為保藏于韓國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為KCTC 12483BP、KCTC 12484BP和KCTC 12485BP的單克隆抗體。

本發(fā)明的試劑盒和組合物用于確定生物樣品中cAST和mAST的至少一種的存在和/或水平的各種分析中。這樣的分析包括但不限于ELISA、免疫層析法或蛋白質(zhì)微陣列。

本發(fā)明的試劑盒、組合物和方法中可能診斷、監(jiān)測和/或預后的肝臟疾病，包括肝炎、肝硬化或肝癌，但不限于此。此外還包括尚未確認為肝臟疾病，但懷疑為肝臟疾病的病情和狀況。

在本公開的其他方面中，提供了基于有需要的樣品或受試者中cAST和/或mAST的水平和/或存在來診斷、預后或監(jiān)測肝臟疾病的方法。在一個實施方式中，本發(fā)明的方法包括下述步驟：測定來自有需要的受試者的生物樣品中的cAST和mAST的至少一種的水平；比較上述步驟的水平與對照樣品的水平或預定的截止值；以及當有變化，尤其與對照的水平相比水平增加時，確定樣品或受試者具有肝臟疾病。

本發(fā)明的方法中可以使用的分析為如上所述的，包括例如蛋白質(zhì)印跡、ELISA、放射免疫測定、免疫擴散測定、免疫層析法、免疫電泳、免疫染色、免疫沉淀反應、補體結合試驗、質(zhì)譜分析或蛋白質(zhì)微陣列，但不限于此。可用本發(fā)明的方法診斷的肝臟疾病和本發(fā)明的方法可以使用的生物樣品為如上文中所公開的。

在本公開的其他方面中，提供了定量分析或檢測cAST和/或mAST的至少一種的水平的方法。在一個實施方式中，該方法包括下述步驟：提供對cAST和mAST的至少一種具有特異性的抗體；孵育抗體與來自受試者的血液；以及確定cAST和mAST的至少一種的濃度?？赏ㄟ^如上文所述的現(xiàn)有技術中已知的各種方法，包括例如使用夾心ELISA定量測定cAST和mAST的水平。

在本發(fā)明的試劑盒、組合物和方法中，可以使用的抗體是單克隆抗體。例如，抗cAST抗體是如表1中HCC1-10所公開的至少一種，和抗mAST抗體是如表1中HCM1-10所公開的至少一種。在一個實施方式中，對cAST具有特異性的抗體是表1中的HCC4或HCC5，和對mAST具有特異性的抗體是表1中的HCM4或HCM8。在其他實施方式中，所述抗體為保藏于韓國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為KCTC 12483BP、KCTC 12484BP或KCTC 12485BP的單克隆抗體。

在其他方面中，提供了于2013年09月04日保藏于韓國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為KCTC 12483BP或KCTC 12484BP，特異性識別cAST的單克隆抗體。此外還提供了于2013年09月04日保藏于韓國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為KCTC 12485BP，特異性識別mAST的單克隆抗體。本公開的抗體分別以高特異性識別它們各自的抗原cAST和mAST，并且與其他抗原無交叉反應。因此本發(fā)明的單克隆抗體可有利地用于檢測生物樣品中cAST和mAST的存在和/或水平。

有益效果

通過免疫測定cAST和mAST的濃度來診斷或檢測慢性肝炎(CH)、肝硬化(LC)和/或HCC的本發(fā)明的方法與測定酶活性的常規(guī)方法相比顯示出更高的特異性。因此，本發(fā)明的方法可有利地用于肝臟疾病的診斷、預后或監(jiān)測。

另外，本發(fā)明的方法也顯示出cAST和mAST的檢測范圍是0-400μg/l的高靈敏度。因此，與基于生化分析的常規(guī)方法相比，本發(fā)明方法可有利地用于檢測血清中甚至少量的cAST和/或mAST。本發(fā)明的針對cAST或mAST的抗體它們之間沒有交叉反應，并且因此可有效地用于準確的區(qū)分以及因此可有效地用于準確和分別測定cAST和mAST。

與測定AST的總量的常規(guī)方法相比，本發(fā)明的方法通過分別測定cAST和mAST可以更有效地用于診斷肝臟疾病。

附圖說明

結合附圖，從實施方式的以下描述，本發(fā)明的這些方面和/或其他方面以及優(yōu)點變得顯而易見且更容易理解，其中：

圖1是本發(fā)明所制備的純化的重組cAST和mAST的12％的SDS-PAGE(A和C)和蛋白質(zhì)印跡分析(B和D)的結果，其中通過添加IPTG誘導具有6個組氨酸標簽的重組蛋白，使用鼠抗his標簽IgG抗體進行蛋白質(zhì)印跡。凝膠中，泳道1：未誘導；泳道2：誘導；泳道3：誘導后純化的。

圖2是分析抗cAST和抗mAST之間的交叉反應性的結果。(A)是ELISA結果，其中板用抗原cAST和mAST包被，并且抗mAST(HCM4)和抗cAST(HCC4)用作初級抗體：1：cAST包被；2：mAST包被。(B)蛋白質(zhì)印跡分析結果，其中，a：SDS-PAGE；b：初級抗體HCC4；C：初級抗體HCM4。在凝膠中，泳道1：cAST；泳道2：mAST。結果表明，抗cAST和抗mAST之間沒有交叉反應性。

圖3是cAST和MAST的肽譜的結果，其中，純化的重組cAST和mAST蛋白用蛋白酶消化，通過蛋白質(zhì)印跡法驗證根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體是否識別相同的表位。在該圖中，A表示cAST結果，其中泳道1至10分別表示用作初級抗體的HCC1到HCC10。B表示mAST的結果，其中泳道1至10分別表示用作初級抗體的HCM1到HCM10。

圖4是分析cAST和mAST在HepG2細胞中表達的結果。對HepG2的整個溶胞產(chǎn)物(泳道1)、上清液(泳道2)和沉淀顆粒(泳道3)的進行蛋白質(zhì)印跡。(A)是SDS-PAGE的結果。(B)是使用HCC4作為初級抗體的cAST的蛋白質(zhì)印跡分析的結果。(C)是使用HCM4作為初級抗體的mAST的蛋白質(zhì)印跡分析的結果。(D)至(I)是對HepG2細胞進行的免疫熒光測定的結果，其中HCC4(D-F)和HCM4(G-I)用作初級抗體(1μg/ml)，和FITC綴合物用作次級抗體。在(D)和(G)中，使用Alexa，并且在(E)和(H)中，使用DAPI。在(F)和(I)中是合并的圖像。

圖5是通過電泳(A和B)和蛋白質(zhì)印跡(B，D)，本發(fā)明的針對cAST和mAST的單克隆抗體與正常肝臟或肝臟疾病患者的血清中各自抗原cAST和mAST的特異性結合活性的分析結果，其中泳道表示如下：1：重組蛋白；2：來自健康患者的血清(10IU/L)；3：來自患有肝臟疾病的患者的血清(760IU/L)。

