一種檢測(cè)人發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒抗體IgG的試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)人發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒抗體IgG的試劑盒，包括反應(yīng)滴定微孔板和包含有陰性對(duì)照、陽性對(duì)照，樣品稀釋液，HRP-鼠抗人IgG,底物液、顯色液和終止液的檢測(cè)試劑，反應(yīng)滴定微孔板上包被有0.2ug/ml~0.4ug/ml的rSFTSN蛋白,樣品稀釋液中含有5ug/ml~10ug/ml的rRVFN重組蛋白,HRP-鼠抗人IgG酶中含終濃度5ug/ml-10ug/ml的rRVFN重組蛋白。本發(fā)明還公開了該試劑盒在制備用于人群感染的流行病學(xué)觀察和疫苗免疫后抗體水平進(jìn)行評(píng)估的診斷試劑中的應(yīng)用。使用本試劑盒檢測(cè)人發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒抗體IgG，靈敏度可達(dá)99.8%；分析內(nèi)精密度為2.5%（n=10），分析間精密度為4.5%（n=10）；特異性：99.5%。
【專利說明】一種檢測(cè)人發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒抗體IgG的試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是涉及一種檢測(cè)人發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒抗體IgG的試劑盒，本發(fā)明還涉及該試劑盒在制備用于人群感染的流行病學(xué)觀察和疫苗免疫后抗體水平進(jìn)行評(píng)估的診斷試劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]布尼亞病毒科(Bunyaviride)是一類有包膜的負(fù)鏈RNA病毒，目前已知的病毒至少有350種,是蟲媒病毒中病毒數(shù)最多的一科,包括能感染人和動(dòng)物的布尼亞病毒屬(Orthobunyavirus)、白嶺病毒屬(Phlebovirus)、內(nèi)羅畢病毒屬(Nairovirus)、漢坦病毒屬(Hantavirus)和感染植物的番爺斑萎病病毒屬(Tospovirus)。其中白蛉病毒屬目前國際上公認(rèn)分成兩大組，一組是致病性的白蛉熱組(Sandfly fever group),如立夫特谷熱病毒(Rift VallyFever Virus)等,另一組是非致病性的烏庫病毒組(Uuku_niemigroup),一般對(duì)人類不致病,如烏庫病毒(Uukunie-mi Virus)等。近年來,河南、江蘇、湖北、安徽、山東、遼寧、浙江等地相繼發(fā)生發(fā)熱伴血小板減少綜合征(se-vere fever withthrombocytopenia Syndrome, SFTS)病例,經(jīng)證實(shí)其病原體為一種新布尼亞病毒，被稱為發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒( severe fever with thrombocyto-penia Syndromebunyavirus, SFTSV )。新發(fā)現(xiàn)的SFTSV為白蛉病毒屬的第三組病毒。SFTSV電鏡下病毒顆粒呈球形或橢圓形，直徑約80 nm?100 nm，其基因組由大(L)、中(M)、小(S)3個(gè)單股負(fù)鏈RNA片段組成。病人感染SFTSV后引起SFTS，主要表現(xiàn)為急性起病、發(fā)熱、惡心、嘔吐、腹瀉、乏力、全身不適、肌肉酸痛、頭痛、頭暈，WBC、PLT進(jìn)行性下降等，可因多器官功能衰竭死亡。SFTSV可以通過蜱蟲叮咬傳播，也可通過接觸病人血液等傳播。
[0003]國家疾控中心對(duì)其進(jìn)行了病原學(xué)、流行病學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等研究。目前該病毒序列已經(jīng)闡明，基于RT-PCR的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)建立，但是對(duì)SFTS的免疫學(xué)檢測(cè)試劑還未完善，使得評(píng)價(jià)該病毒感染缺乏一個(gè)對(duì)PCR結(jié)果的印證方法，也無法評(píng)估群體的既往感染水平及疫苗的保護(hù)作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種檢測(cè)人發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒抗體IgG的試劑盒，該試劑盒適用于流行病學(xué)調(diào)查，也可作為臨床診斷中發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒感染的輔助診斷。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案:
本發(fā)明所述的檢測(cè)人發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒抗體IgG的試劑盒，包括反應(yīng)滴定微孔板和包含有陰性對(duì)照、陽性對(duì)照，樣品稀釋液，HRP-鼠抗人IgG，底物液、顯色液和終止液的檢測(cè)試劑，所述反應(yīng)滴定微孔板上包被有0.2 ug/ml?0.4ug/ml的rSFTSN蛋白，所述樣品稀釋液中含有5ug/ml?10ug/ml的rRVFN重組蛋白，HRP-鼠抗人IgG酶中含終濃度 5 ug/ml-10ug/ml 的 rRVFN重組蛋白。
[0006]所述rSFTSN蛋白的制備方法為:按照NCB1:4J4R_A中序列合成SFTSN蛋白讀框序列，將擴(kuò)增后的序列插入PET30A構(gòu)建PET30A-rSFTSN表達(dá)質(zhì)粒，然后用PET30A_rSFTSN轉(zhuǎn)化BL21DE3，再采用常規(guī)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6HIS_rSFTSN重組蛋白，Hitrap純化6HIS_rSFTSN重組蛋白即可得到rSFTSN蛋白，并包被于反應(yīng)滴定微孔板上。
[0007]所述rRVFN重組蛋白的制備方法為:按照NCBI:EU574085中序列合成RVFN蛋白讀框序列，將擴(kuò)增后的序列插入PET30A構(gòu)建PET30A-rRVFN表達(dá)質(zhì)粒，然后用PET30A_rRVFN轉(zhuǎn)化BL21DE3，再采用常規(guī)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6HIS_rRVFN重組蛋白，Hitrap純化6HIS_rRVFN重組蛋白即可得到rRVFN重組蛋白，并添加到樣品稀釋液和酶稀釋液中。
[0008]本發(fā)明所述的試劑盒在制備用于人群感染的流行病學(xué)觀察和疫苗免疫后抗體水平進(jìn)行評(píng)估的診斷試劑中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā) 明試劑盒適用于對(duì)人血清或血漿樣品中SFTSN-1gG抗體的定性檢測(cè)。由于機(jī)體受發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒刺激時(shí)，SFTS-1gG抗體比SFTS-1gM抗體出現(xiàn)時(shí)間稍晚，在急性期過后，SFTS-1gM抗體較快下降，而SFTS-1gG抗體可能長時(shí)間存在。
[0010]本發(fā)明采用ELISA分析法對(duì)人發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒抗體IgG進(jìn)行檢測(cè)，微孔條上包被rSFTSN抗原，可與樣品中rSFTSN抗體反應(yīng)，加入HRP標(biāo)記的抗人IgG抗體后，將形成“包被抗原-抗體-酶標(biāo)抗人IgG”復(fù)合物。加入底物劑，復(fù)合物上連接的HRP使顯色劑生成藍(lán)色產(chǎn)物，終止后變?yōu)辄S色。顯色強(qiáng)度與rSFTSN-1gG抗體含量成正比，當(dāng)待檢樣品中無rSFTSN-1gG抗體存在時(shí)，不顯色。
[0011]實(shí)驗(yàn)表明，使用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)人發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒抗體IgG，各項(xiàng)指標(biāo)可達(dá)到:靈敏度:99.8% ;精密度:分析內(nèi)精密度為2.5% (n=10)，分析間精密度為4.5%(n=10);特異性:99.5%。
[0012]本發(fā)明所述試劑盒的主要質(zhì)量指標(biāo)包括靈敏度、特異性、精密性、穩(wěn)定性，試劑質(zhì)量指標(biāo)達(dá)到2010版《中國藥典》第三部，體外診斷類規(guī)程中的要求。
[0013]以本發(fā)明制備的試劑其檢測(cè)靈敏度:4mIU/ml ;特異性驗(yàn)證:與其它同科布尼亞病毒IgG抗體無交叉反應(yīng)；精密性驗(yàn)證；試劑批間差異(CV%)不高于15%。
【具體實(shí)施方式】
[0014]本發(fā)明試劑盒的具體制備方法如下:
一、rSFTSN蛋白的表達(dá)和純化
參照NCBI (4J4R_A)中序列，合成其N蛋白的讀碼框并分別在5’添加酶切位點(diǎn)NdeI,3^添加酶切位點(diǎn)Xhol。采用常規(guī)分子生物學(xué)方法，將該閱讀框插入細(xì)菌表達(dá)質(zhì)粒PET30A (novagen)的和之間，得到細(xì)菌表達(dá)質(zhì)粒PET30A_rSFTSN。將該質(zhì)粒常規(guī)轉(zhuǎn)化E.Coli BL21DE3 (novagen),按照廠商推薦的方法誘導(dǎo)表達(dá)rSFTSN重組蛋白，并用Hitrap (novagen)常規(guī)純化rSFTSN重組蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)蛋白分子量和純度，常規(guī)蛋白定量備用。
