出血性大腸桿菌o157:h7免疫膠體金快速檢測試紙條的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種出血性大腸桿菌O157:H7的免疫膠體金檢測試紙條，具有樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜和吸收墊，其特征在于：其中，由保藏號為CGMCCNo.6610的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體GS2-D3作為金標(biāo)抗體偶聯(lián)膠體金，以及由保藏號為CGMCCNo.8458的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體3A8F11B10E7作為檢測抗體，金標(biāo)抗體偶聯(lián)膠體金后噴涂于金標(biāo)墊上，檢測抗體噴涂于NC膜上形成檢測線。另外，本發(fā)明還提供了出血性大腸桿菌O157:H7的膠體金檢測試紙條在檢測食品出血性大腸桿菌O157:H7中的應(yīng)用。本發(fā)明的出血性大腸桿菌O157:H7的免疫膠體金檢測試紙條具有檢測特異性和靈敏性均較高的優(yōu)點。
【專利說明】出血性大腸桿菌0157:H7免疫膠體金快速檢測試紙條
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種免疫膠體金快速檢測試紙條，屬于生物檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]在食品微生物檢測中，檢測大腸桿菌的含量是一個重要的食品安全指標(biāo)。2003?2004年的統(tǒng)計結(jié)果顯示，我國食物中毒致病因素依次為微生物性、化學(xué)性、有毒動植物性病原。微生物性病原是導(dǎo)致食物中毒的主要因素，中毒人數(shù)最多。食源性致病菌快速檢測一直是研究關(guān)注的焦點。
[0003]腸出血性大腸桿菌(EnterohemorrhageEscherichia coli,EHEC)0157:H7 引起的腸道感染性疾病已成為一個嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題，該病可引起腹瀉、出血性腸炎、繼發(fā)溶血性尿毒綜合癥(HUS)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)等。HUS和TTP的病情兇險，其中3%?5%的HUS病人死亡，約有12%的HUS病人有嚴(yán)重的后遺癥，危害十分嚴(yán)重。自1982年美國首次發(fā)現(xiàn)該病以來，在世界上許多國家相繼發(fā)生了暴發(fā)和流行，尤其1996年5月?8月間日本發(fā)生了由出血性大腸桿菌0157:H7引起的人類歷史上規(guī)模最大的一次暴發(fā)流行，累積患者近萬人，并有數(shù)人死亡，因此引起了世界的普遍關(guān)注。我國在1987年就發(fā)現(xiàn)該種大腸桿菌引起的散在感染，近幾年已陸續(xù)有十多個省份在食品、家禽、家畜、昆蟲和腹瀉病患者中檢出該致病菌，存在著疫情暴發(fā)、流行的潛在威脅。目前市場上有多種產(chǎn)品用于檢測出血性大腸桿菌0157:H7，其中有一些是使用免疫膠體金方法的試紙條，但是現(xiàn)有技術(shù)中的免疫膠體金試紙條所使用的抗體往往是使用單克隆抗體作為金標(biāo)抗體和多克隆抗體作為檢測抗體配合使用，因此存在著檢測精度低和交叉反應(yīng)高、試紙條有效期短等問題，對檢測的精度和準(zhǔn)確度造成了 一些影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種出血性大腸桿菌0157:H7的免疫膠體金快速檢測試紙條，具有樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜和吸收墊，其特征在于:其中，由保藏號為CGMCCN0.6610的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體GS2-D3作為金標(biāo)抗體偶聯(lián)膠體金，以及由保藏號為CGMCC N0.8458的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體3A8F11B10E7作為檢測抗體，金標(biāo)抗體偶聯(lián)膠體金后噴涂于金標(biāo)墊上，檢測抗體噴涂于NC膜上形成檢測線。
[0005]另外，本發(fā)明還提供了出血性大腸桿菌0157:H7的膠體金快速檢測試紙條在檢測食品出血性大腸桿菌0157:H7中的應(yīng)用。
[0006]發(fā)明作用與效果
[0007]根據(jù)本發(fā)明的出血性大腸桿菌0157:H7的免疫膠體金快速檢測試紙條，由于采用了配對單克隆抗體分別噴涂金標(biāo)墊和檢測線，實驗結(jié)果對出血性大腸桿菌0157:H7的檢測特異性和靈敏性均較高。
【專利附圖】

【附圖說明】[0008]圖1是本發(fā)明實施例中出血性大腸桿菌0157:H7的免疫膠體金快速檢測試紙條的單抗SDS-PAGE電泳圖；
[0009]圖2是本發(fā)明實施例中出血性大腸桿菌0157:H7的免疫膠體金快速檢測試紙條的各抗體偶聯(lián)膠體金PH結(jié)果；
[0010]圖3是本發(fā)明實施例中出血性大腸桿菌0157:H7的免疫膠體金快速檢測試紙條的各抗體偶聯(lián)膠體金結(jié)合量結(jié)果；
[0011]圖4是本發(fā)明實施例中出血性大腸桿菌0157:H7的免疫膠體金快速檢測試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0012]圖5是本發(fā)明實施例中出血性大腸桿菌0157:H7的免疫膠體金快速檢測試紙條的各抗體組合配對結(jié)果；
[0013]圖6是本發(fā)明實施例中出血性大腸桿菌0157:H7的免疫膠體金快速檢測試紙條的膠體金試紙條靈敏度結(jié)果；
[0014]圖7是本發(fā)明實施例中出血性大腸桿菌0157:H7的免疫膠體金快速檢測試紙條的膠體金試紙條交叉反應(yīng)結(jié)果；以及
[0015]圖8是本發(fā)明實施例中出血性大腸桿菌0157:H7的免疫膠體金快速檢測試紙條的膠體金試紙條模擬帶菌實驗結(jié)果。
[0016]保藏信息:
[0017]1.出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株GS2-D3于2012年9月24日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)Jia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼:100101，
