一種人類8-氧代鳥(niǎo)嘌呤dna糖基化酶活性的比色分析方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，涉及一種人類8-氧代鳥(niǎo)嘌呤DNA糖基化酶活性的比色分析方法。向0.1～5.0μM的S1中加入0.1～5.0μM的S2，85～100℃反應(yīng)0.5～2min，10～30℃反應(yīng)1～5min，交替反應(yīng)8～15次，再加入hOGG1、BSA和NaBH3CN，35～40℃反應(yīng)0.5～5h，80～100℃加熱1～10min。加入ExoI和ExoIII，35～40℃靜置10～60min，加入石墨烯/納米金，混合均勻。依次加入顯色劑和H2O2，進(jìn)行吸光度測(cè)定。本發(fā)明的比色分析法比傳統(tǒng)無(wú)機(jī)納米材料分析方法成本低、操作簡(jiǎn)單、實(shí)用性強(qiáng)。
【專利說(shuō)明】—種人類8-氧代鳥(niǎo)嘌呤DNA糖基化酶活性的比色分析方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，涉及一種人類8-氧代鳥(niǎo)嘌呤DNA糖基化酶活性的比色分析方法。

【背景技術(shù)】
[0002]在基因中，8-氧代鳥(niǎo)嘌呤是一種最常見(jiàn)的由于活性氧引起的DNA氧化損傷。在DNA復(fù)制過(guò)程中，這種損傷可以阻止DNA鏈伸長(zhǎng)，導(dǎo)致由錯(cuò)配引起的基因突變，對(duì)基因穩(wěn)定性產(chǎn)生了巨大威脅。由于其在機(jī)體內(nèi)的含量高、誘變能力強(qiáng)，如今已被看作機(jī)體的DNA氧化損傷標(biāo)志物。
[0003]在人體對(duì)損傷堿基的修復(fù)中，人類8-氧代鳥(niǎo)嘌呤DNA糖基化酶(human8-hydroxyguanine glycosylase,hOGGl)是一種重要的修復(fù)酶,它可以識(shí)別并切除8_氧代鳥(niǎo)嘌呤。此外,hOGGl還具有AP(apurinic/apyrimidinic)核酸內(nèi)切酶的AP位點(diǎn)的水解功能，在該酶的作用下，可以將受損堿基的位點(diǎn)完全切除，形成一個(gè)空的位點(diǎn)，并在5’端位置形成磷酸末端。據(jù)此，hOGGl對(duì)機(jī)體DNA氧化損傷的修復(fù)有著重大的意義，故對(duì)其活性進(jìn)行快速準(zhǔn)確的定量分析是十分必要的。
[0004]傳統(tǒng)的hOGGl活性分析方法有儀器法、生物法、生化法等，由于其固有的缺陷已難以應(yīng)對(duì)目前的分析需求。例如，蛋白質(zhì)印跡法操作復(fù)雜，對(duì)抗極端環(huán)境的適應(yīng)性差、靈敏性差；流式細(xì)胞術(shù)、熒光測(cè)定實(shí)驗(yàn)耗時(shí)、費(fèi)力、成本高；結(jié)合了天然酶的分子信標(biāo)法雖然通過(guò)信號(hào)放大實(shí)現(xiàn)了高靈敏性，但實(shí)驗(yàn)的標(biāo)記過(guò)程繁瑣，且天然酶的穩(wěn)定性差，阻礙了該法的推廣應(yīng)用。近年來(lái)，無(wú)機(jī)納米材料由于其卓越的穩(wěn)定性、反應(yīng)活性和簡(jiǎn)單的制備過(guò)程，結(jié)合電化學(xué)、突光、比色技術(shù)，已被廣泛運(yùn)用于傳感分析檢測(cè)中(Nature nanotechnology, 2007，2(9)，577-583 !Environmental science and technology, 2012, 46(22),12567-12574 ;Journal of materials chemistry, 2012, 22(33), 17079-17085) ? 目前，人們也已利用無(wú)機(jī)納米材料成功建立了一些針對(duì)hOGGl活性的傳感分析平臺(tái)(Analyticalchemistry, 2013，85(9)，4376-4383),但過(guò)程涉及繁瑣的標(biāo)記過(guò)程或復(fù)雜的操作步驟,影響了實(shí)驗(yàn)效率、分析結(jié)果和方法的實(shí)用性。
