鴨坦布蘇病毒病e-elisa檢測試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及以一種坦布蘇病毒E蛋白為包被抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗(E-ELISA)檢測試劑盒、其制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明試劑盒包含標(biāo)準(zhǔn)陽性對照鴨血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性對照鴨血清、坦布蘇病毒E蛋白(SEQ ID No.2)所包被的ELISA板、羊抗鴨酶標(biāo)二抗、TMB底物顯色液、終止液。本發(fā)明制備的E-ELISA檢測試劑盒用于鴨坦布蘇病毒感染后的抗體檢測。
【專利說明】鴨坦布蘇病毒病E-EL ISA檢測試劑盒及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供一種以鴨坦布蘇病毒E蛋白為包被抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗 (E-ELISA)檢測試劑盒，本發(fā)明還提供所述試劑盒的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 黃病毒（Flavivirus)是通過節(jié)肢動物傳播的，屬于黃病毒家族成員。其基因組 由單股正鏈RNA組成，約為10. 5kb，由一個開放閱讀框組成，共編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白和7個非 結(jié)構(gòu)蛋白，該病毒在Y末端沒有poly-A尾巴，病毒粒子由一個外殼蛋白（C)，一個膜蛋白 (E)，一個小的非糖基化蛋白（M)，7個非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1，NS2A，NS2B，NS3, NS4A，NS4B，NS5) 組成。在大多數(shù)黃病毒中，E蛋白定位于病毒粒子表面，病毒在與受體結(jié)合、侵入、細(xì)胞融合 過程中起重要作用 [1_2]。
[0003] 2010年4月以來，一種引起產(chǎn)蛋量急劇下降的新型傳染病在中國各地的水禽飼養(yǎng) 區(qū)大面積爆發(fā)，感染鴨的種類包括：北京鴨、番鴨、麻鴨、鵝等[μ]。該病引起高達(dá)1〇〇 %的發(fā) 病率和小于5%的死亡率，產(chǎn)蛋率在5天內(nèi)降至10%左右。剖檢后發(fā)現(xiàn)病鴨具有嚴(yán)重的卵 巢出血、卵巢炎、卵巢萎縮現(xiàn)象。由于該病導(dǎo)致繁殖力的急劇下降給許多養(yǎng)殖場帶來了嚴(yán)重 的經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)過病毒分離和鑒定，該病毒鑒定為鴨坦布蘇病毒（在本發(fā)明中也簡稱為"坦 布蘇病毒"）。
[0004] 該病近年來在我國一些省、市、自治區(qū)均有流行，給水禽養(yǎng)殖業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失慘 重。國內(nèi)外用于坦布蘇病毒病診斷方法為病毒常規(guī)分離和鑒定。病毒分離和鑒定技術(shù)（診 斷過程需7-10天時間），費時、費力，還需要專業(yè)人員和電鏡等設(shè)備；很難在臨床上推廣和 應(yīng)用。為此急需建立一種敏感、準(zhǔn)確、快速、簡便的鴨坦布蘇病毒病抗體檢測方法。酶聯(lián)免 疫吸附試驗（ELISA)是廣泛用于動物疾病診斷的一種方法，更適合短時間內(nèi)檢測大批量的 血清樣品，具有較好的特異性和較高的靈敏度。
