專利名稱：一種測(cè)定維生素b12含量的色譜方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及保健食和藥品測(cè)試領(lǐng)域，尤其涉及測(cè)定保健食品和藥品中微量維生素B12含量的色譜方法。
背景技術(shù)：
維生素B12，是人體必需的微量營養(yǎng)成分之一，若攝取不足，則可能引起惡性貧血，骨髓變性，舌炎，神經(jīng)系癥狀，四肢僵硬，易受刺激，困倦，精神不振等。為補(bǔ)充人體所需要的維生素B12，目前許多保健食品添加維生素B12，但維生素B12在食品和一些基質(zhì)成分復(fù)雜的保健品中含量很低，這對(duì)維生素B12的測(cè)定造成很大困難。目前維生素B12的測(cè)定方法已有微生物分析法、分光光度法和色譜法。微生物法不能準(zhǔn)確區(qū)分維生素B12及其類似物，測(cè)定結(jié)果不精確，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，操作復(fù)雜，對(duì)人員技術(shù)要求高；分光光度法不適合復(fù)雜基質(zhì)的樣品，因?yàn)橛泻芏嘟M分光譜峰重疊，不是簡(jiǎn)單的幾次求導(dǎo)就能區(qū)分開來的；目前建立的色譜法主要是應(yīng)用高效液相色譜法(HPLC)，采用甲醇-水體系為流動(dòng)相，對(duì)維生素B12進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)出現(xiàn)維生素B12組分無法出峰或出峰不明顯無法達(dá)到測(cè)定要求的現(xiàn)象。較微生物法和分光光度法相比，已有的HPLC方法在一般檢測(cè)過程中提高了靈敏度和準(zhǔn)確度，但對(duì)于一些組分復(fù)雜且維生素B12含量低的保健品，t匕如只有幾個(gè)ppm，進(jìn)行測(cè)定時(shí)，需要對(duì)維生素B12進(jìn)行提前富集，若直接進(jìn)行采樣測(cè)定則導(dǎo)致無法找到對(duì)應(yīng)峰或出峰很小，重復(fù)性不高，從而達(dá)不到檢測(cè)要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種測(cè)定保健食品中維生素B12的色譜方法，通過選擇新型流動(dòng)相和與之配套的其他檢測(cè)條件，實(shí)現(xiàn)直接對(duì)復(fù)雜基質(zhì)保健食品和藥品中微量維生素B12含量的準(zhǔn)確測(cè)定和計(jì)算。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:一種測(cè)定保健食品中維生素B12的色譜方法，其特征在于包括以下步驟:(1)流動(dòng)相制備:稱取一定量的磷酸ニ氫鉀，置于容量瓶中，加去離子水溶解后，加85%磷酸配制濃度為0.04 M、pH為3.5±1.5的磷酸鉀鹽緩沖溶液，將上述緩沖溶液與甲醇按照緩沖溶液:甲醇=69:31的體積比的混合均勻，制成流動(dòng)相；(2)對(duì)照品溶液制備:采用USP標(biāo)準(zhǔn)品作為維生素B12對(duì)照品，精密稱定一定量的維生素B12對(duì)照品，用流動(dòng)相溶解，配制成濃度為0.01 mg/mL的儲(chǔ)備液，毎次試驗(yàn)前用流動(dòng)相稀釋儲(chǔ)備液，配制成濃度為I U g/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；(3)供試樣品溶液制備:取適量待測(cè)樣品，研成細(xì)粉，精密稱定約含有25 Ug維生素B12的樣品粉末，置于50mL棕色容量瓶中，精密加入25 mL流動(dòng)相溶解，用カ震搖，提取2分鐘，用0.45 um濾膜過濾；(4)色譜條件設(shè)定:
a.色譜柱:采用反相 C18 色譜柱,5 V- m , 250 mm X 4.6 mm ；b.流速:0.5-1.5 mL/min ；c.檢測(cè)器及檢測(cè)波長(zhǎng):ニ極管陣列檢測(cè)器，波長(zhǎng)為546 nm ；d.進(jìn)樣量:70-150 uL；e.柱溫:25-35 ° C ; (5)進(jìn)樣檢測(cè):通過供試樣品與對(duì)照品的保留時(shí)間和溶液峰面積關(guān)系，按如下方程計(jì)算供試樣品中維生素B12的含量:《 #= C對(duì)XA樣X 25/ A對(duì)Xm樣，其中co#為供試樣品中維生素B12的含量，單位為U g/g 為對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)濃度 メ w為對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積W#為供試樣品溶液峰面積為供試樣品的重量，單位為g。本發(fā)明所述的流動(dòng)相也可應(yīng)用磷酸鈉鹽和其他基質(zhì)配制緩沖溶液。本發(fā)明通過選擇新型流動(dòng)相和與之配套的其他檢測(cè)條件，實(shí)現(xiàn)直接對(duì)復(fù)雜基質(zhì)保健食品中微量維生素B12含量的準(zhǔn)確測(cè)定和計(jì)算，檢測(cè)結(jié)果色譜峰形好，抗干擾能力強(qiáng)，滿足實(shí)際測(cè)定要求。


