專利名稱：一種檢測(cè)鼠腺病毒的熒光定量pcr試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種檢測(cè)鼠腺病毒的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，同時(shí)還涉及SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒的應(yīng)用，該SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒可高效方便的對(duì)各種生物材料的小鼠源腺病毒進(jìn)行定量檢測(cè)和質(zhì)量監(jiān)控，也可以進(jìn)行鼠腺病毒的流行病學(xué)調(diào)查，還可以為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持，應(yīng)用前景十分廣泛。
背景技術(shù)：
鼠腺病毒(Murineadenovirusl, MAdV-1)屬腺病毒科(Adenoviridae)哺乳動(dòng)物屬(Mastad enovirus)。腺病毒無囊膜，病毒粒子為二十面體，直徑為80 IlOnm,由252個(gè)殼粒組成。一般感染哺乳動(dòng)物的腺病毒相對(duì)分子質(zhì)量為20 25X 106，G+C含量為48% 61%。腺病毒分布十分廣泛，一般對(duì) 于人體沒有致癌性，但是腺病毒容易導(dǎo)致呼吸道感染，如急性發(fā)熱性咽喉炎、咽結(jié)膜熱和肺炎等。鼠腺病毒可損害人類心血管組織，被懷疑為人類心臟損害的一種病原。因此，對(duì)小鼠慢性持續(xù)性鼠腺病毒感染診斷，對(duì)控制鼠腺病毒蔓延、防治具有積極意義。目前檢測(cè)技術(shù)一般來說有血清學(xué)診斷技術(shù)、生物學(xué)試驗(yàn)、分子生物學(xué)診斷技術(shù)三類:1、血清學(xué)診斷技術(shù)包括免疫熒光技術(shù)(IFA)、雙抗體夾心ELISA檢測(cè)等。但由于所有實(shí)驗(yàn)均用到抗血清和抗原免疫反應(yīng)，所以反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、材料多、準(zhǔn)備周期長(zhǎng)，而且檢測(cè)具有明顯的滯后性，只能定性不能定量，而且重復(fù)性差。2、生物學(xué)試驗(yàn)包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、雞胚接種和細(xì)胞培養(yǎng)。這種檢測(cè)方法存在不敏感問題，而且有些樣品存在抗補(bǔ)體活性，影響檢測(cè)效果。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成本較高、檢測(cè)周期長(zhǎng)，耗費(fèi)大量生物資源和人力物力。3、分子生物學(xué)診斷技術(shù)，即應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)鼠腺病毒持續(xù)感染。相比之下，PCR方法特異性好，檢測(cè)靈敏度高，不但可以檢測(cè)活病毒核酸，也能直接檢測(cè)滅活的核算片段。但普通的PCR檢測(cè)方法測(cè)定的都是PCR的終產(chǎn)物，而不是起始的DNA或RNA拷貝數(shù)。由于PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以無法定量起始的DNA或RNA拷貝數(shù)。近年發(fā)展起來的突光定量PCR技術(shù)(Fluorogenetic Quantitative PCR, FQ-PCR)有靈敏度高、速度快、特異性好等優(yōu)點(diǎn)。目前使用比較多的是SYBR Green I熒光染料法和Taqman法。兩種方法都具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、特異性好的優(yōu)點(diǎn)。在基因表達(dá)水平分析(N ellemann C, Vinggaard AM, Dalagaard M, et al.Quantification of AntiandrogenEffect Det ermined by Light Cycler Technology[J].Toxicology, 2001，163:29-38)、病原體的定性(Bhu devi B, Weinstock D.Fluorogenic RT-PCR assay (TaqMan)for Detection and Classificatio n of Bovine Viral Diarrhea Virus[J].Vet.Microbiol., 2001, 83:1-10.)和定量檢測(cè)(Kathy F.J.Tang, Jun Wang, DonaldV.Lightner.Quantitation of Taura syndrome virus by real-time RT-PCR witha TaqMan assay[J].J.Virol.Methods, 115(2004) 109-114.;Birgit Liss.1m provedquantitative real-time RT-PCR for expression profiling of individual cells[J].Nucle ic Acids Res. , 2002, Vol. 30No. 17e89. Florence KP, Glaucia PB, Mireille S, etal. Quantit ation of HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry[J]. J. Virol.Methods, 2001, 95:111-119.)等方面得到廣泛應(yīng)用，并且已成為當(dāng)前病毒核酸定量的主要方法。