[0005] 隨著我國人民生活水平的提高，水禽養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，水禽發(fā)生坦布蘇病毒病 的比率也隨之上升。因此，急需研制和開發(fā)坦布蘇病毒抗體監(jiān)測試劑盒，為國內(nèi)的坦布蘇病 毒的防治提供技術(shù)支持。國外科研小組的報告中，已經(jīng)證明E蛋白是坦布蘇病毒的主要免 疫原性蛋白，免疫原性好，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫保護(hù)性抗體。通過對國內(nèi)不同的分離株序列 的比較分析，設(shè)計E蛋白PCR引物，E蛋白原核表達(dá)純化后，以其為包被抗原建立了一種快 速檢測坦布蘇病毒抗體的ELISA方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供一種以鴨坦布蘇病毒E蛋白為包被抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗 (E-ELISA)檢測試劑盒，所述試劑盒包含標(biāo)準(zhǔn)對照陽性鴨血清、標(biāo)準(zhǔn)對照陰性鴨血清、鴨坦 布蘇病毒E蛋白所包被的ELISA板、羊抗鴨酶標(biāo)二抗及其它試劑，將標(biāo)準(zhǔn)對照陽性鴨血清、 標(biāo)準(zhǔn)對照陰性鴨血清、鴨坦布蘇病毒E蛋白所包被的ELISA板、羊抗鴨酶標(biāo)二抗及其它試劑 組裝，即得到所述試劑盒，其他成分包括樣品稀釋液，10 X濃縮洗液，TMB底物顯色液，終止 液，所述試劑盒特征在于酶標(biāo)ELISA板的包被抗原為純化的原核表達(dá)的坦布蘇病毒E蛋白， 經(jīng)過定量后包被ELISA板后得到；陽性標(biāo)準(zhǔn)血清為鴨坦布蘇病毒免疫無特定病原（SPF)鴨 后得到，陰性標(biāo)準(zhǔn)血清為SPF鴨血清。
[0007] 本發(fā)明制備的E-ELISA檢測試劑盒用于鴨坦布蘇病毒感染后的抗體檢測。
[0008] 如上所述，從鴨坦布蘇病毒TA株（自行分離）提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后經(jīng)坦布蘇病毒E 蛋白基因特異性引物P1和P2 (引物序列見表1)擴(kuò)增得到坦布蘇病毒E蛋白的編碼核苷酸 序列（SEQ ID No. 1)，將其克隆到適當(dāng)?shù)脑思?xì)胞表達(dá)載體中，在相應(yīng)的原核宿主細(xì)胞中進(jìn) 行表達(dá)和純化，得到坦布蘇病毒E蛋白（SEQ ID No. 2)。經(jīng)過定量后可用于包被ELISA板。
[0009] 為便于純化，經(jīng)原核重組表達(dá)的坦布蘇病毒E蛋白的N端帶有His標(biāo)簽，便于純 化。
[0010] 本領(lǐng)域技術(shù)任意應(yīng)該理解，利用坦布蘇病毒E蛋白包被ELISA板可以按照本領(lǐng)域 的常規(guī)方法進(jìn)行。例如，所述的E蛋白包被的ELISA板可以由以下過程制備得到：
[0011] 用〇. 〇5mol/L碳酸鹽緩沖液（pH值9. 6)將已純化的E重組蛋白稀釋為5 μ g/ml ; 將含有重組蛋白的碳酸鹽緩沖液加入到96孔酶標(biāo)板中，100μ 1/孔，置于4°C (15?18h); 傾盡96孔板中的液體，加入10mmol/L PBST (pH值7. 4)，200 μ 1/孔，洗3次，每次5min ; 傾盡96孔板中的液體，加入封閉液，置于37°C 2. 5h ;傾盡96孔板中的液體，加入lOmmol/ L PBST (pH值7. 4)，200 μ 1/孔，洗3次，每次5min。徹底傾盡96孔板中的液體，將包被有 His-E蛋白的96孔板置于37°C，干燥2h，放入有干燥劑塑料袋中。
[0012] 標(biāo)準(zhǔn)陰性對照血清為SPF鴨血清，由SPF鴨采血，按照常規(guī)方法提取血清。標(biāo)準(zhǔn)陽 性對照血清為用鴨坦布蘇病毒（例如，鴨坦布蘇病毒TA株）免疫SPF鴨后采血，按照常規(guī) 方法提取血清。為用于試劑盒，可以按照常規(guī)方法分別大量提取SPF鴨血清和鴨坦布蘇病 毒免疫鴨后的血清，并作為標(biāo)準(zhǔn)品儲備，無需每次檢測重新提取。
[0013] 羊抗鴨酶標(biāo)二抗可以商購得到，例如，可從KPL公司購買的HRP羊抗鴨二抗（貨 號：04-25-06)。
[0014] 所述試劑盒中的其他試劑包括：樣品稀釋液，10 X濃縮洗液，TMB底物顯色液，終 止液。其成分及配制方法如下：