[0015]二、rRVFN蛋白的表達(dá)和純化
參照NCBI (EU574085)中序列，合成其N蛋白的讀碼框并分別在5’添加酶切位點(diǎn)NdeI,3^添加酶切位點(diǎn)Xhol。采用常規(guī)分子生物學(xué)方法，將該閱讀框插入細(xì)菌表達(dá)質(zhì)粒PET30A(novagen)的和之間，得到細(xì)菌表達(dá)質(zhì)粒PET30A_rRVFN。將該質(zhì)粒常規(guī)轉(zhuǎn)化E.ColiBL21DE3 (novagen)，按照廠商推薦的方法誘導(dǎo)表達(dá)rRVFN重組蛋白，并用Hitrap (novagen)常規(guī)純化rRVFN重組蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)蛋白分子量和純度，常規(guī)蛋白定量備用。
[0016]三、HRP-鼠抗人IgG制備
抗體標(biāo)記:取辣根過氧化物酶溶于三蒸水中，加入過碘酸鈉溶液活化，加入乙二醇反應(yīng)，將反應(yīng)混合物裝入透析袋，用醋酸緩沖液透析，加入待標(biāo)記物(是鼠抗人IgG特異性抗體)混勻，碳酸緩沖液調(diào)pH至堿性，加入NaHB4溶液反應(yīng)后，裝入透析袋，用磷酸鹽緩沖液透析，分裝后加入蛋白保護(hù)劑(含終濃度50%的甘油)，-20度保存。
[0017]四、制備人發(fā)熱伴 血小板減少綜合征病毒抗體IgG的試劑盒
檢測(cè)人發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒抗體IgG的試劑盒，包括包被有0.2 ug/ml 0.4ug/ml rSFTSN蛋白的96孔酶免透明聚苯乙烯白色反應(yīng)滴定微孔板，工作濃度為0.llPg/ml的辣根過氧化物酶標(biāo)記鼠抗人IgG特異性抗體(含5ug/ml~10ug/ml rRVFN重組蛋白)；96孔酶免透明聚苯乙烯反應(yīng)滴定微孔板包被rSFTSN重組蛋白:包被緩沖液采用pH9.6,0.05M碳酸鹽緩沖液；包被濃度0.2ug/ml~0.4μδ/πι1,包被量100μ1/孔，(TC ~4°C包被過夜；棄去孔內(nèi)液體，使用PBS-Tween洗液洗板孔I次；用PH7.4 PBS-2% Casein (m/v)，100μ1/孔，室溫封閉2h。
[0018]樣品稀釋液:0.02 mo I PBS-2% Casein (m/v) PH7.4 (含 5ug/ml ~lOug/ml rRVFN重組蛋白)。
[0019]陽性對(duì)照制備:用樣品稀釋液稀釋，人發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒抗體IgG陽性的血清，到OD值0.6左右。
[0020]陰性對(duì)照制備:正常人血清。
[0021 ] 五、本發(fā)明試劑盒的使用方法
本試劑盒于2-8°C保存，有效期6個(gè)月。使用前將試劑盒平衡至室溫(約30分鐘)。未用完的微孔板條須與干燥劑及其用自封袋密封2-8°C保存。實(shí)驗(yàn)前將液體試劑輕輕振蕩混勻，使用后立即密閉放回2-8°C保存。
[0022]適用儀器
加樣器、溫箱、洗板機(jī)、含波長450nm酶標(biāo)儀。
[0023]樣本要求
I)本試劑使用人血清或血漿，含有EDTA、檸檬酸鈉或肝素等抗凝劑的樣品可用于本實(shí)驗(yàn)。
[0024]2)不能檢測(cè)含懸浮纖維蛋白或聚集物、重度溶血的樣品。
[0025]3)樣品中應(yīng)無微生物，無菌分離的樣品可在2_8°C存儲(chǔ)一周，長期儲(chǔ)存應(yīng)低溫凍存，避免反復(fù)凍融。
[0026]4)使用前請(qǐng)將樣品室溫平衡30分鐘以上，凍存樣品實(shí)驗(yàn)前需混勻。
[0027]試驗(yàn)前準(zhǔn)備
I)取I包固體洗液用500ml蒸餾水溶解后備用。
[0028]2)取出試劑盒及待測(cè)樣品，將所有試劑及樣品恢復(fù)至室溫(18_25°C)。
[0029]3)將恒溫箱或水浴鍋調(diào)至反應(yīng)溫度。
[0030]4)提前30分鐘將發(fā)光底物A、B液等比例混合至本次試驗(yàn)所需體積。[0031]實(shí)驗(yàn)步驟
O配液:將固體洗滌劑用蒸餾水或去離子水(5g固體洗滌劑/500ml蒸餾水或去離子水)倍稀釋。
[0032]2)編號(hào):將樣品對(duì)應(yīng)微孔板按序編號(hào)，每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照3孔，陽性對(duì)照2孔和空白對(duì)照I孔(用雙波長檢測(cè)，可不設(shè)空白對(duì)照孔)。
[0033]3)加稀釋液:每孔加入樣品稀釋液lOOul，空白孔除外。
[0034]4)加樣:分別在相應(yīng)孔中加入待測(cè)樣品或陰、陽性對(duì)照10ul，輕輕振蕩混勻。
[0035]5)溫浴:用封板膜封板后，置37°C溫育30分鐘。
[0036]6)洗版:小心揭掉封板膜，用洗板機(jī)洗滌6遍，最后一次盡量扣干。
[0037]7)加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑lOOul，空白孔除外，輕輕振蕩混勻。