圖6是通過免疫組織化學分析肝臟細胞中cAST和mAST的表達和定位的結果。放大率：X20。

圖7是使用夾心ELISA法分析血清中的cAST和mAST的結果。A是cAST的結果，其中單克隆抗體HCC4和HCC5分別用作捕獲抗體和檢測抗體，并且cAST用作參照蛋白。用1/5正常血清(10IU/L)和4/5PBS稀釋重組蛋白cAST。使用的重組蛋白cAST的濃度為0μg/l、6.25μg/l、12.5μg/l、25μg/l、50μg/l、100μg/l、200μg/l、400μg/l。B是mAST結果，其中單克隆抗體HCM4和HCM8分別用作捕獲抗體和檢測抗體，并且重組mAST用作參照蛋白。用1/5正常血清(10IU/L)和4/5PBS稀釋重組蛋白mAST。使用的重組蛋白mAST的濃度與上述相同。曲線上的各尖峰點代表三次獨立實驗的結果。

圖8是用正常肝臟和肝臟疾病患者(慢性病毒性肝炎(CVH)、LC和HCC)的血清中的cAST的含量和酶活性獲得的ROC曲線，以比較兩種方法的特異性和靈敏度，一個方法基于cAST的含量，另一個方法基于酶活性，其中使用正常的健康樣品和來自肝臟疾病患者的樣品。在該圖中，(A)：所有合并的患者的數(shù)據(jù)；(B)：CVH；(C)：LC；和(D)：HCC。黑線：cAST的含量；和虛線：AST的酶活性。

具體實施方式

本公開基于以下發(fā)現(xiàn)：可以通過檢測血液中的胞漿天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(cAST)和線粒體天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(mAST)診斷肝臟疾病。

在一個方面中，本公開涉及cAST和mAST作為生物標記診斷肝臟疾病的用途。在本公開中，提供了用于肝臟疾病的診斷、預后或監(jiān)測的試劑盒或組合物，所述試劑盒或組合物包括以定量或定性水平檢測cAST和mAST的至少一種的試劑。

本文所用的術語“診斷”包括確定受試者的疾病或病癥的易感性或受試者是否患有特定的疾病或病癥。

本文所用的術語“預后”包括在患有特定疾病或病癥的受試者中確定，例如，疾病的預過渡或過渡狀態(tài)，如識別癌癥的階段或進展，或確定對癌癥治療的反應。

本文所用的術語“監(jiān)測”包括觀察正常受試者或懷疑患有疾病的受試者已發(fā)展疾病或治療評價(therametrics)(例如，監(jiān)測受試者的狀態(tài)以提供關于治療功效的信息)。

本公開的生物樣品是包含或預計包含/表達一種或多種本發(fā)明的生物標記的物質(zhì)或物質(zhì)的混合物，并且包括生物體特別是人的細胞、組織或體液，例如全血、尿、血漿、血清，但不限于此。此外，該樣品包括體外培養(yǎng)的細胞或組織以及直接來自生物體的細胞或組織。各種樣品可以用于根據(jù)本發(fā)明的生物標記的檢測。

在一種實施方式中，使用血液樣品。本公開的血液樣品包括從包括患者和正常人受試者的血液獲得的相似細胞的集合。此外，可在本公開中使用的血液包括新鮮的、冷凍的和/或保存的血液或它們的任何組分。本公開中還包括血清、血漿和全血。

本公開中還包括血液、細胞或組織的部分或其衍生物。當使用細胞或組織時，它們可以原樣使用或作為其溶胞產(chǎn)物使用。

本文所用的術語“肝臟疾病”是指因肝臟的全部或部分功能障礙的癥狀或病情，包括例如病毒源的急性或慢性肝炎、肝硬化、肝癌和肝細胞癌等。本公開還包括未以專用名鑒定，但可通過具有如GOP、GPT和/或γ-GTP異常值來鑒定的疾病。

本文所用的術語生物標記或診斷標志物指的是可以區(qū)分患病的組織或細胞與正常細胞或經(jīng)處理的組織或細胞的試劑，包括蛋白質(zhì)、mAST和cAST。在一個實施方式中，為了肝臟疾病的診斷、預后或監(jiān)測，檢測mAST和/或cAST的含量、濃度或水平。

本文所用的術語檢測(detection)或檢測(detecting)是指確定表達和/或表達譜中的數(shù)量、質(zhì)量和/或變化。檢測包括確定本發(fā)明標記的存在和/或不存在以及水平?？梢允褂帽绢I域中已知的方法檢測本發(fā)明的標記，并且本領域技術的人員能夠容易地選擇用于檢測的適當方法。在一個實施方式中，使用特異性識別本公開的cAST或mAST的抗體。

可為各種檢測方法使用或提供本公開的試劑盒或組合物。在一個實施方式中，ELISA、基于浸桿快速試劑盒的橫向免疫層析、微陣列或免疫測定。

根據(jù)本公開的用于診斷肝臟疾病的標記的定量和定性分析可通過本領域已知的可定量或定性檢測蛋白的多種方法來完成。例如，這些方法包括蛋白質(zhì)印跡、ELISA、放射免疫測定、免疫擴散、免疫電泳、免疫染色、免疫沉淀反應、補體結合試驗和陣列系統(tǒng)如蛋白質(zhì)陣列如抗原陣列、在溶液/懸浮液中與跟蹤抗體的結合、質(zhì)譜分析法等。這些方法是本領域中已知的，并且可參考例如Enzyme Immunoassay,E.T.Maggio，ed.，CRC Press,Boca Raton,Florida，1980；Gaastra,W.,Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)，in Methods in Molecular Biology，Vol.1，Walker，J.M.ed.，Humana Press,NJ,1984；mass spectroscopy：Petricoin等.2002.Lancet 359:572-77；eTag systems:Chan-Hui等.2004.Clinical Immunology 111:162-174；microparticle-enhanced nephelometric immunoassay:Montagne等.1992.Eur J Clin Chem Clin Biochem.30:217-22.

在一個實施方式中，使用夾心系統(tǒng)如ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)或RIA(放射免疫測定)等的免疫測定可用于本標記的定量和/或定性檢測。在該系統(tǒng)中，生物樣品與固定于固體基片/載體如玻璃、塑料(例如，聚苯乙烯)、多糖、珠子、尼龍或硝酸纖維素膜或微孔中的初級抗體反應形成復合物，然后使該復合物與通常用可直接或間接地檢測的試劑如放射性物質(zhì)像³H或¹²⁵I、熒光物質(zhì)、化學發(fā)光物質(zhì)、半抗原、生物素或毛地黃毒苷等標記的次級抗體反應。在一些情況下，標記物質(zhì)綴合在存在適當?shù)孜锏那闆r下能夠產(chǎn)生顏色或顏色變化或發(fā)光的酶，如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或馬來酸脫氫酶。

也可以使用基于免疫反應的其它方法。在其他實施方式中，可以使用可基于抗原抗體反應檢測生物標記的免疫電泳，如Ouchterlony板、蛋白質(zhì)印跡、交叉IE、火箭IE、融合火箭IE或親和IE；放射免疫測定；免疫擴散；免疫電泳；免疫染色；免疫沉淀反應；質(zhì)譜；蛋白質(zhì)微陣列或補體結合試驗。

取決于所使用的具體方法，本公開的組合物和試劑盒可以包括各種檢測試劑。例如，檢測試劑如用于確定蛋白質(zhì)的水平(濃度)和/或生物標記的存在。

在一個實施方式中，檢測試劑包括與本發(fā)明的生物標記特異性相互作用的抗體、抗體片段、底物、適配體、親和力多聚體受體或擬肽或受體或配體或輔因子。

在其他實施方式中，該檢測試劑包括用于蛋白質(zhì)印跡、ELISA、放射免疫測定、免疫擴散測定、免疫電泳、免疫組織化學、免疫沉淀反應、補體結合試驗、質(zhì)譜分析或蛋白質(zhì)微陣列系統(tǒng)的試劑。