[0015] 1)樣品稀釋液：每個試劑盒裝量1瓶，250ml/瓶；10X濃縮洗液（lOOmmol/ L PBST，ρΗ7·4)的配制過程如下：KH2P042.6g，Na2HP0 4-12H2028.9g，NaC187. lg，去離子水 800ml，調(diào)pH值至7. 4,添加去離子水至1L，在此溶液中添加5ml Tween-20。使用時10X濃 縮洗液按照1 : 9(V/V)稀釋獲得樣品稀釋液。
[0016] 2)包被液的配制：0· 05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH值9. 6包被液的配制
[0017] 甲液：Na2C0310. 6g加去離子水溶解至500ml
[0018] 乙液：NaHC038 . 4g加去離子水溶解至500ml
[0019] 取甲液16ml，乙液34ml，加去離子水至200ml，即為0.05mol/L pH值9. 6碳酸鹽緩 沖液。
[0020] 3) TMB底物顯色液購自天根公司，每個試劑盒裝量1瓶/盒50ml。
[0021] 4)終止液：每個試劑盒裝量1瓶瓶，250ml/瓶；終止液的配制：2mol/L硫酸溶液 (2mol/L H2S04)，濃硫酸溶液濃度為18mol/L，濃硫酸與去離子水按1 : 9配制即可成為 2mol/L硫酸溶液。
[0022] 5)封閉液的配制：ΚΗ2Ρ040· 26g，Na2HP04-12H202. 89g，NaC18. 71g，脫脂奶粉 50g，去 離子水800ml，調(diào)pH值至7. 4,添加去離子水至1L，在此溶液中添加0. 5ml Tween-20。
[0023] 檢測的樣品為鴨血清。
[0024] 本發(fā)明還涉及制備以鴨坦布蘇病毒E蛋白為包被抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗 (E-ELISA)檢測試劑盒的方法，所述方法包括下述步驟：
[0025] (1)原核表達(dá)并純化鴨坦布蘇病毒E蛋白，取適量的鴨坦布蘇病毒E蛋白包被 ELISA 板；
[0026] (2)從SPF鴨提取血清作為標(biāo)準(zhǔn)對照陰性血清，從用鴨坦布蘇病毒（例如，鴨坦布 蘇病毒TA株）免疫后的SPF鴨提取血清作為標(biāo)準(zhǔn)對照陽性血清；
[0027] (3)商購得到羊抗鴨酶標(biāo)二抗，例如，但不限于，KPL公司購買的HR羊抗鴨二抗 (貨號：04-25-06);
[0028] (4)配制樣品稀釋液、10 X濃縮洗液、TMB底物顯色液和終止液：
[0029] 樣品稀釋液：每個試劑盒裝量1瓶，250ml/瓶；10X濃縮洗液（100mm〇l/L PBST， pH7. 4)的配制過程如下：KH2P042. 6g，Na2HP04-12H2028. 9g，NaC187. lg，去離子水 800ml，調(diào) pH值至7. 4,添加去離子水至1L，在此溶液中添加5ml Tween-20。使用時10X濃縮洗液按 照1 : 9(V/V)稀釋獲得樣品稀釋液；
[0030] 包被液的配制：〇· 05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH值9. 6包被液的配制
[0031] 甲液：Na2C0310. 6g加去離子水溶解至500ml
[0032] 乙液：NaHC038 . 4g加去離子水溶解至500ml
[0033] 取甲液16ml，乙液34ml，加去離子水至200ml，即為0.05mol/L pH值9. 6碳酸鹽緩 沖液；
[0034] TMB底物顯色液購自天根公司，每個試劑盒裝量1瓶/盒50ml ;
[0035] 終止液：每個試劑盒裝量1瓶，250ml/瓶；終止液的配制：2mol/L硫酸溶液（2mol/ L H2S04)，濃硫酸溶液濃度為18mol/L，濃硫酸與去離子水按1 : 9配制即可成為2mol/L硫 酸溶液；
[0036] 封閉液的配制：KH2P040 . 26g，Na2HP04-12H202. 89g，NaC18. 71g，脫脂奶粉 50g，去離 子水800ml，調(diào)pH值至7. 4,添加去離子水至1L，在此溶液中添加0. 5ml Tween-20 ;
