口服熱淋清顆粒后腎臟組織兩種化學成分的測定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種口服熱淋清顆粒后腎臟組織兩種化學成分的確定及其含量測定方法，含量測定方法是采用高效液相色譜—質譜聯(lián)用檢測方法，在所建立的檢測方法下對口服熱淋清顆粒后腎臟組織中的化學成分沒食子酸和原兒茶酸進行含量測定。本發(fā)明含量測定方法的精密度高，重現(xiàn)性好，穩(wěn)定性好，測定結果準確，可有效評價口服熱淋清顆粒后沒食子酸和原兒茶酸在腎臟組織中的分布。
【專利說明】口服熱淋清顆粒后腎臟組織兩種化學成分的測定方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥有效成分體內代謝研究【技術領域】，具體涉及一種口服熱淋清顆粒后腎臟組織兩種化學成分的確定及其含量測定方法。
【背景技術】
[0002]熱淋清顆粒是以苗藥頭花寥為原料制成的單方制劑，收載于《中國藥典》2010版。具清熱解毒、利尿通淋的功效。用于濕熱蘊結，小便黃赤，淋漓澀痛之癥，尿路感染，腎盂腎炎見上述證候者。對泌尿系統(tǒng)感染具有確切的療效?！盁崃芮孱w?！睘閲抑兴幈Ｗo品種、國家社保藥物，并為唯一進入2010版《中國藥典》的苗藥，獲國家發(fā)展改革委員會單獨定價權。
[0003]根據(jù)文獻報道，熱淋清顆粒中主要的化學成分為酚酸類化合物和黃酮類化合物?，F(xiàn)熱淋清顆粒收載于《中國藥典》2010版，該標準【含量測定】項僅以沒食子酸為指標成分。熱淋清顆粒臨床上主要應用于治療泌尿系統(tǒng)疾病，其發(fā)揮功效的有效成分是哪些？如何到達腎臟發(fā)揮作用？在腎臟中如何進行代謝？這些問題的解決必須依賴于一種準確可靠的有效成分含量測定方法，本發(fā)明正是基于這樣的背景，發(fā)明了一種評價口服熱淋清顆粒后腎臟組織中化學成分的含量測定方法。

【發(fā)明內容】
[0004]本發(fā)明的目的在于:提供一種口服熱淋清顆粒后腎臟組織兩種化學成分的確定及其含量測定方法。本發(fā)明通過對口服熱淋清顆粒后腎臟組織中的化學成分沒食子酸及原兒茶酸進行含量測定研究，使口服熱淋清顆粒后體內研究更為科學合理。
[0005]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的:
[0006]提供一種口服熱淋清顆粒后腎臟組織兩種化學成分的測定方法，其包括以下步驟:
[0007](I)測試樣品的制備:
[0008](a)取熱淋清顆粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通過灌胃給藥方式給予大鼠(體重230-270g)熱淋清顆粒水溶液10ml/kg ；
[0009](b)分別在30~360min，后對大鼠進行斷頭處死，解剖并分離腎臟組織，稱重，取腎臟組織0.1~0.5g，加5~10生理鹽水，粉碎，3000~6000r/min離心，取上層組織溶液轉移至新空白EP管中；
[0010](C)加入內標巖白菜素母液10 μ 1，然后按腎臟組織與沉淀試劑體積比為1:4~8沉淀蛋白，沉淀時間2~5min，渦旋混勻30~60s后，在O~10°C恒溫條件下以10000~12000r/min離心5~15min(所述的沉淀試劑為乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)混合液并且添加I %~4%酸，所述酸選自甲酸、乙酸或其組合)
[0011](d)將上層液轉移至新空白EP管中，于30~50°C氮氣流吹干，殘留物用100μΙ流動相溶解，渦旋混勻30~60s后，在O~10°C恒溫條件下以10000~12000r/min離心5?15min，取上清液即為供試品溶液；
[0012](e)按步驟(b)至步驟(d)的方法對未服用藥物的動物腎臟組織進行處理，得到空白溶液；
[0013](f)對照品溶液的制備:分別精密稱取沒食子酸對照品、原兒茶酸對照品、巖白菜素對照品0.01?lmg,各自加純甲醇定容至IOml,即得三種母液,分別取三種母液適量至同一量瓶中，加甲醇稀釋至所需濃度，即為對照品溶液；
[0014](2) LC-MS/MS分析的色譜條件和檢測條件:
[0015]色譜柱為反相色譜柱，酸性乙腈或酸性甲醇:酸性水=O?20:80?100 (體積比)為流動相，流速為0.1?0.5mL/min,柱溫為20?40°C，離子化方式為電噴霧條件，負模式監(jiān)測，噴霧電壓為2000?3000V，霧化溫度為300?500°C，鞘氣壓力為30?50mTorr，輔助氣壓力為5?15mTorr，毛細管溫度為200?400°C (所述的酸性乙腈或酸性甲醇或酸性水中，酸的濃度為0.05%?0.5 %，所述酸選自甲酸、乙酸或其組合);
