一種羧甲基賴氨酸的檢測(cè)方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種羧甲基賴氨酸(CML)的檢測(cè)方法，其特征是結(jié)合HILIC親水作用色譜柱在較高有機(jī)相比例下對(duì)強(qiáng)極性CML的分離，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食品中CML含量。粉碎的食品經(jīng)硼氫化鈉還原、鹽酸水解后，過MCX陽離子交換小柱萃取凈化，樣品溶液在HILIC色譜柱中以甲醇-水(均含2mM乙酸銨和0.1％甲酸)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，CML與樣品基質(zhì)分離。選用電噴霧離子源，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析。以D4-CML為內(nèi)標(biāo)物定量分析，分析時(shí)間為12min。CML在保留時(shí)間3.47min處具有吸收峰。此種新的檢測(cè)方法靈敏度高、準(zhǔn)確度高、精密度好，無需對(duì)樣品進(jìn)行衍生化，簡化了樣品前處理、縮短了檢測(cè)時(shí)間、節(jié)省了檢測(cè)成本。
【專利說明】一種羧甲基賴氨酸的檢測(cè)方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及食品中羧甲基賴氨酸的檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，確切地說是一種結(jié)合HILIC親水作用液相色譜柱對(duì)羧甲基賴氨酸的分離、利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)食品中的羧甲基賴氨酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]多年來，利用美拉德反應(yīng)賦予食物以誘人的色澤和風(fēng)味的烹調(diào)方法一直倍受推崇。然而，近幾年越來越多的研究表明一些美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)人體有害，其中已有研究證明食源性晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)與人類糖尿病、尿毒癥、動(dòng)脈粥樣硬化和衰老等疾病的發(fā)生關(guān)系密切。羧甲基賴氨酸(CML)是食品中含量較高、發(fā)現(xiàn)較早的一種AGEs，通常被用作食品中AGEs檢出的標(biāo)志性物質(zhì)。國內(nèi)外已有越來越多的學(xué)者致力于食品中CML檢測(cè)方法的研究。
[0003]目前對(duì)于食品中的CML還沒有一種公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，已報(bào)道的檢測(cè)方法主要有:酶聯(lián)免疫法(ELISA)、高效液相色譜熒光檢測(cè)法(HPLC-FID)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS / MS)。因CML極性極強(qiáng)，現(xiàn)有的HPLC-MS /MS法多數(shù)使用C18柱結(jié)合離子對(duì)試劑進(jìn)行分離，對(duì)色譜柱和質(zhì)譜離子源造成損害，縮短儀器的使用壽命。鑒于現(xiàn)有的食品中CML檢測(cè)方法存在特異性抗體選擇困難、樣品處理復(fù)雜、準(zhǔn)確度不高等問題，研究開發(fā)一種操作簡單、準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)新方法對(duì)于改善現(xiàn)有烹調(diào)方式、控制食源性CML的攝入量、促進(jìn)人類健康飲食具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一在于針對(duì)現(xiàn)有CML的檢測(cè)方法所存在的不足而提供一種新的CML的檢測(cè)方法。
[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二在于該檢測(cè)方法在食品中的應(yīng)用。





H2+
HOOC、COOH
[0006]作為本發(fā)明第一方面的一種CML (結(jié)構(gòu)式
【權(quán)利要求】
1.一種羧甲基賴氨酸(CML)的檢測(cè)方法，其特征在于包括如下步驟: 稱取一定質(zhì)量的待測(cè)樣品，任選的包括樣品粉碎的步驟； 樣品在硼酸鈉緩沖溶液中經(jīng)硼氫化鈉還原；然后用體積比為1-3:1三氯甲烷去除脂肪并沉淀蛋白質(zhì)；沉淀物經(jīng)鹽酸水解后，添加一定量的氘代羧甲基賴氨酸(D4-CML)，過MCX陽離子交換小柱萃取凈化；萃取液經(jīng)氮吹濃縮后重新溶解在一定體積的體積比為3-5:1甲醇-水溶液中，得到待測(cè)液； 待測(cè)液在HILIC色譜柱中以含l-3mM乙酸銨和0.05-015%甲酸的甲醇(A)-水(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，D4-CML和CML通過洗脫與樣品基質(zhì)分離；梯度洗脫參數(shù)為O?3min，80%?50% A ;3 ?6min，50% A ；6.lmin,80% A ;6.I ?12min，80% A ； 選用電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)，進(jìn)行對(duì)所分離的洗脫樣品進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，測(cè)定質(zhì)譜圖中CML特征峰與相對(duì)應(yīng)的D4-CML的特征峰的高度之t匕，通過高度之比和所加入的D4-CML的量計(jì)算待測(cè)樣品中CML的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于待測(cè)樣品為奶粉、油條或薯?xiàng)l。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述的流動(dòng)相為含2mM乙酸銨和0.1 %甲酸溶液的甲醇-水混合溶液，D4-CML和CML的吸收峰位于3.2-3.6min。
4.權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法的應(yīng)用，其特征在于，是用以檢測(cè)食品中的羧甲基賴氨酸含量。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK103616466SQ201310607487
【公開日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月27日
【發(fā)明者】黃軼群, 賴克強(qiáng), 孫曉華, 牛麗紅, 王靖 申請(qǐng)人:上海海洋大學(xué)