目前使用比較多的熒光定量PCR方法有SYBR Green I熒光染料法和TaqMan法，這兩種方法都具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、特異性好的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所采用的基于SYBR GreenI熒光染料技術(shù)的熒光定量PCR檢測(cè)方法其引物設(shè)計(jì)、合成更加簡(jiǎn)便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種檢測(cè)鼠腺病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒適用于目前市場(chǎng)上的所有類型熒光定量基因擴(kuò)增儀，結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好。靈敏度高、定量快速準(zhǔn)確、檢測(cè)范圍廣。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種鼠腺病毒的熒光定量PCR試劑盒在檢測(cè)(抗)鼠腺病毒藥物研究中的應(yīng)用，可對(duì)小鼠、大鼠細(xì)胞制品進(jìn)行定量檢測(cè)和質(zhì)量監(jiān)控，也可以進(jìn)行鼠腺病毒引起的流行病學(xué)調(diào)查，還可以為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持，應(yīng)用前景十分廣泛。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種檢測(cè)鼠腺病毒的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒含有a)DNA提取液、b)引物、c)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板、d) SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)液，其特征在于從細(xì)胞樣品中提取DNA，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，同時(shí)引入標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板，定量檢測(cè)未知樣品。引物序列分別為正義引物5’-ATAAGAAAGGATGCGGAAAAGGAC-3’，反義弓 I 物5 ’ -CCCAAAACAGAAGCAACAGAGTAA-3 ’，擴(kuò)增子大小為170bp。標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板由已插入鼠腺病毒保守的病毒核心DNA連接蛋白編碼`區(qū)170bp的pTA2載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α (本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌DH5ci為最常用于常規(guī)克隆應(yīng)用的大腸桿菌菌株。除支持藍(lán)/白篩選外,DH5 α的recAl和endAl突變可增強(qiáng)嵌入穩(wěn)定性并提高自minipreps制備的質(zhì)粒DNA質(zhì)量)，增殖后提取質(zhì)粒，并于紫外分光光度計(jì)測(cè)A26tl定量并10倍梯度稀釋。所述的DNA 提取液是由 5mL100mM Tris-HCl (ρΗ=8· 5)、0· 5mL0. 5M EDTA,lmL10%SDS、2mL5M NaCl、0. 25mL0. 2mg/mL 蛋白酶 K 和 41. 25mL 滅菌的雙蒸水組成。所述的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)液是由2XiTaq SYBR Green Supermix (with R0X)、10 μ M的正義引物和反義引物和滅菌的雙蒸水組成。所述的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板核苷酸序列為Ataagaaaggatgcggaaaaggaccgcatcgttgaagacataacaaattagtaaaaggtacaacataggatgtaaaatagccaatga ccatatgatcaccgcgcggacatgccgctcggagggttttgtgagctttttgcagaactttactctgttgcttctgttttggg。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板由含有插入目的片段的pTA2 (購(gòu)自Τ0Υ0Β0公司)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，增殖后提取質(zhì)粒，并于紫外分光光度計(jì)測(cè)A26tl定量并10倍梯度稀釋。實(shí)驗(yàn)所用的標(biāo)準(zhǔn)品制備過程為PCR反應(yīng)后，取適量產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增條帶單一，即可與ΙΟΧΑ-attachment Mix混合,于60°C反應(yīng)30min ;再與pTA2載體連接。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂平板培養(yǎng)，挑取白斑PCR鑒定陽(yáng)性后送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果將篩選的陽(yáng)性克隆菌接種到含氨芐抗性的LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。次日提取質(zhì)粒DNA，于紫外分光光度計(jì)測(cè)A26tl定量，并稀釋至梯度IO8-1O2拷貝/yL，-70°C保存。鼠腺病毒(Murine adenovirusl, MAdV-1),屬腺病毒科哺乳動(dòng)物腺病毒屬。無囊膜，病毒粒子為二十面體，直徑為80 llOnm，由252個(gè)殼粒組成。整個(gè)病毒粒子含蛋白87%，核酸13%。病毒核酸為單分子線狀雙鏈DNA，大小約30 38kb。鼠腺病毒不耐熱，50 56°C易于滅活，36°C以下病毒較穩(wěn)定。小鼠是鼠腺病毒的自然宿主，實(shí)驗(yàn)小鼠在籠內(nèi)主要經(jīng)糞便和尿液接觸傳播。