[0016](3)測定法:分別精密吸取對照品溶液、空白溶液與供試品溶液5?20μ L，注入高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀，測定，即得。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(a)中，通過灌胃給藥方式給大鼠(230?270g)熱淋清顆粒水溶液2?4ml。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(b)中，分別在30min，60min，2h，3h，6h后大鼠進行米血。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的方法,其中步驟(b)中，將樣品于低速離心機5000r/min離心lOmin。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(c)中，用酸度為2%酸性乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)按體積比1:4沉淀蛋白5min。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(C)中，沉淀蛋白后渦旋均勻30s后4°C恒溫離心，轉速 12000r/min,離心 IOmin0
[0022]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(C)中，使用甲酸:乙酸=2:1體積比混合酸來酸化沉淀試劑。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中兩種入腎臟成分是沒食子酸和原兒茶酸。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(d)中，將上層清液于氮吹儀于40°C吹干。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(d)中，殘留物用ΙΟΟμ I流動相溶解，渦旋混勻60s后12000r/min, 4°C恒溫,離心IOmin后取10 μ I進樣。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(2)中，色譜柱為C18色譜柱。
[0027]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(2)中，所述的酸性乙腈或酸性甲醇或酸性水中，酸的濃度為0.1%。
[0028]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟⑵中,流速為0.2ml/min，柱溫為30°C。
[0029]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(2)中，離子化方式為電噴霧條件，負模式監(jiān)測，噴霧電壓為2500V，霧化溫度為350°C，鞘氣壓力為40mTorr，輔助氣壓力為IOmTorr，毛細管溫度為300°C。
[0030]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(2)中，使用梯度洗脫，洗脫液的變化為:開始時，酸性乙腈相2%，酸性水溶液相98%，穩(wěn)定3min ;接著至第IOmin時，酸性乙腈相線性增加至10%，酸性水溶液相90% ;第10.1min時，酸性乙腈相改為2 %，酸性水溶液相98%，穩(wěn)定7min。
[0031]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(3)中，分別精密吸取對照品溶液、空白溶液與供試品溶液5 μ L，注入高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀。