[0005]石墨烯/納米金復(fù)合物，一種新型的無(wú)機(jī)過(guò)氧化酶催化材料，利用石墨烯與納米金的接觸界面的過(guò)氧化酶催化性質(zhì)，可以快速催化氧化多種有機(jī)底物。此外，由于石墨烯片層與單鏈DNA之間的π-π共軛作用可使單鏈DNA自發(fā)的吸附到石墨烯表面，從而占據(jù)了石墨烯/納米金復(fù)合物的界面活性位點(diǎn)，抑制了其過(guò)氧化酶催化性質(zhì)。反應(yīng)自發(fā)進(jìn)行，無(wú)需標(biāo)記過(guò)程。如今石墨烯/納米金復(fù)合物材料由于其優(yōu)異的性質(zhì)，如制備過(guò)程簡(jiǎn)單、成本低、反應(yīng)活性高等，已被用于傳感分析中(ACS ΝΑΝ0，2012，6 (4) ,3142-3151)。本發(fā)明將石墨烯/納米金復(fù)合物材料應(yīng)用于樣品中hOGGl的活性分析，建立一種hOGGl活性的比色分析方法，解決了傳統(tǒng)方法繁瑣耗時(shí)、成本高、實(shí)用性差等缺點(diǎn)，應(yīng)用前景非常廣泛。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明解決了現(xiàn)有hOGGl活性分析方法繁瑣耗時(shí)、標(biāo)記過(guò)程復(fù)雜、成本高、實(shí)用性差等不足，提供了一種簡(jiǎn)便、快捷、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的hOGGl活性的定量分析方法。
[0007]石墨氧化物和氯金酸的混合液，在堿性條件下，經(jīng)一步水熱合成石墨烯/納米金復(fù)合物，其界面的仿生過(guò)氧化酶催化性能可使底物中的顯色劑在過(guò)氧化氫(H2O2)存在下，從常態(tài)氧化至氧化態(tài)，從而使體系吸光度值發(fā)生改變。含有8-氧代鳥(niǎo)嘌呤的DNA序列I與其互補(bǔ)DNA序列2雜交后，形成含有8-氧代鳥(niǎo)嘌呤的雙鏈DNA。當(dāng)目標(biāo)物hOGGl存在于體系中時(shí)，其作用的DNA底物會(huì)形成shifT堿，在還原劑氰基硼氫化鈉的作用下與DNA雙鏈共價(jià)結(jié)合，阻礙了隨后加入的核酸外切酶對(duì)序列I的降解作用，而不含有8-氧代鳥(niǎo)嘌呤的序列2則被核酸外切酶降解。捕獲目標(biāo)物hOGGl的序列I由于其與石墨烯之間的π-Ji共軛作用而吸附到石墨烯/納米金復(fù)合物表面，阻礙了復(fù)合物的界面過(guò)氧化酶催化性能，在顯色劑與H2O2存在條件下，不能使反應(yīng)體系吸光度產(chǎn)生變化。反之，當(dāng)體系中不存在目標(biāo)物hOGGl時(shí)，序列I與序列2形成的雙鏈DNA則會(huì)被核酸外切酶降解，由于所加入的石墨烯/納米金復(fù)合物的界面過(guò)氧化酶催化性能，在H2O2存在條件下氧化顯色劑，使反應(yīng)體系吸光度產(chǎn)生變化。據(jù)此，體系的吸光度值在一定范圍內(nèi)與目標(biāo)物hOGGl的活性呈線性反相關(guān)，從而為hOGGl的定量分析提供依據(jù)。
[0008]本發(fā)明提供了一種人類8-氧代鳥(niǎo)嘌呤DNA糖基化酶活性的比色分析方法，具體步驟如下:
[0009](I)向0.1?5.0 μ M的DNA序列SI溶液中加入濃度為0.1?5.0 μ M的DNA序列S2溶液，在85?100°C溫度下反應(yīng)0.5?2min，繼續(xù)在10?30°C溫度下反應(yīng)I?5min，如此溫度交替反應(yīng)8?15次，使DNA序列SI與DNA序列S2雜交反應(yīng)成雙鏈DNA。其中，所述的DNA序列SI為含有8-氧代鳥(niǎo)嘌呤的DNA序列，DNA序列S2為DNA序列SI的互補(bǔ)DNA序列。
[0010](2)依次向步驟⑴獲得的雙鏈DNA溶液中加入活性值不大于0.5U/μ L的hOGGl、0.01?1.0mg/mL牛血清蛋白和0.01?1.0M氰基硼氫化鈉，在35?40°C溫度下反應(yīng)0.5?5h，使hOGGl捕獲到DNA序列SI上。然后在80?100°C溫度下反應(yīng)I?lOmin，終止反應(yīng)。
[0011](3)向步驟⑵獲得的混合液中加入0.05?1.5υ/μ L核酸外切酶I (Exo I)和0.2?8.0U/μ L核酸外切酶III (Εχο III)，35?40°C溫度下靜置10?60min。再加入
0.5?40.0 μ g/mL石墨烯/納米金,混合均勻。
[0012](4)向步驟⑶得到的產(chǎn)物中依次加入0.05?10.0mM顯色劑與L O?100.0mM過(guò)氧化氫(H2O2)，將得到的混合液立即進(jìn)行吸光度測(cè)定。