圖1原有HPLC方法對(duì)照品色譜圖。圖2原有HPLC方法供試樣品色譜圖。圖3本發(fā)明對(duì)照品色譜圖。圖4本發(fā)明供試樣品色譜圖。
具體實(shí)施例方式參照附圖，一種測(cè)定保健食品中維生素B12的色譜方法，其特征在于包括以下步驟:(I)流動(dòng)相制備:稱取一 定量的磷酸ニ氫鉀，置于容量瓶中，加去離子水溶解后，加85%磷酸配制濃度為0.04 M、pH為3.5±1.5的磷酸鉀鹽緩沖溶液，將上述緩沖溶液與甲醇按照緩沖溶液:甲醇=69:31的體積比的混合均勻，制成流動(dòng)相；(2)對(duì)照品溶液制備:采用USP標(biāo)準(zhǔn)品作為維生素B12對(duì)照品，精密稱定一定量的維生素B12對(duì)照品，用流動(dòng)相溶解，配制成濃度為0.01 mg/mL的儲(chǔ)備液，每次試驗(yàn)前用流動(dòng)相稀釋儲(chǔ)備液，配制成濃度為I U g/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；(3)供試樣品溶液制備:取適量待測(cè)樣品，研成細(xì)粉，精密稱定約含有25 Ug維生素B12的樣品粉末，置于50mL棕色容量瓶中，精密加入25 mL流動(dòng)相溶解，用力震搖，提取2分鐘，用0.45 Pm濾膜過濾；(4)色譜條件設(shè)定:a.色譜柱:采用反相C18色譜柱，5 V- m , 250 mm X 4.6 mm ；b.流速:0.5-1.5 mL/min ；c.檢測(cè)器及檢測(cè)波長(zhǎng):ニ極管陣列檢測(cè)器，波長(zhǎng)為546 nm ；d.進(jìn)樣量:70-150 u L ；e.柱溫:25-35。C ; (5)進(jìn)樣檢測(cè):通過供試樣品與對(duì)照品的保留時(shí)間和溶液峰面積關(guān)系，按如下方程計(jì)算供試樣品中維生素B12的含量:《樣=C對(duì)XA樣X25/ A對(duì)Xm樣，其中《樣為供試樣品中維生素B12的含量，單位為y g/g 為對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)濃度#為對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積#為供試樣品溶液峰面積; #為供試樣品的重量，單位為g。所述的流動(dòng)相也可應(yīng)用磷酸鈉鹽和其他基質(zhì)配制緩沖溶液。具體實(shí)施時(shí)，原有HPLC方法對(duì)照品在保留時(shí)間t=10.2min附近的峰為維生素B12測(cè)定峰，供試樣品在保留時(shí)間t=10.2min附近沒有維生素B12測(cè)定峰；本發(fā)明對(duì)照品和供試樣品在保留時(shí)間t=6.5 min附近都出現(xiàn)明顯的維生素B12測(cè)定峰，可以順利而有效地實(shí)現(xiàn)測(cè)定。本發(fā)明除采用C18柱外，也可以采用類似的反相柱。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步的說明:
實(shí)施例:樣品中維生素B12含量的測(cè)定:
(I)流動(dòng)相準(zhǔn)備:稱取5.44 g KH2PO4,置于I L容量瓶中，加去離子水溶解后，用85%磷酸配制濃度為0.04 M、pH為3.5±1.5的磷酸鉀鹽緩沖溶液，量取310 mL甲醇和690 mL上述緩沖溶液混勻，用0.45 um微孔濾膜過濾、脫氣。(2)對(duì)照品溶液準(zhǔn)備:采用USP標(biāo)準(zhǔn)品作為維生素B12對(duì)照品。精密稱定一定量的維生素B12對(duì)照品，用流動(dòng)相溶解，配制成濃度為0.01 mg/mL的儲(chǔ)備液；每次試驗(yàn)前用流動(dòng)相稀釋儲(chǔ)備液，配制成濃度為I U g/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。(3)供試樣品處理:取不少于20片的樣品，研成細(xì)粉，精密稱定約含有25 y g維生素B12的樣品粉末，置于50mL棕色容量瓶中，精密加入25 mL流動(dòng)相溶解，用カ震搖，提取2分鐘，用0.45 um濾膜過濾。(4)進(jìn)樣檢測(cè):