[0032]根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟(2)中，質譜檢測為多反應監(jiān)測模式，反應離子對及形成穩(wěn)定子離子所需碰撞能量分別為:沒食子酸169.181 — 125.268，補償電壓(TybeLens Offset) 71V,碰撞壓力(Collision Press μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(CollisionEnergy) 13eV ;原兒茶酸 152.918 — 109.244，補償電壓(Tube Lens Offset) 75V，碰撞壓力(Collision Press μ re) 1.SmTorr,碰撞能量(Collision Energy) l；3eV ;內標巖白菜素 326.922 — 192.167，補償電壓(Tube Lens Offset) 100V，碰撞壓力(CollisionPress μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 22eV。
[0033]根據(jù)本發(fā)明的方法，其特征在于:取熱淋清顆粒2.0g，W 5?10倍水溶解，通過灌胃給藥方式給大鼠(230-270g)熱淋清顆粒水溶液10ml/kg，分別在30?360min后，對大鼠進行斷頭處死，解剖并分離腎臟組織，稱重，取腎臟組織0.1?0.5g，加5?10生理鹽水，粉碎，3000?6000r/min離心，取上層組織溶液轉移至新空白EP管中，用酸度為2%乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)按體積比1:4沉淀蛋白5min，渦旋均勻30s后4°C恒溫離心，轉速12000r/min，離心lOmin，將上層清液于氮吹儀于40°C吹干，殘留物用100 μ I流動相溶解，渦旋混勻60s后12000r/min，4°C恒溫，離心IOmin后取10 μ I進樣，空白腎臟組織按同樣方法處理，采用液相色譜-質譜聯(lián)用儀按以下條件進行LC-MS/MS分析:
[0034]色譜條件和檢測條件:色譜柱為反相色譜柱，酸性(甲酸或乙酸0.05%?0.5% )乙腈或甲醇:酸性(甲酸或乙酸0.05%?0.5%)水=O?20:80?100 (體積比)為流動相，梯度洗脫，流速為0.2ml/min，柱溫為30°C，離子化方式為電噴霧條件，負模式監(jiān)測，噴霧電壓為2500V，霧化溫度為350°C，鞘氣壓力為40mTorr，輔助氣壓力為IOmTorr，毛細管溫度為3500C ；
[0035]對照品溶液的制備:取沒食子酸對照品、原兒茶酸對照品、巖白菜素對照品0.01?lmg，精密稱定，加純甲醇定容至10ml，即得母液，工作液為母液加甲醇稀釋至所需濃度。
[0036]測定法:分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液5 μ L，注入高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀，測定，即得。
[0037]前述流動相梯度洗脫過程中，洗脫液的變化為:開始時，甲酸乙腈相2%，甲酸水溶液相98%，穩(wěn)定3min ;第IOmin時，甲酸乙腈相10%,甲酸水溶液相90%，第10.1min時，甲酸乙腈相2%，甲酸水溶液相98%，穩(wěn)定7min。
[0038]前述質譜檢測為多反應監(jiān)測模式，反應離子對及形成穩(wěn)定子離子所需碰撞能量分別為:沒食子酸169.181 — 125.268，補償電壓(Τ μ be Lens Offset) 71V，碰撞壓力(Collision Press μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 13eV,原兒茶酸 I52.918 — 109.244，補償電壓(Tube Lens Offset) 75V,碰撞壓力(CollisionPress μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 13eV,內標 326.922 — 192.167,補償電壓(Τ μ be Lens Offset) 100V,碰撞壓力(Collision Press μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy)22eV。
[0039]根據(jù)本發(fā)明，所述反相色譜柱是C18色譜柱。[0040]根據(jù)本發(fā)明的方法，其優(yōu)選地包括以下步驟:
[0041]取熱淋清顆粒0.5?4g，加5?10倍水溶解，通過灌胃給藥方式給大鼠(230-270g)熱淋清顆粒水溶液10ml/kg，分別在30?360min，后對大鼠進行斷頭處死，解剖并分離腎臟組織，稱重，取腎臟組織0.1?0.5g，加5?10生理鹽水，粉碎，3000?6000r/min離心，取上層組織溶液轉移至新空白EP管中，加入內標巖白菜素10 μ 1，然后按1:4?1:8體積比用I?4%酸性乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)沉淀蛋白，沉淀時間2?5min,潤旋混勻30?60s后10000?12000r/min, O?10°C恒溫,離心5?15min,上層液轉移至新空白EP管中于30?50°C氮氣流吹干，殘留物用100 μ I流動相溶解，渦旋混勻30?60s后10000?12000r/min, O?10°C恒溫，離心5?15min后取5?20 μ I進樣，空白血楽.按同樣方法處理，采用液相色譜-質譜聯(lián)用儀按以下條件進行LC-MS/MS分析:
[0042]色譜條件和檢測條件:色譜柱為反相色譜柱，酸性(甲酸或乙酸0.05%?0.5% )乙腈或甲醇:酸性(甲酸或乙酸0.05%?0.5%)水=O?20:80?100 (體積比)為流動相，梯度洗脫，流速為0.1?0.5mL/min,柱溫為20?40°C，離子化方式為電噴霧條件，負模式監(jiān)測，噴霧電壓為2000?3000V，霧化溫度為300?500°C，鞘氣壓力為30?50mTorr，輔助氣壓力為5?15mTorr，毛細管溫度為200?400°C ；
[0043]對照品溶液的制備:取沒食子酸對照品、原兒茶酸對照品、巖白菜素對照品0.01?lmg，精密稱定，加純甲醇定容至10ml，即得母液，工作液為母液加甲醇稀釋至所需濃度。
[0044]根據(jù)本發(fā)明的方法，其特征在于腎臟組織樣品按以下步驟操作:
[0045]取熱淋清顆粒0.5?4g，加5?10倍水溶解，通過灌胃給藥方式給大鼠(230-270g)熱淋清顆粒水溶液10ml/kg，分別在30?360min，后對大鼠進行斷頭處死，解剖并分離腎臟組織，稱重，取腎臟組織0.1?0.5g，加5?10生理鹽水，粉碎，3000?6000r/min離心，取上層組織溶液轉移至新空白EP管中，加入內標巖白菜素10 μ 1，然后按1:4體積比用2%酸性乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)沉淀蛋白，沉淀時間5min，渦旋混勻后12000r/min離心5min，上層液轉移至新空白EP管中于40°C氮氣流吹干，殘留物用100 μ I流動相溶解，4°C恒溫，12000r/min離心IOmin后取10 μ I進樣，空白腎臟組織樣品按同樣方法處理。
[0046]根據(jù)本發(fā)明的方法，其特征在于色譜柱規(guī)格為2.1 X 150mm，填料粒徑為1.7μπι，以甲酸0.1 %乙腈Α:甲酸0.1 %水B為流動相，按以下條件梯度洗脫:0?3min2%A, 3.0 ?3.1min2% A—10% A, 3.I ?10.0minl0% A, 10.0 ?10.1minl0% -2% A, 10.1 ?17.0min2% A。
[0047]根據(jù)本發(fā)明的方法，其特征在于，質譜噴霧電壓為2500V，霧化溫度為350°C，鞘氣壓力為40mTorr，輔助氣壓力為IOmTorr,毛細管溫度為350°C。
[0048]根據(jù)本發(fā)明的方法，其特征在于:質譜檢測為多反應監(jiān)測模式，反應離子對分別為:沒食子酸 169.181 — 125.268，原兒茶酸 152.918 — 109.244，內標 326.922 — 192.167。
[0049]以下是本發(fā)明人對口服熱淋清顆粒后腎臟組織中化學成分含量測定進行研究的過程:
[0050]一、口服熱淋清顆粒腎臟組織中化學成分的確定
[0051]本發(fā)明人對于有關熱淋清顆粒及其原料藥的文獻進行了大量的研究，而且根據(jù)發(fā)明人所在課題組前期對頭花寥展開的化學成分研究發(fā)現(xiàn)，沒食子酸和原兒茶酸為頭花寥中的生物活性成分，因此選取熱淋清顆粒中的沒食子酸和原兒茶酸為指標進行了口服熱淋清顆粒后腎臟組織分布試驗研究。