[0013]所述的顯色劑包括四甲基聯(lián)苯胺(TMB)或2，2_聯(lián)氮-二(3_乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)。
[0014]本發(fā)明的有益效果:
[0015](I)靈敏度高，檢測(cè)下限可達(dá)0.0016U/yL。
[0016](2)石墨烯/納米金復(fù)合物采用水熱反應(yīng)一步合成，過(guò)程簡(jiǎn)單、快捷。
[0017](3)相較于傳統(tǒng)無(wú)機(jī)納米材料分析方法，無(wú)標(biāo)記過(guò)程，操作簡(jiǎn)單、實(shí)用性強(qiáng)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1是本發(fā)明所述的hOGGl的活性分析方法示意圖。
[0019]圖2是本發(fā)明的方法獲得的hOGGl活性分析的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
[0020]圖中:DNA序列 SI ；DNA 序列 S2 ；】hOGGl ；石墨稀 / 納米金。

【具體實(shí)施方式】
[0021]以下結(jié)合技術(shù)方案和附圖具體說(shuō)明本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】。
[0022]實(shí)施例1
[0023]石墨烯/納米金的制備
[0024]石墨烯/納米金采用水熱方法合成。將0.01?lg/L石墨氧化物(GO)溶液，0.2?20.0mM氯金酸(HAuCl4)溶液，0.002?0.2M氫氧化鈉(NaOH)溶液混合均勻。超聲2?12h后，轉(zhuǎn)移到襯底為聚四氟的水熱反應(yīng)釜中，175?185°C反應(yīng)8?12h，自然冷卻至室溫后備用。
[0025]實(shí)施例2
[0026]配置樣品中hOGGl含量的測(cè)定:
[0027](I)石墨烯/納米金的制備
[0028]石墨烯/納米金采用水熱方法合成。將0.01g/LG0溶液，0.2mMHAuCl4溶液，
0.004MNa0H溶液混合均勻。超聲2h后，轉(zhuǎn)移到襯底為聚四氟的水熱反應(yīng)釜中，175°C反應(yīng)12h，自然冷卻至室溫后備用。
[0029](2) SI 與 S2 雜交
[0030]向0.中加入濃度為0.ΙμΜ的S2，在85°C溫度下反應(yīng)2min，10°C溫度下反應(yīng)Imin,如此溫度交替循環(huán)反應(yīng)8次。
[0031](3)分析方法
[0032]依次向步驟⑵獲得的雙鏈DNA溶液中加入O?0.2U/μ L hOGGl，0.01mg/mL BSA與0.0lM NaBH3CN,在35°C溫度下反應(yīng)5h，80°C溫度下加熱1min終止反應(yīng)。然后向混合液中加入 0.05U/y LExo I 與 0.2U/yLExo III，在 35°C溫度下靜置 60min 后，加入 0.8 μ g/mL石墨烯/納米金，混合均勻。最后加入0.1mMTMB與1.0mM H2O2,并立即將得到的混合液轉(zhuǎn)入比色皿中。室溫條件下，于波長(zhǎng)為652nm處測(cè)定反應(yīng)體系吸光度值隨時(shí)間變化情況。
[0033](4)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制
[0034]步驟(3)中隨著樣品中hOGGl活性值的增加，體系的吸光度變化值不斷增加，在O?0.1U/ μ L范圍內(nèi)，600s時(shí)反應(yīng)體系吸光度值與hOGGl活性有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R = 0.997。
[0035](5)配置樣品中hOGGl活性的測(cè)定:
[0036]用工作緩沖液(50.0mM NaCl, 10.0mM Tris-HCl, 10.0mMMgCl, 1.0mM DTT，ρΗ7.9)配置活性為0.07U/yL的hOGGl待測(cè)樣品，用步驟(3)的方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與步驟(4)得到的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)比，計(jì)算出hOGGl的活性值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)出hOGGl活性為