[0038]8)溫浴:操作同5。
[0039]9)洗板:操作同6。
[0040]10)顯色:每孔加入底物液、顯色液各50ul輕輕振蕩混勻，37°C避光顯色10分鐘。
[0041]11)測(cè)定:每孔加終止液50ul，輕輕振蕩混勻，10分鐘內(nèi)測(cè)定結(jié)果。設(shè)定酶標(biāo)儀波長于450nm處(建議用雙波長450nm/600nm檢測(cè))，用空白孔調(diào)零點(diǎn)后測(cè)定各孔的值。
[0042]六、檢驗(yàn)結(jié)果
O陰性對(duì)照的正常范圍:正常情況下，陰性對(duì)照孔A值< 0.10。(若有I孔陰性對(duì)照A值大于0.1應(yīng)舍棄,若兩孔或兩孔以上陰性對(duì)照A值大于0.1,應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn))。
[0043]2)陽性對(duì)照的正常范圍:正常情況下，陽性對(duì)照孔A值≥0.4。
[0044]3)臨界值(⑶T0FF)計(jì)算:臨界值=0.1+陰性對(duì)照孔評(píng)均值OD值陰性對(duì)照孔低于
0.05者按0.05計(jì)算)。
[0045]有效性判斷:陽性對(duì)照OD值≥0.4，陰性對(duì)照OD值≤0.1。
[0046]4)陰性判定:樣品A值<臨界值(⑶T0FF)者為發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒-1gG抗體陰性。
[0047]5)陽性判定:樣品A值≥臨界值(⑶T0FF)者為發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒-1gG抗體陽性。
[0048]6 )檢測(cè)標(biāo)本情況(部分—據(jù)
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)人發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒抗體IgG的試劑盒，包括反應(yīng)滴定微孔板和包含有陰性對(duì)照、陽性對(duì)照，樣品稀釋液，HRP-鼠抗人IgG，底物液、顯色液和終止液的檢測(cè)試劑，其特征在于:所述反應(yīng)滴定微孔板上包被有0.2 ug/ml?0.4ug/ml的rSFTSN蛋白，所述樣品稀釋液中含有5ug/ml?10ug/ml的rRVFN重組蛋白，HRP-鼠抗人IgG酶中含終濃度5 ug/ml-10ug/ml的rRVFN重組蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)人發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒抗體IgG的試劑盒，其特征在于:所述rSFTSN蛋白的制備方法為:按照NCBI:4J4R_A中序列合成SFTSN蛋白讀框序列，將擴(kuò)增后的序列插入PET30A構(gòu)建PET30A-NP表達(dá)質(zhì)粒，然后用PET30A-SFTSN轉(zhuǎn)化BL21DE3，再采用常規(guī)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6HIS_rSFTSN重組蛋白，Hitrap純化6HIS_rSFTSN重組蛋白即可得到rSFTSN蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)人發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒抗體IgG的試劑盒，其特征在于:所述rRVFN重組蛋白的制備方法為:按照NCBI:EU574085中序列合成RVFN蛋白讀框序列，將擴(kuò)增后的序列插入PET30A構(gòu)建PET30A-rRVFN表達(dá)質(zhì)粒，然后用PET30A-rRVFN轉(zhuǎn)化BL21DE3，再采用常規(guī)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6HIS_rRVFN重組蛋白，Hitrap純化6HIS_rRVFN重組蛋白即可得到rRVFN重組蛋白。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)人發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒抗體IgG的試劑盒在制備用于人群感染的流行病學(xué)觀察和疫苗免疫后抗體水平進(jìn)行評(píng)估的診斷試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK103954756SQ201410197677
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年5月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月12日
【發(fā)明者】趙巧輝, 黃學(xué)勇, 許汴利, 杜燕華, 李桂林, 付光宇, 吳學(xué)煒 申請(qǐng)人:鄭州伊美諾生物技術(shù)有限公司