用于本文所描述的方法的試劑或材料是本領域中已知的?？梢曰诳乖?抗體反應；或與特異性識別本發(fā)明的生物標記的底物、肽適配體、受體、配體或輔因子反應或通過質(zhì)譜法來檢測本發(fā)明的生物標記。

與本發(fā)明的生物標記特異性結合或相互作用的試劑或材料可以在基于芯片的分析中使用或與納米顆粒一起使用。

在一個實施方式中，使用采用單克隆抗體的免疫測定。單克隆抗體可以通過本領域中已知的方法來制備，例如通過融合法(Kohler和Milstein，European Journal of Immunology,6:511-519(1976))、重組DNA技術(美國專利號4,816,56)或噬菌體抗體庫法(Clackson等，Nature,352:624-628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.,222:58,1-597(1991))。用于制備抗體的一般程序可見：Harlow,E.和Lane,D.，Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,New York,1999；Zola,H.,Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques,CRC Press,Inc.,Boca Raton,Florida,1984；和Coligan,CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,Wiley/Greene,NY,1991)。例如，產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細胞的制備可通過使永生細胞系與產(chǎn)生抗體的淋巴細胞融合來進行，該制備方法是本領域中已知的，并且可以由本領域的普通技術人員毫無困難地實施。

在其他的實施方式中，免疫測定使用表1所列的針對cAST命名為HCC1至10，針對mAST命名為HCM1至10的抗體的任一種。通過將純化的cAST和mAST重組蛋白注入到balb/c小鼠，隨后通過細胞融合和篩選選擇產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細胞可制備根據(jù)本公開的抗體。表征純化的單克隆抗體并且歸類為夾心配對。優(yōu)選地，抗cAST和抗mAST抗體之間沒有交叉反應。通過使用間接ELISA表征抗體、抗體分型和/或蛋白質(zhì)印跡可選擇表1中所列的抗體之間的配對。在一個實施方式中，作為配對抗體，使用作為抗cAST單克隆抗體的HCC4或HCC5，以及作為抗mAST單克隆抗體的HCM4或HCM8，但并不限于此。

在這方面，提供了2013年9月4日以KCTC 12483BP保藏于KCTC，特異性識別cAST的單克隆抗體。

在其他方面中，提供了2013年9月4日以KCTC 12485BP保藏于KCTC，特異性識別cAST的單克隆抗體。

本發(fā)明的試劑盒和組合物可用于各種檢測方法。例如所述試劑盒或組合物可被提供或配制成ELISA試劑盒、免疫層析條試劑盒、化學發(fā)光試劑盒和試劑盒。

在一個實施方式中，本發(fā)明的方法、試劑盒和組合物用于ELISA，其中使用對本發(fā)明的生物標記特異性的抗體。本發(fā)明中使用的抗體以高親和力特異性識別本發(fā)明的生物標記，并且與其他的生物標記無交叉反應性，其包括單克隆抗體、多克隆抗體或重組抗體。此外，當ELISA用于檢測本發(fā)明的標記時，還可以利用對對照特異性的抗體。也可以使用用來檢測捕獲抗體的其他試劑，如標記的次級抗體、生色團、結合抗體的酶以及其底物或可以結合抗體的任何材料等。

在其他的實施方式中，本發(fā)明的試劑盒、組合物或方法也可以用于方法。

試劑盒，作為使用少量(10至20μl)的未經(jīng)預處理的樣品能夠同時測定最多達100種的不同種類的分析物的高通量分析方法，是具有高靈敏度(pg單位)、短分析時間的分析方法，并且可替代現(xiàn)有的ELISA或ELISPOT。分析，作為在96孔板的每個孔中能夠同時測定超過100種不同類型的生物材料的多重熒光微孔板測定法，通過使用兩種激光檢測器實時執(zhí)行信號傳輸，區(qū)分并定量超過100個不同顏色組的聚苯乙烯珠。100個珠可以構成為可區(qū)分的，使得在一側(cè)，紅色熒光珠分被成為10個不同水平的熒光強度；在另一側(cè)，橙色熒光珠被分為10個不同水平的熒光強度。此外，其之間的珠根據(jù)橙色和紅色熒光的混合比具有特定強度，從而生成100種編碼顏色的珠集合。此外，對待分析的標記具有特異性的抗體連接于每個珠上，因此通過免疫抗體反應使用這種珠可以定量生物標記。

能夠進行本公開的分析的試劑盒包括對生物標記具有特異性的抗體。所使用的抗體對每個生物標記具有高特異性和高親和力，并且針對其他生物標記幾乎沒有交叉反應性。這種抗體是單克隆抗體、多克隆抗體或重組抗體。此外，試劑盒還可以包括對對照組中的材料具有特異性的抗體。其他試劑盒還可以包括能夠檢測結合標記的抗體的試劑，例如，標記的次級抗體、生色團、酶(例如，與抗體綴合的)和其底物或其他能夠結合抗體的其他材料?？贵w可以是綴合微粒的抗體，并且進一步微?？梢灾z乳或膠體金顆粒。

在其他實施方式中，本發(fā)明的試劑盒用作快速檢驗試劑盒，包括如用于診斷或檢測的浸桿式免疫層析條。為此，試劑盒包括進行快速檢驗所需的必要要素，該快速檢驗可在5分鐘內(nèi)顯示結果。免疫層析條可以包括(a)吸收樣品的樣品墊；(b)與感興趣的樣品的生物標記發(fā)生結合反應的結合墊；(c)在其上形成包括針對生物標記的單克隆抗體的反應線和對照線的反應膜；(d)吸收殘余樣品的吸收墊；和(e)支持或支撐材料。所使用的抗體對每個生物標記具有高特異性和高親和力，并且針對其他生物標記幾乎沒有交叉反應性。這種抗體是單克隆抗體、多克隆抗體或重組抗體。另外，快速檢驗試劑盒可以包括對對照材料具有特異性的抗體。其他的快速檢驗試劑盒可以包括診斷所需要的其他材料，如能夠檢測結合的抗體的試劑，例如，固定有特異性抗體和次級抗體的硝基纖維素膜、與結合有抗體的珠相結合的膜、吸收墊和樣品墊。在一個實施方式中，使用根據(jù)本發(fā)明的抗體。

本發(fā)明的試劑盒可以用于肝臟疾病的診斷、監(jiān)測和/或預后。此外，通過確定患有肝臟疾病的患者中相應的生物標記的含量在治療后是否恢復到正常范圍內(nèi)，可能確定和監(jiān)測所使用的治療的功效。

在這方面，提供了使用本發(fā)明的試劑盒或組合物，檢測對有需要的受試者或樣品中的肝癌具有特異性的生物標記的方法，以提供關于診斷、監(jiān)測和/或預后肝臟疾病的信息。

在一個實施方式中，本發(fā)明方法包括下述步驟：確定有需要的生物樣品和來自對照樣品的cAST和/或mAST的至少一種的存在或水平；和比較來自上述步驟的結果與由對照樣品確定的相應標記的結果；以及當與對照樣品相比受試者中或樣品中的生物標記的水平或存在有變化時，診斷或確定該受試者或樣品為肝癌。