對(duì)照品和供試樣品色譜圖如圖3和圖4所不，對(duì)照品和供試樣品保留時(shí)間在t=6.5 min附近的峰為維生素B12測(cè)定峰。通過供試樣品與對(duì)照品的保留時(shí)間和溶液峰面積關(guān)系，按如下方程計(jì)算供試樣品中維生素BI2的含量:《樣=C對(duì)XA樣X25/ A對(duì)Xm樣，其中《樣為供試樣品中維生素B12的含量，單位為y g/g 為對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)濃度 メ#為對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積 メ;if為供試樣品溶液峰面積為供試樣品的重量，單位為g。(5)對(duì)照品和供試樣品色譜圖如圖3和圖4所不，對(duì)照品和供試樣品保留時(shí)間在t=6.5 min附近的峰為維生素B12測(cè)定峰。多次實(shí)驗(yàn)證明該方法的線性范圍為:0.053 u g-0.16 ii g，方法檢出限為:
0.0il u g，加標(biāo)回收率為:82%-96%。事實(shí)證明本發(fā)明可以準(zhǔn)確測(cè)出相關(guān)樣品維生素B12達(dá)到測(cè)定要求的測(cè)定峰，滿足檢測(cè)的需要，并且色譜圖峰形好，而未用此方法處理的樣品無法找到測(cè)定峰或出峰很小，無法檢測(cè)出維生素B12的含量。本發(fā)明不僅限于保健品、藥品、膳食補(bǔ)充劑，也可以用于生物及其制品中微量維生素B12的測(cè)定，測(cè)定證實(shí)本發(fā)明靈敏度高、選擇性好、抗干擾 能力強(qiáng)。
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定保健食品中維生素B12的色譜方法，其特征在于包括以下步驟: (1)流動(dòng)相制備:稱取一定量的磷酸ニ氫鉀，置于容量瓶中，加去離子水溶解后，加85%磷酸配制濃度為0.04 M、pH為3.5±1.5的磷酸鉀鹽緩沖溶液，將上述緩沖溶液與甲醇按照緩沖溶液:甲醇=69:31的體積比的混合均勻，制成流動(dòng)相； (2)對(duì)照品溶液制備:采用USP標(biāo)準(zhǔn)品作為維生素B12對(duì)照品，精密稱定一定量的維生素B12對(duì)照品，用流動(dòng)相溶解，配制成濃度為0.01 mg/mL的儲(chǔ)備液，毎次試驗(yàn)前用流動(dòng)相稀釋儲(chǔ)備液，配制成濃度為I U g/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液； (3)供試樣品溶液制備:取適量待測(cè)樣品，研成細(xì)粉，精密稱定約含有25u g維生素B12的樣品粉末，置于50mL棕色容量瓶中，精密加入25 mL流動(dòng)相溶解，用カ震搖，提取2分鐘,用0.45 u m濾膜過濾； (4)色譜條件設(shè)定: a.色譜柱:采用反相C18色譜柱，5μ m , 250 mm X 4.6 mm ；b.流速:0.5-1.5 ml ,/mi n ； c.檢測(cè)器及檢測(cè)波長(zhǎng):ニ極管陣列檢測(cè)器，波長(zhǎng)為546nm； d.進(jìn)樣量:70-150u L ； e.柱溫:25-35° C ； (5)進(jìn)樣檢測(cè): 通過供試樣品與對(duì)照品的保留時(shí)間和溶液峰面積關(guān)系，按如下方程計(jì)算樣品中維生素B12的含量:《樣=C對(duì)XA樣X25/ A對(duì)Xm樣，其中《樣為待測(cè)樣品中維生素B12的含量，單位為y g/g 為對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)濃度 A對(duì)為對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積 A樣為樣品溶液峰面積M樣樣為樣品的重量，單位為g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ー種測(cè)定維生素B12含量的色譜方法，其特征在于:所述的流動(dòng)相也可應(yīng)用磷酸鈉鹽和其他基質(zhì)配制緩沖溶液。
全文摘要
一種測(cè)定保健食品中維生素B12的色譜方法，包括以下步驟(1)流動(dòng)相制備；(2)對(duì)照品溶液制備；(3)供試樣品溶液制備；(4)色譜條件設(shè)定；(5)進(jìn)樣檢測(cè)。本發(fā)明通過選擇新型流動(dòng)相和與之配套的其他檢測(cè)條件，實(shí)現(xiàn)直接對(duì)復(fù)雜基質(zhì)保健食品中微量維生素B12含量的準(zhǔn)確測(cè)定和計(jì)算，檢測(cè)結(jié)果色譜峰形好，抗干擾能力強(qiáng)，滿足實(shí)際測(cè)定要求。
文檔編號(hào)G01N30/89GK103091442SQ201210450129
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2012年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月13日
發(fā)明者盛潔, 鐘瑛瑛 申請(qǐng)人:江蘇艾蘭得營養(yǎng)品有限公司