[0052]取熱淋清顆粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通過灌胃給藥方式給大鼠(230-270g)熱淋清顆粒水溶液10ml/kg，分別在給藥后30min，60min，2h，3h，6h，后對大鼠進行斷頭處死，解剖并分離腎臟組織，稱重，取腎臟組織0.5g，加5生理鹽水，粉碎，5000r/min離心，取上層組織溶液轉移至新空白EP管中，用酸度為2%乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)按體積比1:4沉淀蛋白5min,潤旋均勻30s后4°C恒溫離心,轉速12000r/min,離心10min,將上層清液于氮吹儀于40°C吹干，殘留物用100 μ I流動相溶解，渦旋混勻60s后12000r/min，4°C恒溫，離心10min后取10 μ I進樣，空白腎臟組織按同樣方法處理，采用液相色譜-質譜聯(lián)用儀按以下條件進行LC-MS/MS:
[0053]色譜條件和檢測條件:色譜柱為反相色譜柱，酸性(甲酸0.1 % )乙腈:酸性(甲酸0.1 % )水=O~20:80~100 (體積比)為流動相，梯度洗脫，流速為0.2ml/min,柱溫為30°C，離子化方式為電噴霧條件，負模式監(jiān)測，噴霧電壓為2500V，霧化溫度為350°C，鞘氣壓力為40mTorr，輔助氣壓力為IOmTorr,毛細管溫度為350°C ；
[0054]對照品溶液的制備:取沒食子酸對照品、原兒茶酸對照品、巖白菜素對照品
0.01~lmg，精密稱定，加純甲醇定容至10ml，即得母液，工作液為母液加甲醇稀釋至所需濃度。
[0055]測定法:分別 精密吸取對照品溶液與供試品溶液5 μ L，注入高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀，測定，即得。
[0056]前述流動相梯度洗脫過程中，洗脫液的變化為:開始時，甲酸乙腈相2%，甲酸水溶液相98%，穩(wěn)定3min ;第IOmin時，甲酸乙腈相10%,甲酸水溶液相90%，第10.1min時，甲酸乙腈相2%，甲酸水溶液相98%，穩(wěn)定7min。
[0057]前述質譜檢測為多反應監(jiān)測模式，反應離子對及形成穩(wěn)定子離子所需碰撞能量分別為:沒食子酸169.181 — 125.268，補償電壓(Τ μ be Lens Offset) 71V，碰撞壓力(Collision Press μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 13eV,原兒茶酸 I52.918 — 109.244，補償電壓(Tube Lens Offset) 75V,碰撞壓力(CollisionPress μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 13eV,內標 326.922 — 192.167,補償電壓(Τ μ be Lens Offset) 100V,碰撞壓力(Collision Press μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy)22eV。
[0058]測定結果如圖1-4所示，從圖可以看出，沒食子酸和原兒茶酸為口服熱淋清顆粒后腎臟組織中的化學成分。
[0059]二、口服熱淋清顆粒大鼠腎臟組織中沒食子酸和原兒茶酸的含量測定方法的建立
[0060]1.儀器與試藥
[0061]TSQ 04 8社11111超高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀(河？^:-|^/^5)，包括:三重四級桿質量分析器，ESI離子源，Xcalib μ r工作站，液相部分為Thermo AccelaMPLC,包括:Accela PDA檢測器,Accela自動進樣器，Accelal250輸液泵(美國賽默飛世爾科技有限公司)、十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)、KQ5200E型超聲波清洗(昆明市超聲儀器有限公司)，TGL-16M高速冷凍離心機(長沙邁佳森儀器設備有限公司)，EYELANG-2200型氮氣吹干儀(日本東京理化器械株式會社)，微量移液槍(德國Eppendorf公司)。
[0062]乙腈(色譜純，美國“天地”試劑公司)、甲醇(色譜純，美國“天地”試劑公司)；水(重蒸水，臨用前制備)；甲酸(色譜純，美國Roe Scientific公司)、乙酸(色譜純，美國 Roe Scientific 公司)；
[0063]沒食子酸、原兒茶酸及巖白菜素對照品(中國藥品生物制品檢定所提供)。
[0064]2.儀器操作條件