本文所用的術語“受試者”是指需要治療的任何單個個體，包括人、牛、狗、豚鼠和兔。還包括未顯示臨床癥狀并且參與臨床研究的任何受試者，或參與流行病學檢驗或用作對照的任何受試者。

在本發(fā)明的方法中，可以以定量和定性的方式分析生物標記。通過比較分析結果與來自對照的結果，本發(fā)明的方法可以有利地用于肝癌的診斷、監(jiān)測或預后，或確定肝臟疾病的階段。

根據(jù)一個實施方式，通過免疫學方法確定受試者的血清樣品中的cAST和/或mAST的水平；并且所測定的值用于肝癌的診斷、監(jiān)測和/或預后。

例如，參照對照組中確定的值可以確定對于特定的標記的截止值(在懷疑患病的樣品中的生物標記的水平增加的情況下的上限)。然后該截止值用于診斷懷疑患病的受試者，當與截止值相比值增加約50％以上，約100％以上，受試者可以診斷為患肝臟疾病。然而，該值并不限于此，取決于分析所使用得特定的試劑和/或樣品和/或方法的類型，其可以變化。因此，考慮如上所述的因素，可以確定具體的值。此外，通過確定患有肝臟疾病的患者的相應生物標記的水平在治療后是否恢復到正常范圍內(nèi)，可能確定和監(jiān)測所使用的治療的功效。

本發(fā)明的方法可以單獨使用或與常規(guī)方法組合使用。例如，對于診斷、預后或監(jiān)測或為其提供信息，除了血液分析，也可使用其他的臨床信息。其他的臨床信息包括例如患者的年齡、性別、體重、飲食習慣或體重指數(shù)；或來自超聲、計算機斷層掃描、MRI、血管造影術、內(nèi)鏡下逆行胰膽管造影、超聲內(nèi)鏡、癌癥標記或腹腔鏡的信息。

本公開基于測定血液中cAST和mAST的水平來檢測受損的肝臟。

在這個方面，本公開涉及測定生物樣品中，尤其血液中例如，全血、血清或血漿中cAST和/或mAST的濃度。

根據(jù)一個實施方式，本發(fā)明的方法包括下述步驟：提供特異性識別mAST和cAST的至少一種的單克隆抗體；有需要的受試者的血液樣品與該抗體進行反應；以及確定血液中mAST和/或cAST的含量或濃度。

方法中使用的抗體和其它試劑如上所述。

參考下述實施例，進一步更詳細地闡釋本公開。但是，這些實施例絕不應解釋為限制本發(fā)明的范圍。

實施例

材料

對于蛋白質(zhì)純化，Ni-NTA瓊脂糖購自Qiagen(德國)，6×his標簽抗體購自Takara(日本)。對于產(chǎn)生單克隆抗體，完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑購自Life Technologies(美國)。胎牛血清(FBS)和Dubellco改良的Eagle培養(yǎng)基粉末購自Invitrogen公司(美國)。對于蛋白質(zhì)印跡，ECL加蛋白質(zhì)印跡檢測系統(tǒng)購自Amersham Biosciences(瑞典)。X-Omat AR膜購自Kodak(美國)。對于同種型抗體，免疫純化單克隆抗體分型試劑盒I購自Pierce(美國)。對于酶活性，GO和GP-轉(zhuǎn)氨酶試劑盒購自Sigma diagnostics Inc(美國)。對于免疫熒光顯微鏡檢查，蓋玻片和載玻片購自Fisher Scientific(美國)。熒光封固劑購自Dako(丹麥)。

實施例1.天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的純化

1-1.天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的表達和純化

從人肝臟組織中分離人類肝臟胞漿天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(cAST)和線粒體天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(mAST)mRNA，并且通過RT-PCR由mRNA合成cDNA，然后將該產(chǎn)物克隆至TA克隆載體(Thermo Fisher Scientific，美國)中，并且然后克隆至含有6X His標簽序列的pET21a(+)載體(Novagen，美國)中。然后，在該條件下(OD值：0.5-0.7；IPTG：0.1mm；孵育時間：3小時，溫度：37℃)表達cAST和mAST重組體并通過Ni-NTA樹脂純化。通過蛋白質(zhì)印跡證實純化的蛋白質(zhì)。

人cAST基因的長度為1,245bp，編碼分子量為約45kDa的414個氨基酸。人mAST基因的長度為1,293bp，編碼分子量為約47kDa的430個氨基酸。使用抗his標簽IgG作為初級抗體通過蛋白質(zhì)印跡證實重組蛋白。結果如圖1中所示。

1-2.cAST和mAST重組蛋白的酶活性

人cAST和mAST是催化乙酸鹽和α-酮戊二酸鹽轉(zhuǎn)化為草酰乙酸鹽和谷氨酸鹽或催化逆反應的同型二聚體酶。使用試劑盒(Sigma，USA)，使用制造商的說明，檢測重組蛋白的活性。重組cAST和mAST的活性經(jīng)確定分別為1086IU/mg和843IU/mg。

實施例2.生成單克隆抗體

通過如下所述的方法，進行免疫、細胞融合和篩選雜交瘤細胞。簡言之，用純化的重組cAST或mAST注射6-8周齡的Balb/c小鼠。然后，進行細胞融合和篩選來選擇總數(shù)為20個cAST和mAST的單克隆雜交瘤細胞系。然后，將20個細胞系的細胞腹腔注入小鼠(6-8周的Balb/c)中，從小鼠中回收腹水。腹水經(jīng)純化以回收20個單克隆抗體?？筩AST抗體命名為HCC1至HCC10，抗mAST單克隆抗體命名為HCM1至HCM10。

2-1.完全和不完全Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)制備

兩袋粉狀培養(yǎng)基溶于約1700ml雙蒸水(DDW)并用DDW洗袋以確保所有的粉末溶于DDW中，然后將7.4g碳酸氫鈉添加到該溶液中。用0.5N HCl將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)到pH6.9，配制成2000ml，并在潔凈的工作臺中通過0.45μm尺寸的過濾滅菌單元進行滅菌。將450ml培養(yǎng)基、50ml胎牛血清(FBS)和5ml青霉素-鏈霉素原液添加到四個滅菌瓶中，該培養(yǎng)基是完全Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(完全DMEM)；將200ml滅菌的培養(yǎng)基添加到一個瓶中，該培養(yǎng)基稱為不完全Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(不完全DMEM)。在4℃儲存這些培養(yǎng)基。

2-2.制備和注射抗原

經(jīng)上所述純化重組cAST和mAST蛋白質(zhì)。分別用經(jīng)等體積完全弗氏佐劑乳化的0.3ml cAST和mAST(150μg)腹腔內(nèi)免疫6至8周齡的Balb/c小鼠。第一次注射之后，以2至3周的間隔強化注射相同量的經(jīng)不完全弗氏佐劑乳化的免疫原三或四次。在第三次注射后，通常從小鼠的尾部取血清，進行抗體效價測定。在細胞融合前3或4天給予無佐劑的最終強化。

2-3.制備用于融合的細胞

2-3-1制備骨髓瘤細胞

在細胞融合前四天，從液氮罐中取出冷凍的SP2/O細胞，并在37℃水浴中盡可能快地解凍，將30ml不完全DMEM添加到解凍后的細胞，然后以1500rpm離心1分鐘使細胞旋轉(zhuǎn)沉淀，然后輕輕倒出不完全DMEM，懸浮于完全DMEM中，并轉(zhuǎn)移至75ml燒瓶中，在37℃、5％CO₂恒溫箱中生長。每隔一天傳代細胞。當細胞融合完成時，將SP2/O細胞轉(zhuǎn)移到50ml無菌管中并在1500rpm離心1分鐘使細胞旋轉(zhuǎn)沉淀，輕輕倒出所有上清液，用20ml不完全DMEM使沉淀顆粒懸浮。對于每一個融合實驗，使用5×10⁷個細胞。