不同毒株MAdV，其毒力差異很大，MAdV對(duì)不同年齡小鼠的易感性也不相同，臨床表現(xiàn)多種多樣。自然流行多由于感染FL株引起，病鼠表現(xiàn)弓背、被毛粗糙、食欲下降等癥狀，新生乳鼠可死亡。K87株感染新生乳鼠和成年鼠均不發(fā)病，只是經(jīng)糞便不斷向外排毒并產(chǎn)生高滴度的抗體。裸鼠也可自然發(fā)生MAdV感染，但株型未定。用FL株接種乳裸鼠，可造成十二指腸出血和致死性消耗性疾病。MAdV的感染對(duì)實(shí)驗(yàn)室小鼠和小鼠細(xì)胞生物工程制品具有潛在威脅，因此《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定對(duì)鼠源性生物制品必須檢測(cè)鼠腺病毒。一種檢測(cè)鼠腺病毒的熒光定量PCR試劑盒中，有非特異性熒光染料SYBR Green I。S YBR Green I是一種能夠與雙鏈DNA小溝結(jié)合的染料。沒有與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)，其熒光信號(hào)很弱，當(dāng)其與雙鏈DNA結(jié)合后熒光信號(hào)大大增強(qiáng)并能夠被儀器檢測(cè)。利用SYBR Gre en I這種特點(diǎn)可以檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。SYBR Green I的最大吸收波長(zhǎng)約為497nm，發(fā)射波長(zhǎng)最大約為520nm。SYBR Green I在核酸的實(shí)時(shí)檢測(cè)方面有很多優(yōu)點(diǎn)。它能夠與體系中所有的雙鏈DNA相結(jié)合，無需為不同的模板特殊定制，因此價(jià)格相對(duì)較低。此外，由于一個(gè)PCR產(chǎn)物可以與多個(gè)SYBR Green I染料相結(jié)合，因此靈敏度很高。對(duì)鼠腺病毒的定量可通過與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)閾值(Ct，Threshold Cycle)相比較得出。Ct值是PCR過程中，熒光量的積累超過基底熒光量的循環(huán)數(shù)，Ct值與起始模板數(shù)的常用對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系(log (起始模板數(shù))=Ct值/斜率+X軸截距)，Ct值越小，起始模板數(shù)越多，相反，Ct值越大，起始模板數(shù)越少。利用陽(yáng)性梯度標(biāo)準(zhǔn)模板的Ct值制 成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測(cè)樣品的Ct值可準(zhǔn)確測(cè)出該樣品的起始拷貝數(shù)。一種檢測(cè)鼠腺病毒的熒光定量PCR試劑盒中，針對(duì)鼠腺病毒的基因組的靶片段堿基排列的特殊性，將反映體系(引物濃度、擴(kuò)增程序等)優(yōu)化，并將Q-PCR技術(shù)和定量檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合，將其用于各種來源的鼠腺病毒樣品的定量檢測(cè)。通過優(yōu)化方案，建立了定量檢測(cè)鼠腺病毒的方法，并研制出鼠腺病毒定量檢測(cè)試劑盒，該試劑盒的靈敏度可在每個(gè)反應(yīng)體系中檢出1000個(gè)以下的病毒基因拷貝數(shù)，檢測(cè)范圍可以達(dá)到七個(gè)數(shù)量級(jí)。在本發(fā)明的另外一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種鼠腺病毒的熒光定量PCR試劑盒在檢測(cè)鼠腺病毒藥物研究中的應(yīng)用，其應(yīng)用過程包括下列步驟:A.用c)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板由插入目的片段的pTA2 (購(gòu)自Τ0Υ0Β0公司)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5CI，增殖后提取質(zhì)粒，并用紫外分光光度計(jì)定量；B.用a) DNA提取液從待測(cè)標(biāo)本中提取DNA ；C.熒光定量PCR由b)引物，d) SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)液，c)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板或所提取的標(biāo)本DNA組成，已加入了標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)品的突光定量反應(yīng)液PCR反應(yīng)體系上機(jī)，用熒光定量檢測(cè)儀進(jìn)行PCR檢測(cè)；D.通過比較待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)閾值，根據(jù)擬合所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)，并以此判斷待測(cè)樣品中是否含有鼠腺病毒。在本發(fā)明中提供的檢測(cè)鼠腺病毒的熒光定量PCR試劑盒可對(duì)各種來源的鼠腺病毒樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測(cè)，并可對(duì)小鼠制品和小鼠細(xì)胞進(jìn)行定量檢測(cè)和質(zhì)量監(jiān)控，也可以進(jìn)行鼠腺病毒引起的流行病學(xué)調(diào)查，還可以為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持，應(yīng)用前景十分廣泛。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果:1.