[0018]保藏號為中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC，中國，北京市)N0.6610。
[0019]2.出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株3A8F11B10E7于2013年11月15日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼:100101
[0020]保藏號為:CGMCCN0.別58。
【具體實施方式】
[0021]以下結(jié)合附圖介紹本發(fā)明的【具體實施方式】:
[0022]首先介紹本發(fā)明實施例中所使用的試劑與儀器:
[0023]主要試劑
[0024]弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、PEG、TWEEN-20Sigma ；BSA上海世澤生物科技有限公司；膠體金溶液上海金標(biāo)生物科技有限公司；硝酸纖維素膜(NC膜)135S Millipore ；羊抗鼠、HRP-羊抗鼠、羊抗兔生工生物工程股份有限公司。
[0025]主要儀器
[0026]酶標(biāo)儀SpectraMax M2 購自 Molecular Devices ;Nanodrop2000C 購自 ThermoScientific ;點樣儀AD6010購自B10-D0T ;掃描儀Phantom V9購自MICROTEK ;恒溫培養(yǎng)搖床SPH-100B購自上海世平；蛋白純化儀BioLogic? LP358BR5057購自BIO-RAD ;單人凈化工作臺SW-SJ-2D型購自蘇州凈化。
[0027]一、出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體制備[0028]1.免疫原和陽性標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備
[0029]出血性大腸桿菌0157:H7 (ATCC43895)接種在山梨醇麥康凱(SMAC)平板上，37°C培養(yǎng)24h，挑取單菌落于改良E.C新生霉素增菌肉湯，37°C、150r/min振蕩培養(yǎng)17h，計數(shù)，加入0.3%甲醛溶液室溫滅活I(lǐng)天。用生理鹽水調(diào)整出血性出血性大腸桿菌0157:H7(ATCC43895)濃度至5 X 109CFU/ml作為免疫原。
[0030]用生理鹽水調(diào)整濃度為108CFU/ml出血性大腸桿菌0157:H7作為陽性對照標(biāo)準(zhǔn)品，改良E.C新生霉素增菌肉湯為陰性對照標(biāo)準(zhǔn)品。
[0031]2.單克隆抗體的制備過程
[0032]I)實驗動物:選3只8周齡，體重20g左右、雌性Balb/c小鼠為實驗動物。
[0033]2)免疫方法:每只小鼠腹腔注射0.2ml免疫原，每間隔2周用同樣劑量加強(qiáng)注射一次。
[0034]3)米血:3次加強(qiáng)免疫后從尾部靜脈米血，米用間接非競爭酶聯(lián)免疫法測定抗血清效價。待效價不再上升，腹腔注射同樣量免疫原，3天后按照常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合。
[0035]4)細(xì)胞融合:取免疫小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在50%PEG作用下常規(guī)融合，分別接種于96孔培養(yǎng)板，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0036]5)雜交瘤細(xì)胞篩選:采用間接非競爭酶聯(lián)免疫法，篩選強(qiáng)陽性孔的雜交瘤細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)移至24孔培養(yǎng)板。
[0037]6)克隆培養(yǎng)及抗體制備:用有限稀釋法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至鋪滿孔底1/10時，再用同樣方法檢測，將強(qiáng)陽性孔再克隆，如此反復(fù)3 — 4次，直至陽性率達(dá)到100%。將雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，注射于經(jīng)石蠟油預(yù)處理的Balb/c小鼠腹腔，每只2 X 106個雜交瘤細(xì)胞，7?10天小鼠腹部隆起，活體穿刺抽取腹水。用辛酸-硫酸銨法從小鼠腹水中純化抗體。
[0038]篩選出3株穩(wěn)定分泌抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為GS2-D3(簡稱D3)、3A8F11B10E7(簡稱E7)、5H11D8A5B9 (簡稱B9)，分別進(jìn)行亞類及亞型鑒定、測定濃度、相對分子質(zhì)量，并對制備的單克隆抗體通過交叉反應(yīng)進(jìn)行特異性驗證。
[0039]3.單克隆抗體的亞型鑒定
[0040]通過單克隆抗體亞型鑒定試劑盒測定各抗體亞類、亞型，表3結(jié)果為顯色終止后450nm處OD值，由表2可得，B9亞類為IgGl，輕鏈亞型為κ ;Ε7亞類為IgG2a，輕鏈亞型為K ;D3亞類為IgGl,輕鏈亞型為κ。
[0041]表I單克隆抗亞類、亞型結(jié)果
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種出血性大腸桿菌0157:H7的膠體金快速檢測試紙條，具有襯板，以及在襯板上依次排列的樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜和吸收墊，其特征在于: 其中，由保藏號為CGMCC N0.6610的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體GS2-D3作為金標(biāo)抗體偶聯(lián)膠體金，以及由保藏號為CGMCC N0.8458的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體3A8F11B10E7作為檢測抗體，所述金標(biāo)抗體偶聯(lián)膠體金后噴涂于所述金標(biāo)墊上，所述檢測抗體噴涂于所述NC膜上形成檢測線。
2.如權(quán)利要求1所述的出血性大腸桿菌0157:H7的膠體金快速檢測試紙條在檢測食品出血性大腸桿菌0157: H7中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N33/577GK103792362SQ201410029444
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月22日
【發(fā)明者】劉箐, 劉程 申請人:上海理工大學(xué)