2-3-2制備飼養(yǎng)細胞

在細胞融合的前一天制備飼養(yǎng)細胞。在CO₂接觸湮滅后通過頸脫位法處死12至18周齡小鼠(任何小鼠品系)并用70％乙醇徹底擦拭，小心地除去其腹部皮膚。將5ml冰冷的11.6％蔗糖溶液注射到腹膜腔中，獲得約4ml所注射得溶液，并且通過在1500rpm下離心1分鐘收集腹膜細胞。將細胞懸浮于60ml的完全DMEM(添加了50X HAT)中，并且向96孔細胞培養(yǎng)板的各孔中添加2滴溶液，通常需要5個板。如果飼養(yǎng)細胞被紅細胞污染，制備新的制劑。在37℃、5％CO₂恒溫箱中培養(yǎng)飼養(yǎng)細胞。

2-3-3制備脾細胞

在CO₂暴露湮滅后通過頸脫位法處死用抗原注射的小鼠，并用70％乙醇徹底擦拭。用無菌剪刀和鑷子沿胸部到頸部的中線切割皮膚，去除脾外面的脂肪，然后將脾置于含有10ml不完全DMEM的無菌培養(yǎng)皿中。然后通過用細鑷子撕開脾使脾細胞釋放到培養(yǎng)基中，將細胞置于15ml無菌離心管中。

2-3-4細胞融合過程

將所制備得脾和SP2/O細胞懸浮液合并在一起并在1500rpm下離心1分鐘。然后通過顛倒離心管將上清液完全除去。然后通過敲擊管將細胞沉淀顆?；旌?，在37℃下恒定渦旋，在90秒內(nèi)將1ml 50％PEG1500緩慢添加到該管中。使得融合過程在37℃下繼續(xù)另外90秒。就在添加第一滴PEG溶液后3分鐘時，通過添加完全DMEM停止融合反應。為了避免滲透壓休克，在頭一分鐘緩慢添加10ml完全DMEM，在1.5分鐘的時間段內(nèi)添加共30ml完全DMEM。然后通過在1500rpm下離心1分鐘收集細胞，除去所有上清液。然后將沉淀顆粒懸浮于60ml HAT完全DMEM中。向所制備的含有飼養(yǎng)細胞的板的各孔中添加兩滴該細胞懸浮液。然后在37℃、5％CO₂恒溫箱中培養(yǎng)細胞。

細胞融合后六天，通過抽吸除去培養(yǎng)上清液，向各孔中添加兩滴HAT完全DMEM。從融合后4天開始在倒置顯微鏡上檢測雜交瘤克隆，然后在改變培養(yǎng)基一天后，細胞用于篩選抗體。

2-3-5篩選雜交瘤克隆

進行間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)以篩選雜交瘤克隆。在PBS中將抗原稀釋到2μg/ml的最終濃度，向RIA板的每個孔中添加50μl稀釋后的抗原。然后板經(jīng)覆蓋并在恒溫箱中在37℃下孵育2小時或4℃過夜。輕輕到出包被溶液，用PBST(PBS中0.3％吐溫20)洗滌該板三次。然后通過每孔添加300μl封閉液(通過5μm濾膜過濾后的500ml PBS中11.1ml 45％明膠、25g蔗糖和1ml 10％的疊氮化鈉溶液)封閉包被的孔中剩余的蛋白結合位點。平板在37℃下孵育1小時。用PBST洗滌該板三次。將50μl雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清液添加到板的每個孔中，并在恒溫箱中在37℃下孵育1小時，用PBST洗滌該板三次。然后就在使用前將50μl綴合辣根過氧化物酶(HRP)的次級抗體以(根據(jù)制造商的)最佳濃度直接稀釋于稀釋緩沖液(通過5μm濾膜過濾后的500ml PBS中11.1ml 45％明膠和1.5ml的吐溫20)中。用粘附塑料覆蓋板，并在恒溫箱中在37℃下孵育1小時。用PBST洗滌板三次并且向溶液中添加50μl底物3,3’,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)并在室溫下孵育15分鐘。然后向各孔中添加50μl終止液(0.2N硫酸)。用酶標儀讀取OD。

然后將陽性克隆轉(zhuǎn)移至24孔板，向每個孔添加1ml HT完全DMEM。兩天后，通過如上所述的間接ELISA篩選克隆。將陽性克隆轉(zhuǎn)移到6孔板，并且最后在組織培養(yǎng)瓶(75cm²)中生長并在液氮中冷凍。冷凍所有的陽性克隆并在克隆前解凍。

2-3-6冷凍細胞

通過在1500rpm下離心1分鐘收獲并收集培養(yǎng)瓶(75cm²)中生長的細胞，徹底除去上清液。將細胞懸浮于1ml冷凍培養(yǎng)基(90％的FBS混合10％的二甲基亞砜(DMSO))中并轉(zhuǎn)移到冷凍瓶中。將冷凍瓶放入NALGENE^TM Cryo 1℃冷凍箱中并放置于深度冷凍器(-70℃)中2小時。然后將瓶保存于液氮罐中。發(fā)現(xiàn)放置在深度冷凍器中超過3小時的細胞當解凍時具有低的生活力。

2-3-7通過有限稀釋克隆

用PBS稀釋對數(shù)生長期的雜交瘤細胞，并且使用Neubauer細胞計數(shù)器確定細胞數(shù)，以及通過用HT完全DMEM連續(xù)稀釋調(diào)整到每毫升15個細胞。用10ml移液管將兩滴細胞懸浮液施加到96孔板的每孔中，每孔含有100μl在有限稀釋前一天制備的飼養(yǎng)細胞。6天后，用100μl HT完全DMEM替換各孔的上清液。第二天，使用間接ELISA篩選雜交瘤細胞。選擇陽性菌落并將其轉(zhuǎn)移到24孔板中。兩天后，篩選克隆并選擇用于第二次有限稀釋的陽性克隆。最后，在液氮中冷凍陽性克隆。

2-3-8產(chǎn)生腹水

為了誘導腫瘤，首先用0.5ml姥鮫烷注射BALB/c小鼠。一個星期后，將0.5ml滅菌的PBS中的1×10⁷個細胞腹腔內(nèi)注射到小鼠中。通常在一周后出現(xiàn)腫脹的腹部。然后在罐中用甲氧氟烷麻醉小鼠3分鐘，通過將18號針插入小鼠的腹部將腹水收集在50ml離心管中。最后，通過頸脫位法處死小鼠。在室溫下使管靜置30分鐘，并且在3000rpm下離心10分鐘。將上清液移入新的15ml管中，添加0.2％疊氮化鈉并在-20℃下儲存。