與傳統(tǒng)定量方法相比，此實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有高靈敏性、高特異性和高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)，直接對(duì)PCR每循環(huán)一次就收集一個(gè)數(shù)據(jù)，建立實(shí)施擴(kuò)增曲線，準(zhǔn)確的確定Ct值，從而根據(jù)Ct值確定起始DNA拷貝數(shù)，做到了真正意義上的核算定量。2.與Taqman法相比,本實(shí)驗(yàn)采用SYBR Green I染料,通過融解曲線的分析可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、非特異性擴(kuò)增等，使結(jié)果更加可靠。SYBR Green I染料也大大降低了實(shí)驗(yàn)成本。3.檢測(cè)范圍廣，在108-102copies/reaction濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系(R=0.998)，檢測(cè)范圍可以達(dá)到七個(gè)數(shù)量級(jí)，其靈敏度可檢測(cè)lOOOcopies以下。4.該實(shí)時(shí)熒光定量PCR利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線，是迄今為止定量最準(zhǔn)確、重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn) ，廣泛用于基因表達(dá)研究、藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍，下列實(shí)施例中未注明的具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)條件如:J.薩姆布魯克主編，科學(xué)出版社，2002，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)；D.L.斯佩克特等主編，科學(xué)出版社，2001，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南；F.M.奧斯伯等主編，科學(xué)出版社，2005，精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南，或按照制造廠商建議的條件。實(shí)施例1:一種檢測(cè)鼠腺病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒組成及其反應(yīng)條件是:A)試劑盒組成如下:(10次反應(yīng)，檢測(cè)10份待測(cè)樣品)DNA提取液(IOmL/管)強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品(50 μ L/管)PCR反應(yīng)管(無菌)陰性標(biāo)準(zhǔn)品(50 μ L/管)臨界陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品(50 μ L/管)；強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，即拷貝數(shù)為108c/r的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板；陰性標(biāo)準(zhǔn)品，即未感染鼠腺病毒的L929細(xì)胞(鼠腺病毒的宿主細(xì)胞)DNA ；臨界陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，即拷貝數(shù)為102c/r的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板。SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)液(110 μ L/管)(d)SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)液，購(gòu)自Bio-rad公司)所述DNA 提取液(50mL)由 5mL100mM Tris-HCl (ρΗ=8.5)、0.5mL0.5M EDTA,lmL10%SDS、2mL5M NaCl、0.25mL0.2mg/mL 蛋白酶 K 和 41.25mL 滅菌的雙蒸水組成。B)突光定量反應(yīng)液(反應(yīng)總體積為 20 μ L):2X iTaq SYBR Green Supermix withROX,正義引物FP和反義引物RT各I μ L，待測(cè)樣品DNA或標(biāo)準(zhǔn)品I μ L，滅菌雙蒸水8 μ L。C)反應(yīng)條件如下:FQ-PCR:95°C，3min95°C, 15s60 °C, 45s40cycles在每個(gè)循環(huán)的第二步結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光檢測(cè)。對(duì)鼠腺病毒的定量可通過與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)閾值(Ct，Threshold Cycle)相比較并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)。D)熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)鼠腺病毒的靈敏度、檢測(cè)范圍及穩(wěn)定性:取c)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板稀釋至108-102c/n共8個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度三個(gè)重復(fù)，力口SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)液 2X iTaq SYBR Green Supermix with ROXlOu L，正義引物FP和反義引物RT各I μ L，待測(cè)樣品DNA或標(biāo)準(zhǔn)品I μ L，滅菌雙蒸水7 μ L0分別加入對(duì)應(yīng)編號(hào)的PCR反應(yīng)管，在熒光定量檢測(cè)儀上平行做PCR檢測(cè)。循環(huán)條件為:95°C 3min，95°C 15s，60°C45s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。把熒光檢測(cè)的程序設(shè)置在每個(gè)循環(huán)的第二步結(jié)束時(shí)進(jìn)行，檢測(cè)波長(zhǎng)為518nm。循環(huán)結(jié)束后，運(yùn)用儀器自帶的分析軟件，讀取待檢樣品拷貝數(shù)。結(jié)果為:
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)鼠腺病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒含有:a) DNA提取液、b)引物、c)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板、d) SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)液，其特征在于:從細(xì)胞樣品中提取DNA，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，同時(shí)引入標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板，引物序列分別為正義引物:5，-ATAAGAAAGGATGCGGAAAAGGAC _3 ’，反義引物:5 ’ -CCCAAAACAGAAGCAACAGAGTAA _3 ’，擴(kuò)增子大小為170bp，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板由已插入鼠腺病毒保守的病毒DNA連接蛋白編碼區(qū)170bp的pTA2載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，增殖后提取質(zhì)粒，并于紫外分光光度計(jì)測(cè)A26tl定量并10倍梯度稀釋。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)鼠腺病毒的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于:所述的 DNA 提取液是由 5mL IOOmM Tris_HClpH=8.5、0.5mL 0.5M EDTAUmL 10%SDS、2mL5MNaCl>0.25mL 0.2mg/mL蛋白酶K和41.25mL滅菌的雙蒸水組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)鼠腺病毒的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于:所述的 SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)液是由 2X iTaq SYBR Green Supermix UOyM的正義引物和反義引物和滅菌的雙蒸水組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)鼠腺病毒的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于:所述的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板核苷酸序列為:Ataagaaaggatgcggaaaaggaccgcatcgttgaagacataacaaattagtaaaaggtacaacataggatgtaaaatagccaatgaccatatgatcaccgcgcggacatgccgctcggagggttttgtgagctttttgcagaactttactctgttgcttctgttttgggo
5.權(quán)利要求1所述 的一種鼠腺病毒的熒光定量PCR試劑盒在檢測(cè)鼠腺病毒藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)鼠腺病毒的熒光定量PCR試劑盒及應(yīng)用，該試劑盒含有a)DNA提取液、b)引物、c)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板、d)SYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)液，其特征在于從細(xì)胞樣品中提取DNA，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，同時(shí)引入標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板，引物序列分別為正義引物5’-ATAAGAAAGGATGCGGAAAAGGAC-3’，反義引物5’-CCCAAAACAGAAGCAACAGAGTAA-3’，擴(kuò)增子大小為170bp，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板由已插入鼠腺病毒保守的病毒DNA連接蛋白編碼區(qū)170bp的pTA2載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，增殖后提取質(zhì)粒，并于紫外分光光度計(jì)測(cè)A260定量并10倍梯度稀釋。結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好。靈敏度高、定量快速準(zhǔn)確、檢測(cè)范圍廣。也可以進(jìn)行鼠腺病毒引起的流行病學(xué)調(diào)查，還可以為相關(guān)基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持，應(yīng)用前景十分廣泛。
文檔編號(hào)G01N21/64GK103215380SQ20131013159
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月16日
發(fā)明者肖庚富, 張哲 , 鄭從義 申請(qǐng)人:武漢珈創(chuàng)生物技術(shù)有限公司