[0037] (5)組裝：將上述鴨坦布蘇病毒E蛋白包被的ELISA板與適量的（2)-⑷的成分 組裝成試劑盒。
[0038] 因此，本發(fā)明提供下列各項：
[0039] 1. 一種鴨坦布蘇病毒病E-ELISA檢測試劑盒，所述試劑盒包含標(biāo)準(zhǔn)陽性對照鴨血 清、標(biāo)準(zhǔn)陰性對照鴨血清、鴨坦布蘇病毒E蛋白所包被的ELISA板、羊抗鴨酶標(biāo)二抗及其他 試劑。
[0040] 2.第1項所述的試劑盒，其中所述標(biāo)準(zhǔn)陽性對照鴨血清為提取自用鴨坦布蘇病毒 免疫的SPF鴨的血清，所述標(biāo)準(zhǔn)陰性對照鴨血清為提取自SPF鴨的血清。
[0041] 3.第1項所述的試劑盒，其中所述鴨坦布蘇病毒E蛋白所包被的ELISA板通過用 在原核表達(dá)系統(tǒng)中重組表達(dá)的鴨坦布蘇病毒E蛋白包被ELISA板制得。
[0042] 4.第3項所述的試劑盒，其中所述鴨坦布蘇病毒E蛋白通過將SEQ ID No. 1所示 的編碼坦布蘇病毒E蛋白的核苷酸序列克隆在原核細(xì)胞表達(dá)載體中并在原核細(xì)胞中表達(dá) 制得。
[0043] 5.第1項所述的試劑盒，其中所述羊抗鴨酶標(biāo)二抗為HR標(biāo)記的羊抗鴨二抗。
[0044] 6.第1項所述的試劑盒，其中所述其他試劑包括樣品稀釋液、10X濃縮洗液、TMB 底物顯色液、終止液。
[0045] 7.第1項所述的試劑盒，所述試劑盒的檢測方法包括：
[0046] (1)反應(yīng)步驟：將待測鴨血清樣品、標(biāo)準(zhǔn)陽性對照鴨血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性對照鴨血清 分別加入所述鴨坦布蘇病毒E蛋白所包被的ELISA板的獨立的孔中，在37°C反應(yīng)lh ;
[0047] (2)與二抗反應(yīng)步驟：將每孔洗滌后，分別加入所述羊抗鴨酶標(biāo)二抗，在37°C反應(yīng) lh ;
[0048] (3)顯色步驟：將每孔洗滌后，分別加入TMB底物顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng)；
[0049] (4)讀數(shù)步驟：終止顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀數(shù)；
[0050] (5)判斷步驟：待測鴨血清樣品反應(yīng)孔的0D值與標(biāo)準(zhǔn)陰性對照鴨血清反應(yīng)孔的0D 值的比例大于等于2. 1時，表示待測鴨血清樣品為陽性，說明待測鴨感染了鴨坦布蘇病毒； 上述比值小于2. 1時，表示待測鴨血清樣品為陰性，說明待測鴨沒有感染鴨坦布蘇病毒。
[0051] 本發(fā)明的有益效果：
[0052] 與費時費力的現(xiàn)有檢測鴨坦布蘇病毒的方法相比較，利用本發(fā)明的試劑盒檢測鴨 坦布蘇病毒的方法具有下述優(yōu)點：
[0053] (1)省時，只須2小時，即可知道檢測結(jié)果；
[0054] (2)無需分離病毒，對待檢鴨血清直接進(jìn)行檢測，操作簡單；
[0055] (3)可以同時檢測多份樣品，進(jìn)行高通量檢測；
[0056] (4)本發(fā)明的試劑盒具有針對鴨坦布蘇病毒的高特異性，檢測不受其他病毒感染 的影響，準(zhǔn)確度高；

【專利附圖】

【附圖說明】
[0057] 從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點將更明顯，其中：
[0058] 圖1.純化的E蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析；泳帶1，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)； 泳帶2,純化的E蛋白；泳帶3,純化的E蛋白。

【具體實施方式】
[0059] 下面參照具體的實施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā) 明并不限于這些具體的實施例。
[0060] 下述實施例中所用的試劑如無特別說明，均為市售分析純級別的試齊IJ。