[0065]液相色譜條件:PhenomenexKinetexXB_C18 色譜柱(2.1 X 150mm, 1.7 μ m),流動相A為乙腈(含0.1%甲酸)，B為水(含0.1%甲酸)，梯度洗脫:0~3min2%A，3.0~
3.1min2 % A—10 % A, 3.I ~10.0minlO % A, 10.0 ~10.1minlO % -2 % A, 10.1 ~17.0min2% A，流速 0.2mL/min，進樣量為 5 μ L,
[0066]質譜條件:采用ESI離子源；負離子檢出模式；掃描方式為多反應監(jiān)測方式(MRM);用于定量分析的監(jiān)測離子見表1。離子源參數(shù):鞘氣流速:40Arb，輔助氣流速:IOArb ;毛細管溫度:350°C ;毛細管電壓:30V ;霧化溫度為350°C ;噴霧電壓:2500V ;掃描頻率:0.1s。
[0067]表1、以SRM模式優(yōu)化GA、PA、內標(IS)形成穩(wěn)定子離子所需碰撞能量
[0068]
【權利要求】
1.口服熱淋清顆粒后腎臟組織兩種化學成分的測定方法，其包括以下步驟: (1)測試樣品的制備: (a)取熱淋清顆粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通過灌胃給藥方式給予大鼠(體重230-270g)熱淋清顆粒水溶液10ml/kg ； (b)分別在30~360min，后對大鼠進行斷頭處死，解剖并分離腎臟組織，稱重，取腎臟組織0.1~0.5g，加5~10生理鹽水，粉碎，3000~6000r/min離心，取上層組織溶液轉移至新空白EP管中； (c)加入內標巖白菜素母液10μ 1，然后按腎臟組織與沉淀試劑體積比為1:4~8沉淀蛋白，沉淀時間2~5min，渦旋混勻30~60s后，在O~I (TC恒溫條件下以10000~12000r/min離心5~15min (所述的沉淀試劑為乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)混合液并且添加I %~4%酸，所述酸選自甲酸、乙酸或其組合) (d)將上層液轉移至新空白EP管中，于30~50°C氮氣流吹干，殘留物用100μ I流動相溶解，潤旋混勻30~60s后,在O~10°C恒溫條件下以10000~12000r/min離心5~15min，取上清液即為供試品溶液； (e)按步驟(b)至 步驟⑷的方法對未服用藥物的動物腎臟組織進行處理，得到空白溶液； (f)對照品溶液的制備:分別精密稱取沒食子酸對照品、原兒茶酸對照品、巖白菜素對照品0.01~Img,各自加純甲醇定容至IOml,即得三種母液,分別取三種母液適量至同一量瓶中，加甲醇稀釋至所需濃度，即為對照品溶液； (2)LC-MS/MS分析的色譜條件和檢測條件: 色譜柱為反相色譜柱，酸性乙腈或酸性甲醇:酸性水=O~20:80~100 (體積比)為流動相，流速為0.1~0.5mL/min，柱溫為20~40°C，離子化方式為電噴霧條件，負模式監(jiān)測，噴霧電壓為2000~3000V，霧化溫度為300~500°C，鞘氣壓力為30~50mTorr，輔助氣壓力為5~15mTorr，毛細管溫度為200~400°C (所述的酸性乙腈或酸性甲醇或酸性水中，酸的濃度為0.05%~0.5 %，所述酸選自甲酸、乙酸或其組合); (3)測定法:分別精密吸取對照品溶液、空白溶液與供試品溶液5~20μL，注入高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀，測定，即得。
2.根權利要求1的方法，其中步驟(a)中，通過灌胃給藥方式給大鼠(230~270g)熱淋清顆粒水溶液2~4ml。
3.根權利要求1的方法，其中步驟(b)中，分別在30min，60min，2h，3h，6h后大鼠進行米血。
4.根權利要求1的方法，其中步驟(b)中，將樣品于低速離心機5000r/min離心10min。
5.根權利要求1的方法，其中步驟(c)中，用酸度為2%酸性乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)按體積比1:4沉淀蛋白5min。
6.根權利要求1的方法，其中步驟(c)中，沉淀蛋白后渦旋均勻30s后4°C恒溫離心，轉速 12000r/min,離心 lOmin。
7.根權利要求1的方法，其中步驟(c)中，使用甲酸:乙酸=2:1體積比混合酸來酸化沉淀試劑。
8.根權利要求1的方法，其中步驟(d)中，將上層清液于氮吹儀于40°C吹干。