2-3-9從腹水純化單克隆抗體

對于mAb的純化，在3000rpm下離心3ml腹水20分鐘，并且用PBS2倍稀釋上清液。通過添加等體積的飽和硫酸銨并在溫和的攪拌下混合30分鐘沉淀單克隆抗體(mAb)，并且在15,000rpm下離心溶液20分鐘。將沉淀顆粒懸浮于3ml的PBS中并用PBS透析四次，每4小時更換PBS。制備柱，在將G蛋白淤泥施加到柱(1ml填充體積)中后，用5體積0.1M甘氨酸(pH 2.6)洗滌G蛋白。然后用磷酸緩沖液(50mM磷酸鹽、500mM氯化鈉，pH 6.0)徹底洗滌柱。在15000rpm下離心透析后的溶液30分鐘，以除去不溶的聚集體，將上清液施加到柱上，允許流通(flow through)，以緩慢地流動。用如上所述的相同磷酸緩沖液徹底地洗滌柱，并且用0.1M甘氨酸(pH 2.6)洗脫抗體。通過添加0.5M磷酸(氫二)鈉中和洗脫后的抗體。用PBS透析該抗體。通過Bradford檢驗測定mAb的濃度。

實施例3.單克隆抗體的表征

對如實施例2所制備的抗體進行了表征。由雜交瘤細胞系產(chǎn)生的cAST和mAST單克隆抗體分別命名為HCC1-HCC10和HCM1-HCM10。進行間接ELISA、抗體分型和蛋白質(zhì)印跡。

結果如表1所示。在10種單克隆抗體中，選擇兩種單克隆抗體HCC4和HCC5作為檢測cAST的最佳匹配對，其中HCC4用作捕獲抗體和HCC5用作檢測抗體。在mAST的情況下，分別選擇HCM4和HCM8作為捕獲抗體和檢測抗體。然后在此實施例中使用這四種抗體。cAST單克隆抗體HCC4(cAST 1A2C6)、HCC5(cAST，5C3F8)于2013年9月4日保藏于韓國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為KCTC 12483BP和KCTC 12484BP，mAST抗體HCM4(mAST，2E6D1)于2013年9月4日保藏于韓國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為KCTC 12485BP。

表1

在表1中，術語HCC表示抗cAST抗體，HCM表示抗mAST抗體；a和b分別表示在cAST ELISA中使用的捕獲和檢測；c和d分別表示在mAST ELISA中使用的捕獲和檢測。

3-1.單克隆抗體的效價

通過間接ELISA檢測純化的Ab的滴度，間接ELISA以如上所述相同的方式進行，不同之處是初級Ab從培養(yǎng)上清液變?yōu)榧兓腁b(2μg/ml)。

3-2.mAb同種型

根據(jù)制造商的說明書，通過ImmunoPure單克隆抗體分型試劑盒確定mAb的同種型。

3-3.蛋白質(zhì)印跡分析

通過SDS-PAGE分離蛋白。在此實施例中，使用半干轉(zhuǎn)法將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。SDS-PAGE完成前20分鐘，將四片濾紙和一片硝酸纖維素膜浸入轉(zhuǎn)移緩沖液(50mM Tris、40mM甘氨酸、0.04％SDS、10％甲醇)中，當SDS-PAGE完成時，將凝膠放在硝酸纖維素膜上，在120mA下持續(xù)35-40分鐘使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，使用TBST(10mM Tris、150mM NaCl 0.3％、20)洗滌膜一次，印跡用封閉液(10mM Tris、150mM NaCl、0.05％Tween 20、5％低脂奶，pH8.0)封閉1小時。用TBST洗滌膜3次(10分鐘間隔)之后，在室溫下將印跡與初級mAb溶液(0.2-1μg/ml)一起孵育1小時，或4℃下孵育過夜，用TBST洗滌3次(10分鐘間隔)。在室溫下用綴合HRP的山羊抗小鼠IgG處理印跡小時，并且用TBST洗滌膜3次(10分鐘間隔)。在化學發(fā)光試劑(SuperSignal化學發(fā)光底物，Pierce)中孵育印跡5分鐘，轉(zhuǎn)移至暗盒，曝光1分鐘。該膜在顯影試劑中顯影并用固定試劑固定。

3-4.抗cAST抗體和抗mAST抗體的特異性

人天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶同工酶由兩個不同的基因編碼，但是這兩種酶的氨基酸序列具有約46％的同一性。因此，抗cAST Ab可能結合mAST蛋白，抗mAST Ab可能結合cAST蛋白。為了測定抗cAST抗體和抗mAST抗體的交叉反應性，進行間接ELISA和蛋白質(zhì)印跡。結果如圖2所示。在圖2中，(A)是間接ELISA的結果，其中將抗原cAST和mAST包被在板上，使用抗cAST(HCC4)和抗mAST(HCM4)作為初級抗體：1：cAST包被；2：mAST包被。(B)是蛋白質(zhì)印跡分析，其中：a：SDS-PAGE；b：初級抗體HCC4；c：初級抗體HCM4；1：cAST包被；2：mAST包被。結果表明，抗cAST抗體和抗mAST抗體之間沒有交叉反應性。

3-5.肽圖譜

將30ml重組蛋白溶液(0.1mg/ml，0.45％吐溫20、0.5％TritonX-100)添加到1.5ml管中，并且向溶液中添加0.1μL蛋白酶(QIAGEN)，并通過移液管吸取進行混合?；旌衔镌?7℃下孵育10分鐘，并且向其中添加2x處理緩沖液，以及將它煮沸5分鐘。然后，向SDS-PAGE的每個孔加載3μl溶液。然后，如實施例3-3所述進行蛋白質(zhì)印跡。

結果如圖3所示。發(fā)現(xiàn)針對cAST的單克隆抗體分成4個不同的組(圖3A)。HCC1、HCC2、HCC3、HCC5、HCC6、HCC7和HCC9屬于一個組。HCC4、HCC8和HCC10的每一個代表一個組。這表明HCC4和HCC5識別不同的肽片段，HCC4和HCC5結合不同的表位，并且可在免疫夾心法中用作一對。

發(fā)現(xiàn)針對mAST的單克隆抗體分為2組(圖3B)。HCM1、HCM3、HCM4、HCM5、HCM6、HCM7、HCM9和HCM10表現(xiàn)出相同的免疫學染色模式，表明它們屬于一個組。HCM2和HCM8形成另一個組。這表明HCM4和HCM8屬于兩個不同的組，因此它們可在免疫夾心法中用作一對來測定人血清中的mAST。

實施例4.抗cAST和抗mAST分別特異性結合cAST和mAST

4-1.mAb綴合膠體金

用0.05M硼砂-硼酸緩沖液(pH9.0)將膠體金溶液的pH調(diào)節(jié)至pH 9。測定膠體金溶液與mAb的最佳比例。10ml膠體金溶液(pH9.0)與mAb溶液混合，同時在室溫下攪拌15分鐘。以1％的最終濃度添加10％BSA，并攪拌該溶液15分鐘。然后在4℃，9000rpm下離心該溶液30分鐘，除去上清液，并且添加相同體積的緩沖液(經(jīng)0.2μm尺寸過濾器過濾后的，25mM Tris-Cl、1％BSA、0.02％NaN₃)使沉淀顆粒懸浮。在4℃，9000rpm下離心溶液30分鐘，除去上清液，添加相同體積的緩沖液，重復如上所述相同的步驟。添加1ml緩沖液，使沉淀顆粒懸浮，并儲存于4℃冰箱中直至使用。