0.072U/yL，回收率為102.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.71 % (η = 4)。
[0037]實(shí)施例2的DNA序列如表I所示，oxoG為8_氧代鳥(niǎo)嘌呤。
[0038]表IDNA 序列
[0039]
名稱序列

515’ -AATGGAGCACATCAGTT—GAGCTCCATT-3’

525 ’ -AATGGAGCTCAACTGATGTGCTCCATT-3?
[0040]實(shí)施例3
[0041]配置樣品中hOGGl含量的測(cè)定:
[0042](I)石墨烯/納米金的制備
[0043]石墨烯/納米金采用水熱方法合成。將0.lg/LGO溶液，2.0mMHAuCl4溶液，
0.02MNa0H溶液混合均勻。超聲6h后，轉(zhuǎn)移到襯底為聚四氟的水熱反應(yīng)釜中，180°C反應(yīng)1h,自然冷卻至室溫后備用。
[0044](2) SI 與 S2 雜交
[0045]向0.9μ M的SI中加入濃度為1.(^11的52，在951:溫度下反應(yīng)11^11，251:溫度下反應(yīng)2min,如此溫度交替循環(huán)反應(yīng)10次。
[0046](3)依次向步驟⑵獲得的雙鏈DNA溶液中加入O?0.23U/ μ L hOGGl，0.lmg/mLBSA與0.1MNaBH3CN,在37°C溫度下反應(yīng)2h，90°C溫度下加熱5min終止反應(yīng)。然后向混合液中加入 0.3U/μ LExo I 與 1.5U/μ LExo III，在 37°C溫度下靜置 20min 后，加入 7.9 μ g/mL石墨烯/納米金，混合均勻。最后加入1.0mM TMB與30.0mMH2O2,并立即將得到的混合液轉(zhuǎn)入比色皿中。室溫條件下，于波長(zhǎng)為652nm處測(cè)定反應(yīng)體系吸光度值隨時(shí)間變化情況。
[0047](4)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制
[0048]步驟(3)中隨著樣品中hOGGl活性值的增加，體系的吸光度變化值不斷增加，在O?0.1lU/ μ L范圍內(nèi)，600s時(shí)反應(yīng)體系吸光度值與hOGGl活性有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R = 0.998。
[0049](5)配置樣品中hOGGl活性的測(cè)定:
[0050]用工作緩沖液(50.0mM NaCl, 10.0mM Tris-HCl, 10.0mMMgCl, 1.0mMDTT,pH7.9)配置活性為0.09υ/μ L的hOGGl待測(cè)樣品，用步驟(3)的方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與步驟(4)得到的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)比，計(jì)算出hOGGl的活性值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)出hOGGl活性為0.086U/μ L，回收率為95.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.66% (η = 4)。
[0051]實(shí)施例3的DNA序列如表2所示，oxoG為8_氧代鳥(niǎo)嘌呤。
[0052]表2DNA 序列
[0053]
名稱序列
515’ -GAGAATGGAGCACATCAGTT°X°GAGCTCCATTCTC-3’
525’ -GAGAATGGAGCTCAACTGATGTGCTCCATTCTC-3’
[0054]實(shí)施例4
[0055]配置樣品中hOGGl含量的測(cè)定:
[0056](I)石墨烯/納米金的制備
[0057]石墨烯/納米金采用水熱方法合成。將lg/LGO溶液，20.0mMHAuCl4溶液，0.18MNa0H溶液混合均勻。超聲12h后，轉(zhuǎn)移到襯底為聚四氟的水熱反應(yīng)釜中，185°C反應(yīng)8h，自然冷卻至室溫后備用。
[0058](2) SI 與 S2 雜交
[0059]向5.0 μ M的SI中加入濃度為5.0 μ M的S2，在100°C溫度下反應(yīng)0.5min，30°C溫度下反應(yīng)5min,如此溫度交替循環(huán)反應(yīng)15次。