9.根權利要求1的方法，其中: 步驟(d)中，殘留物用100μ I流動相溶解，渦旋混勻60s后12000r/min，4°C恒溫，離心.10min后取10 μ I進樣； 步驟(2)中，色譜柱為C18色譜柱； 步驟(2)中，所述的酸性乙腈或酸性甲醇或酸性水中，酸的濃度為0.1% ； 步驟⑵中，流速為0.2ml/min，柱溫為30°C ； 步驟(2)中，離子化方式為電噴霧條件，負模式監(jiān)測，噴霧電壓為2500V，霧化溫度為.350°C，鞘氣壓力為40mTorr，輔助氣壓力為IOmTorr,毛細管溫度為300°C ； 步驟(2)中，使用梯度洗脫，洗脫液的變化為:開始時，酸性乙腈相2%，酸性水溶液相.98%,穩(wěn)定3min ;接著至第IOmin時,酸性乙腈相線性增加至10%,酸性水溶液相90% ;第.10.1min時，酸性乙腈相改為2%，酸性水溶液相98%，穩(wěn)定7min ； 步驟⑶中，分別精密吸取對照品溶液、空白溶液與供試品溶液5yL，注入高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀；和/或 步驟(2)中，質譜檢測為多反應監(jiān)測模式，反應離子對及形成穩(wěn)定子離子所需碰撞能量分別為:沒食子酸169.181 — 125.268，補償電壓(Τ μ be Lens Offset) 71V,碰撞壓力(Collision Press μ re)1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy)13eV ；原兒茶酸152.918 — 109.244，補償電壓(Tube Lens Offset) 75V,碰撞壓力(Collision Press μ re)1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy)13eV ;內標巖白菜素 326.922 — 192.167，補償電壓(Τ μ be Lens Offset) 100V,碰撞壓力(CollisionPress μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 22eV。
10.根權利要求1的方法，其特征在于: 取熱淋清顆粒2.0g,加5~10倍水溶解，通過灌胃給藥方式給大鼠(230-270g)熱淋清顆粒水溶液10ml/kg，分別在30~360min后，對大鼠進行斷頭處死，解剖并分離腎臟組織，稱重，取腎臟組織0.1~0.5g，加5~10生理鹽水，粉碎，3000~6000r/min離心，取上層組織溶液轉移至新空白EP管中，用酸度為2%乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)按體積比1:4沉淀蛋白5min,潤旋均勻30s后4°C恒溫離心,轉速12000r/min,離心10min,將上層清液于氮吹儀于40°C吹干，殘留物用100 μ I流動相溶解，渦旋混勻60s后12000r/min，4°C恒溫，離心IOmin后取10μ I進樣，空白腎臟組織按同樣方法處理，采用液相色譜-質譜聯(lián)用儀按以下條件進行LC-MS/MS分析: 色譜條件和檢測條件:色譜柱為反相色譜柱，酸性(甲酸或乙酸0.05%~0.5(%)乙腈或甲醇:酸性(甲酸或乙酸0.05%~0.5% )水=O~20:80~100 (體積比)為流動相，梯度洗脫，流速為0.2ml/min，柱溫為30°C，離子化方式為電噴霧條件，負模式監(jiān)測，噴霧電壓為2500V，霧化溫度為350°C，鞘氣壓力為40mTorr，輔助氣壓力為IOmTorr,毛細管溫度為.350 0C ； 對照品溶液的制備:取沒食子酸對照品、原兒茶酸對照品、巖白菜素對照品0.01~.lmg，精密稱定，加純甲醇定容至10ml，即得母液，工作液為母液加甲醇稀釋至所需濃度；或者，其特征在于: 前述流動相梯度洗脫過程中，洗脫液的變化為:開始時，甲酸乙腈相2%，甲酸水溶液相98%，穩(wěn)定3min ;第IOmin時，甲酸乙腈相10%,甲酸水溶液相90%，第10.1min時，甲酸乙腈相2 %，甲酸水溶液相98 %，穩(wěn)定7min ； 或者，其特征在于: 前述質譜檢測為多反應監(jiān)測模式，反應離子對及形成穩(wěn)定子離子所需碰撞能量分別為:沒食子酸169.181 — 125.268，補償電壓(Τ μ be Lens Offset) 71V，碰撞壓力(Collision Press μ re)1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy)13eV,原兒茶酸 152.918 — 109.244,補償電壓(Tube