[0061] 實施例1.原核表達(dá)坦布蘇病毒E蛋白
[0062] 1)按TRIZ0L說明書提取鴨坦布蘇病毒TA株（由張云和劉明在山東泰安原始采 集，現(xiàn)保存于哈爾濱獸醫(yī)研究所）RNA，反轉(zhuǎn)錄后經(jīng)坦布蘇病毒E蛋白基因特異性引物P1和 P2 (TaKaRa公司合成）擴(kuò)增。1 %瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物，與原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a (購 自Novagen公司）連接獲得重組質(zhì)粒pET32-E。
[0063] 表1.擴(kuò)增坦布蘇病毒E蛋白基因的引物序列
[0064]

【權(quán)利要求】
1. 一種鴨坦布蘇病毒病E-ELISA檢測試劑盒，所述試劑盒包含標(biāo)準(zhǔn)陽性對照鴨血清、 標(biāo)準(zhǔn)陰性對照鴨血清、鴨坦布蘇病毒E蛋白所包被的ELISA板、羊抗鴨酶標(biāo)二抗及其他試 劑。
2. 權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述標(biāo)準(zhǔn)陽性對照鴨血清為提取自用鴨坦布蘇病毒 免疫的SPF鴨的血清，所述標(biāo)準(zhǔn)陰性對照鴨血清為提取自SPF鴨的血清。
3. 權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述鴨坦布蘇病毒E蛋白所包被的ELISA板通過用 在原核表達(dá)系統(tǒng)中重組表達(dá)的鴨坦布蘇病毒E蛋白包被ELISA板制得。
4. 權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中所述鴨坦布蘇病毒E蛋白通過將SEQ ID No. 1所示 的編碼坦布蘇病毒E蛋白的核苷酸序列克隆在原核細(xì)胞表達(dá)載體中并在原核細(xì)胞中表達(dá) 制得。
5. 權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述羊抗鴨酶標(biāo)二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鴨二抗。
6. 權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述其他試劑包括樣品稀釋液、10X濃縮洗液、TMB 底物顯色液、終止液。
7. 權(quán)利要求1所述的試劑盒，所述試劑盒的檢測方法包括： (1) 反應(yīng)步驟：將待測鴨血清樣品、標(biāo)準(zhǔn)陽性對照鴨血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性對照鴨血清分別 加入所述鴨坦布蘇病毒E蛋白所包被的ELISA板的獨立的孔中，在37°C反應(yīng)lh ; (2) 與二抗反應(yīng)步驟：將每孔洗滌后，分別加入所述羊抗鴨酶標(biāo)二抗，在37°C反應(yīng)lh ; (3) 顯色步驟：將每孔洗滌后，分別加入TMB底物顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng)； (4) 讀數(shù)步驟：終止顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀數(shù)； (5) 判斷步驟：待測鴨血清樣品反應(yīng)孔的0D值與標(biāo)準(zhǔn)陰性對照鴨血清反應(yīng)孔的0D值 的比例大于等于2. 1時，表示待測鴨血清樣品為陽性，說明待測鴨感染了鴨坦布蘇病毒；上 述比值小于2. 1時，表示待測鴨血清樣品為陰性，說明待測鴨沒有感染鴨坦布蘇病毒。
【文檔編號】G01N33/543GK104280551SQ201310290098
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月11日
【發(fā)明者】張云, 劉明, 陳志峰 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所