[0060](3)依次向步驟⑵獲得的雙鏈DNA溶液中加入O~0.5U/yL hOGGLl.0mg/mL BSA與1.0M NaBH3CN,在40°C溫度下反應(yīng)0.5h，100°C溫度下加熱2min終止反應(yīng)。然后向混合液中加入L 5U/μ LExo I與8.0U/μ LExo III，在40°C溫度下靜置1min后，加入40.0 μ g/mL石墨烯/納米金，混合均勻。最后加入10.0mMABTS與100.0mM H2O2,并立即將得到的混合液轉(zhuǎn)入比色皿中。室溫條件下，于波長(zhǎng)為405nm處測(cè)定反應(yīng)體系吸光度值隨時(shí)間變化情況。
[0061](4)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制
[0062]步驟(3)中隨著樣品中hOGGl活性值的增加，體系的吸光度變化值不斷增加，在O~0.3U/y L范圍內(nèi)，600s時(shí)反應(yīng)體系吸光度值與hOGGl活性有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R = 0.991。
[0063](5)配置樣品中hOGGl活性的測(cè)定:
[0064]用工作緩沖液(50.0mM NaCl, 10.0mM Tris-HCl, 10.0mMMgCl, 1.0mM DTT，ρΗ7.9)配置活性為0.23U/y L的hOGGl待測(cè)樣品，用步驟(3)的方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與步驟
(4)得到的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)比，計(jì)算出hOGGl的活性值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)出hOGGl活性為0.2IU/μ L，回收率為91.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為3.19% (η = 4)。
[0065]實(shí)施例4的DNA序列如表3所示，oxoG為8_氧代鳥(niǎo)嘌呤。
[0066]表3DNA 序列
[0067]

【權(quán)利要求】
1.一種人類8-氧代鳥(niǎo)嘌呤DNA糖基化酶活性的比色分析方法，其特征在于，步驟如下: (1)向0.1?5.0 μ M的DNA序列SI溶液中加入濃度為0.1?5.0 μ M的DNA序列S2溶液，在85?100°C溫度下反應(yīng)0.5?2min，繼續(xù)在10?30°C溫度下反應(yīng)I?5min，如此溫度交替反應(yīng)8?15次，使DNA序列SI與DNA序列S2雜交反應(yīng)成雙鏈DNA ;其中，所述的DNA序列SI為含有8-氧代鳥(niǎo)嘌呤的DNA序列，DNA序列S2為DNA序列SI的互補(bǔ)DNA序列； (2)依次向步驟⑴獲得的雙鏈DNA溶液中加入活性值不大于0.5U/yL的hOGGl、0.01?1.0mg/mL牛血清蛋白和0.01?1.0M氰基硼氫化鈉，在35?40°C溫度下反應(yīng)0.5?5h，使hOGGl捕獲到DNA序列SI上；然后在80?100°C溫度下反應(yīng)I?lOmin，終止反應(yīng)； (3)向步驟(2)獲得的混合液中加入0.05?1.5U/ μ L核酸外切酶I和0.2?8.0U/μ L核酸外切酶III，35?40°C溫度下靜置10?60min ;再加入0.5?40.0 μ g/mL石墨烯/納米金，混合均勻； (4)向步驟(3)得到的產(chǎn)物中依次加入0.05?10.0mM顯色劑和1.0?100.0mM過(guò)氧化氫，將得到的混合液立即進(jìn)行吸光度測(cè)定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的顯色劑為四甲基聯(lián)苯胺或2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽。
【文檔編號(hào)】G01N21/78GK104165884SQ201410203778
【公開(kāi)日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年5月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月15日
【發(fā)明者】趙慧敏, 袁芳, 劉猛, 全燮, 張耀斌 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)