Lens Offset) 75V,碰撞壓力(CollisionPress μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy) 13eV,內標 326.922 — 192.167,補償電壓(Τ μ be Lens Offset) 100V,碰撞壓力(Collision Press μ re) 1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy)22eV ； 或者，其特征在于:所述反相色譜柱是C18色譜柱； 或者，其特征在于:取熱淋清顆粒0.5~4g,加5~10倍水溶解,通過灌胃給藥方式給大鼠(230-270g)熱淋清顆粒水溶液10ml/kg，分別在30~360min，后對大鼠進行斷頭處死，解剖并分離腎臟組織，稱重，取腎臟組織0.1~0.5g，加5~10生理鹽水，粉碎，3000~6000r/min離心，取上層組織溶液轉移至新空白EP管中，加入內標巖白菜素10μ 1，然后按1:4~1:8體積比用I~4%酸性乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)沉淀蛋白，沉淀時間2~5min，潤旋混勻30~60s后10000~12000r/min, O~10°C恒溫,離心5~15min,上層液轉移至新空白EP管中于30~50°C氮氣流吹干，殘留物用100 μ I流動相溶解，渦旋混勻30~60s后10000~12000r/min, O~10°C恒溫，離心5~15min后取5~20 μ I進樣，空白血衆(zhòng)按同樣方法處理，采用液 相色譜-質譜聯(lián)用儀按以下條件進行LC-MS/MS分析: 色譜條件和檢測條件:色譜柱為反相色譜柱，酸性(甲酸或乙酸0.05%~0.5(%)乙腈或甲醇:酸性(甲酸或乙酸0.05%~0.5% )水=O~20:80~100 (體積比)為流動相，梯度洗脫，流速為0.1~0.5mL/min,柱溫為20~40°C，離子化方式為電噴霧條件，負模式監(jiān)測，噴霧電壓為2000~3000V，霧化溫度為300~500°C，鞘氣壓力為30~50mTorr，輔助氣壓力為5~15mTorr，毛細管溫度為200~400°C ； 對照品溶液的制備:取沒食子酸對照品、原兒茶酸對照品、巖白菜素對照品0.01~lmg，精密稱定，加純甲醇定容至10ml，即得母液，工作液為母液加甲醇稀釋至所需濃度；或者，其特征在于: 腎臟組織樣品按以下步驟操作: 取熱淋清顆粒0.5~4g，加5~10倍水溶解，通過灌胃給藥方式給大鼠(230-270g)熱淋清顆粒水溶液10ml/kg，分別在30~360min，后對大鼠進行斷頭處死，解剖并分離腎臟組織，稱重，取腎臟組織0.1~0.5g，加5~10生理鹽水，粉碎，3000~6000r/min離心，取上層組織溶液轉移至新空白EP管中，加入內標巖白菜素10 μ I，然后按1:4體積比用2 %酸性乙腈-甲醇-乙醚(3:1:1)沉淀蛋白，沉淀時間5min,潤旋混勻后12000r/min離心5min,上層液轉移至新空白EP管中于40°C氮氣流吹干，殘留物用100 μ I流動相溶解，4°C恒溫，12000r/min離心10min后取10 μ I進樣，空白腎臟組織樣品按同樣方法處理； 或者，其特征在于:色譜柱規(guī)格為2.1 X 150mm,填料粒徑為1.7 μ m，以甲酸0.1 %乙腈A:甲酸0.1 %水B為流動相，按以下條件梯度洗脫:0~3min2% A，3.0~3.1min2% A—10% A, 3.I ~10.0minl0% A, 10.0 ~10.1minl0% -2% A, 10.1 ~17.0min2% A ； 或者，其特征在于:質譜噴霧電壓為2500V，霧化溫度為350°C，鞘氣壓力為40mTorr，輔助氣壓力為lOmTorr，毛細管溫度為350°C ； 或者，其特征在于:質譜檢測為多反應監(jiān)測模式，反應離子對分別為:沒食子酸.169.181 — 125.268，原兒茶酸 152.91 8 — 109.244，內標 326.922 — 192.167。
【文檔編號】G01N30/02GK103983713SQ201410234592
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月29日 優(yōu)先權日:2014年5月29日
【發(fā)明者】周欣, 龔小見, 陳華國, 馬風偉, 趙楊, 梁斌, 楊槐 申請人:貴州威門藥業(yè)股份有限公司