4-2.通過膠體金綴合物分別測定血清中的結合重組cAST和mAST、以及cAST和mAST的mAb

將50μl綴合mAb的膠體金添加到6個1.5ml Eppendorf管的每一個中，并且將50μl用PBS稀釋的不同濃度的溶液或血清中的重組cAST添加到6個管的每一個中。通過輕敲試管混合該溶液，并且在37℃下恒溫箱中孵育2小時。在9000rpm下離心試管30分鐘，并且除去上清液。用PBS使沉淀顆粒懸浮，并且在9000rpm下離心30分鐘。通過添加200μL天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的底物稀釋沉淀顆粒，并且將該溶液轉(zhuǎn)移到15ml管中，以及在37℃下恒溫箱中孵育1小時。將200μl顯色試劑添加到反應溶液中以顯色并在室溫下孵育20分鐘。然后將2ml 0.4N NaOH溶液添加到該溶液中停止反應。用紫外分光光度計讀取OD。用血清中的重組mAST和cAST完成相同的實驗。

4-3.測定人的AST同工酶的活性

從在知情同意的情況下，在Hallym醫(yī)院登記的肝癌患者中獲得用于該研究的血清樣品(慢性病毒性肝硬化(CVH)、肝硬化(LC)和肝細胞癌(HCC))。這些血清保存在-70℃直到使用。進行免疫沉淀反應以測定血清中cAST和mAST的活性。含有50μl G蛋白瓊脂糖珠(Sigma)的兩個管與10μl cAST Ab(1mg/ml)或mAST Ab(1mg/ml)混合，并在4℃下孵育1小時。進行離心以除去上清液，然后用1×PBS洗滌沉淀顆粒并且離心，重復該步驟2次。在4℃用牛奶(在1X PBS中5％)封閉兩個綴合的G蛋白抗體復合物1小時，并如上所述洗滌。將這兩個復合物與200μl血清一起孵育12小時，同時在4℃下攪拌。在如上所述的離心后，使用上清液測定活性。

4-4.通過蛋白質(zhì)印跡確定結合血清中AST同工酶的mAb

進行蛋白質(zhì)印跡分析以確定本發(fā)明的mAb可以識別血清中的AST同工酶，并比較正常的和肝癌患者的血清樣品中的AST同工酶的含量。

4-5.免疫熒光顯微鏡

在本實施例中使用表達cAST的肝癌細胞系，HepG2。HepG2細胞在含有10％FBS的完全DMEM中，供給7.0％的CO₂生長。對于復蘇，用移液管棄去培養(yǎng)基，并且添加10ml PBS洗滌細胞。將3ml 0.05％的胰蛋白酶-EDTA(1X，Invitrogen)添加到培養(yǎng)皿中，并且在37℃下處理細胞3分鐘。然后輕輕搖動培養(yǎng)皿直到大部分細胞從底部脫離。通過在1500rpm下離心1分鐘收集細胞。徹底地輕輕倒出上清液，并且將細胞懸浮于10ml完全DMEM中，并轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中。

玻璃蓋玻片(12mm圓，F(xiàn)isher Scientific)經(jīng)滅菌并被放置在24孔組織培養(yǎng)板中。將HepG2細胞接種在板上，生長直到大約70％的匯合。將培養(yǎng)基從孔中吸出，用PBS簡單地漂洗細胞3次，每次5分鐘，并且在室溫下用PBS中的4％多聚甲醛固定15分鐘。用PBS將細胞漂洗三次，每次5分鐘，用冷甲醇(-20℃)透化5分鐘。用封閉液(PBS中的3％BSA，0.1％Triton X-100)封閉細胞，并且在室溫下孵育1小時。用PBS洗滌蓋玻片三次，每次5分鐘。初級抗體用封閉液稀釋并添加到各孔中，并且在室溫下孵育1.5小時或在4℃下過夜。如上所述洗滌蓋玻片。將在封閉液中稀釋的綴合熒光染料的次級抗體添加到各孔中，并且在黑暗條件下在室溫下孵育1小時，并且如上所述洗滌。將4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，0.1μg/ml)添加到每個孔中，孵育2分鐘，并且如所上洗滌。蓋玻片置于具有熒光封固劑(DAKO)的載玻片的頂部，并且在黑暗條件下在室溫下孵育1小時。在熒光顯微鏡(Carl Zeiss，EL-Einsatz，德國)下分析熒光信號。

4-6.用蛋白質(zhì)印跡定位hepG2細胞中的AST同工酶

如上所述培養(yǎng)HepG2細胞2天并收獲。然后將200μl的PBS添加到細胞中，然后將其均質(zhì)化。然后在15000rpm下離心全部溶胞產(chǎn)物的一半30分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到新的管中，并且用等體積的PBS將沉淀顆粒再懸浮。然后，通過蛋白質(zhì)印跡分析全部溶胞產(chǎn)物、上清和沉淀顆粒。結果如圖4所示。如圖4所示，在胞漿部分中檢測到cAST和在沉淀顆粒中檢測到mAST，在細胞染色中cAST存在于胞漿中。

實施例5.人肝臟組織中cAST的分布

為了定位人肝臟組織中的cAST，如下進行免疫組織化學。使用商購的石蠟包埋的人肝臟組織切片(Superbiochip co.Ltd，韓國)。首先，進行脫蠟和水合，將載玻片放入二甲苯，并且在通風櫥中輕輕振蕩5分鐘，然后轉(zhuǎn)移到新鮮的二甲苯中，并且振蕩5分鐘。載玻片在100％、90％、80％和70％的乙醇中各自水合2分鐘，并且浸入自來水中10分鐘。將預溫熱的胃蛋白酶溶液(在37℃水浴中)添加到每個組織載玻片上3分鐘，并且用TBST漂洗5次。將過氧化物酶封閉溶液添加到每個載玻片，孵育10分鐘，并且用TBST漂洗5次。然后加入封閉血清，培養(yǎng)10分鐘，用TBST漂洗5次。然后將用PBS稀釋的初級抗體添加到載玻片上，并且在室溫下孵育2小時或在4℃下過夜，并且用TBST洗滌5次。然后添加綴合生物素的次級Ab，并且孵育10分鐘，以及用TBST漂洗5次。添加抗生物素蛋白HRP溶液，孵育10分鐘，用TBST漂洗5次。添加DAB溶液，孵育30-60秒，并且浸入自來水中停止反應。將載玻片浸入蘇木精中1分鐘，同時振蕩孵育，然后用自來水沖洗10分鐘。然后將載玻片浸于鹽酸溶液(1L 70％乙醇中的1ml原始鹽酸)中1秒，并且用自來水沖洗10分鐘，然后浸入氨中2分鐘。載玻片在80％、90％和100％乙醇中各自脫水2分鐘。用二甲苯漂洗載玻片2次，并且振蕩的同時孵育2分鐘。用紙巾除去過量二甲苯后，將封固劑(Abcam公司)添加到組織上，并且將蓋玻璃放置到組織上。最后，在顯微鏡(Sony，日本)下觀察載玻片。結果如圖6所示。如圖6所示，在肝細胞中檢測到強的cAST反應性。

實施例6.測定血清中AST同工酶的含量

6-1.mAb的生物素化

為了用生物素標記mAb，將10μg生物素(EZ-Link^TM NHS-LC-LC-生物素，Pierce)和250μg mAb溶解在500μL PBS中。將混合物在冰上孵育4小時，每半小時進行渦旋。然后在4℃下用PBS透析混合物。

6-2.夾心ELISA

為了確定血清中cAST水平，如下進行夾心ELISA。將50μl由PBS稀釋的mAb(2μg/ml)涂覆到EIA板上，并且將該板在37℃孵育2小時或在4℃過夜，并且用PBST洗滌3次。將封閉液添加到每個孔中，并且在37℃下孵育1小時，并且用PBST洗滌3次。將50μl重組cAST或全血清添加到各孔中，并且在37℃下孵育1小時，并且用PBST洗滌3次。將50μl通過稀釋緩沖液稀釋的綴合生物素的mAb溶液(2μg/ml)添加到孔中，并且在37℃下孵育1小時，并且用PBST洗滌3次。涂覆50μl抗生物素蛋白HRP溶液，并且在37℃下孵育1小時，并且用PBST洗滌3次。使用50μL底物，TMB進行顯色，并且靜置15分鐘，然后添加相同體積的終止溶液。用酶標儀讀取OD(波長：450nm)。

實施例7.使用免疫學方法測定血清中cAST和mAST的水平

7-1.用于測定cAST和mAST水平的標準曲線

為了測定血清樣品中的cAST和mAST水平，通過夾心ELISA系統(tǒng)，使用不同濃度(從0至400μg/l cAST或mAST)的重組蛋白cAST或mAST獲得標準曲線。健康的正常血清，其AST酶活性為10IU/L，用PBS稀釋5倍，摻入已知濃度的cAST或mAST，并且用作校準標準血清。在曲線中，在y軸上標繪450nm的OD，而在x軸上標繪重組cAST或mAST濃度。觀測到這兩個參數(shù)之間可靠的相關系數(shù)(r：0.999和0.998)，以及在整個測定范圍內(nèi)顯示良好的線性關系(圖7A，B)。發(fā)現(xiàn)每個濃度下三次獨立實驗的變異系數(shù)(CV)都<10％。進行不精確性試驗和恢復試驗來評估夾心ELISA系統(tǒng)的分析性能。對于cAST分析系統(tǒng)，日內(nèi)和日間不精確性分別為2.54-7.15％(對3個樣本10次重復的測試)和3.92-8.34％(對3個樣本測試并且連續(xù)5天分析)，發(fā)現(xiàn)分析恢復為93.1-101.3％。對于mAST分析系統(tǒng)，日內(nèi)和日間不精確性分別為2.95-8.38％(對3個樣本10次重復的測試)和6.52-9.08％(對3個樣本測試并且連續(xù)5天分析)，發(fā)現(xiàn)分析恢復為94.0-103.3％。這些結果表明，使用抗體測定cAST和mAST的水平提供了可靠的結果，因此可以成功地用于臨床樣品檢驗。

7-2.測定健康人和患有肝臟疾病的患者的血清cAST和mAST水平(1)

當人肝臟受損時，cAST和mAST被釋放到血流中。從而為了證明用各自的抗體可以檢測血清中所釋放的cAST和mAST，使用本發(fā)明抗體進行蛋白質(zhì)印跡。結果如圖5所示。如圖5所示，在健康人的血清中沒有檢測到帶。與此相反，在來自肝癌患者的血清中檢測到對應cAST和mAST的帶。

7-3.測定健康人和肝臟疾病患者的血清cAST和mAST含量(2)

在從健康人和患有不同肝臟疾病的患者中收集血清樣品之后，分別使用夾心免疫測定法和Hitachi 747自動分析儀，并行測定血清AST的水平(含量)和酶活性。就在分析前用PBS將所有的血清樣品稀釋5倍。如表2所示，健康對照(N＝25)、CVH(N＝24)、LC(N＝21)和HCC(N＝22)的cAST水平的平均值(SD)分別為40.5(38.6)、228.9(165.6)、255.3(154.8)和327.6(137.9)μg/l。健康對照(N＝25)、CVH(N＝24)、LC(N＝21)和HCC(N＝22)的mAST水平的平均值(SD)分別為10.1(6.1)、11.9(12.8)、9.7(15.9)和10.4(8.7)μg/l。也就是說，發(fā)現(xiàn)健康的正常樣品中的cAST的平均水平為40.5±38.6μg/L。然而，在CVH、LC和HCC中，發(fā)現(xiàn)cAST的平均水平分別為228.9±165.6μg/L、255.3±154.8μg/L和327.6±137.9μg/L。發(fā)現(xiàn)健康的正常樣品中的mAST的平均水平為10.1±6.1μg/L。然而，在CVH、LC和HCC中，發(fā)現(xiàn)cAST的平均水平分別為11.9±12.8μg/L、9.7±15.9μg/L、10.4±8.7μg/L。這些結果表明，可通過測定cAST和mAST的水平來診斷肝臟疾病。

表2

^a數(shù)據(jù)表示連續(xù)變量的平均值(SD)。

7-3.血清中的cAST的ROC曲線分析

進行ROC曲線分析以比較本發(fā)明的方法和常規(guī)酶活性方法的性能。對于酶活性測試，因為cAST占血清中總AST的80-90％，測定AST的酶活性，因此不會影響結果。

為此，針對合并在一個ROC曲線的所有患者或根據(jù)肝臟疾病類型的單獨的患者群組，分析cAST的水平和酶活性。結果如表3及圖8所示。如其中所示，AUC的統(tǒng)計比較表明，兩個測定方法之間存在一些不同?；赗OC曲線確定了兩個分析方法的最佳截止值。在不同的患者組中酶測定法的截止值彼此相似。測定水平的分析中的截止值，在除了HCC組(108.8μg/l)之外的所有組中無顯著變化。借助于所確定的截止值，發(fā)現(xiàn)除了HCC組之外測定水平和酶活性之間的特異性相同。對于靈敏度，發(fā)現(xiàn)測定水平的靈敏度比測定酶活性的高，特別是對于HCC患者組，其中，所測試的兩種方法之間的靈敏度和特異性都顯示出顯著的差異。通過測定水平和酶活性所確定的靈敏度分別為0.955和0.864，特異性分別為0.96和0.92。這些結果表明，在診斷肝臟疾病時，測定cAST和/或mAST的水平比測定其活性更有效。

表3

在表3中，p<0.001被認為是統(tǒng)計學上顯著的。

實施例8.統(tǒng)計分析

使用Microsoft Excel程序獲得標準曲線方程和相關系數(shù)(r)。使用MedCalc 6.12版本的軟件程序(MedCalc，Mariaekerke，比利時)進行ROC曲線分析。使用學生t檢驗和具有Bonferroni調(diào)整的ANOVA計算平均數(shù)之間的統(tǒng)計學差異。Pearson相關系數(shù)和用最小二乘法的線性回歸用來評價患者組和對照組之間的相關性。認為<0.05的p值是統(tǒng)計學上顯著的。為了評估并比較用于區(qū)分患有肝臟疾病的不同患者組的血清ALT的免疫測定和酶活性測定的診斷準確性，通過繪制真陽性(靈敏度)和假陽性(1-特異性)產(chǎn)生ROC曲線，并且用于計算截止值和曲線下面積(AUC)。

為清楚起見，本文中可能明確闡釋了各種單數(shù)/復數(shù)對換。雖然已示出并描述了本發(fā)明的幾個實施方式，但本領域技術人員可以理解，在不背離本發(fā)明的原理和精神的情況下，這些實施方式可進行變化，本發(fā)明的范圍由權利要求及其等同方式限定。

除非另外定義或以其它方式解釋，本文使用的所有的技術和科學術語以及任何縮寫具有與本發(fā)明的領域中的普通技術人員一般所理解的相同含義。

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