檢測(cè)殘留齊帕特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒及其使用方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了檢測(cè)殘留齊帕特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒及其使用方法，屬于酶聯(lián)免疫吸附分析方法【技術(shù)領(lǐng)域】。所述試劑盒包括：包被齊帕特羅抗原的酶標(biāo)板、齊帕特羅標(biāo)準(zhǔn)品工作液、齊帕特羅抗體工作液、齊帕特羅酶標(biāo)二抗工作液、底物液、終止液、濃縮洗滌液和濃縮樣品稀釋液。本發(fā)明的試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)方法，標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣本殘留的齊帕特羅和酶標(biāo)板上預(yù)包被的抗原共同競(jìng)爭(zhēng)齊帕特羅抗體。該方法可以用于直接檢測(cè)動(dòng)物源性食品、尿樣、動(dòng)物組織和血清樣品中的齊帕特羅，具有方便、快速、靈敏等特點(diǎn)，適用于大批量樣品檢測(cè)，本試劑盒靈敏度0.1ng/mL。
【專(zhuān)利說(shuō)明】檢測(cè)殘留齊帕特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)動(dòng)物組織及其代謝物中齊帕特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于酶聯(lián)免疫吸附分析方法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA )【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明涉及用于檢測(cè)動(dòng)物源食品、血液及尿液中殘留的齊帕特羅的含量的酶聯(lián)免疫試劑盒及使用該試劑盒的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]β 2-腎上腺素受體激動(dòng)劑能增加肌肉/脂肪比，此類(lèi)物質(zhì)被用于動(dòng)物養(yǎng)殖中時(shí)，可明顯提高飼養(yǎng)動(dòng)物瘦肉率。但大量使用或長(zhǎng)期超量使用，且不遵守安全停藥期，則會(huì)在飼養(yǎng)動(dòng)物組織中蓄積，人食用了這種動(dòng)物組織后會(huì)引起中毒甚至死亡，因此很多國(guó)家和國(guó)際組織已經(jīng)禁止這類(lèi)化合物用于食品動(dòng)物飼養(yǎng)。齊帕特羅(ZilpateiOl)是一種新型β 2 -腎上腺素能激動(dòng)劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)(見(jiàn)式I)與常見(jiàn)的苯胺類(lèi)-腎上腺素類(lèi)激動(dòng)劑(克侖特羅和沙丁胺醇)和苯酚類(lèi)β -腎上腺素類(lèi)激動(dòng)劑(萊克多巴胺)是完全不同的，它的作用效果相當(dāng)于克侖特羅的十分之一，但比萊克多巴胺更有效。在墨西哥和南非齊帕特羅被允許作為宰殺期牛的飼料添加劑使用，但是在歐盟被明令禁止使用。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)殘留齊帕特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于包括酶標(biāo)板96孔、齊帕特羅標(biāo)準(zhǔn)品工作液、齊帕特羅抗體工作液、齊帕特羅酶標(biāo)二抗工作液、底物液、終止液、濃縮洗滌液和濃縮樣品稀釋液； 其中，所述酶標(biāo)板是包被齊帕特羅抗原的酶標(biāo)板，齊帕特羅抗原是用0.05 mo l/L pH.9.6的碳酸鹽包被緩沖液稀釋成1:8000比例，100 μL/孔，37°C，2h，取出4°C放置過(guò)夜；取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，用稀釋后的濃縮洗滌液300 μL/孔，洗板3次，1min/次；然后加入.0.5% BSA封閉，150 μL/孔，37°C放置2h ;取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，用潔凈的毛巾包裹后拍干板內(nèi)殘留液體；將拍干后的酶標(biāo)板整齊地?cái)[放置GMP車(chē)間恒溫25°C晾干；抽檢要求板內(nèi)孔與孔之間，板間的OD值變異系數(shù)均小于10% ;檢驗(yàn)合格后將酶標(biāo)板密封后置4°C下保存； 其中，所述齊帕特羅標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為O ng/mL、0.1 ng/mL、0.3 ng/mL、0.9 ng/mL、.2.7 ng/mL、8.1 ng/mL ； 其中，所述齊帕特羅抗體工作液是用抗體稀釋液稀釋成1:10000比例； 所述齊帕特羅酶標(biāo)二抗工作液是用酶標(biāo)二抗稀釋液稀釋成1:2000比例； 所述底物液包含0.05 mo l/L的NaHPO4.12Η20、0.025 mo l/L的一水檸檬酸(C6H8O7.Η20)、0.2 mmol/L的3, 3, 5, 5-四甲基聯(lián)苯胺_、0.5 mmol/L的過(guò)氧化氫脲和5%的N, N-二甲基甲酰胺； 所述終止液是2 mol/L的硫酸(H2SO4)； 所述濃縮洗滌液是20倍濃縮洗滌液，其包含0.05%吐溫-20，0.01 mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間； 所述濃縮樣品稀釋液是2倍濃縮稀釋液，其成分為0.01 mol/L, pH7.4磷酸鹽PBS緩沖液。
2.權(quán)利要求1所述檢測(cè)殘留齊帕特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒的使用方法，其特征在于該方法包括以下步驟: (1)預(yù)處理待測(cè)樣品，即將待測(cè)試的樣品處理為液體樣品，或者用有機(jī)溶劑提取待測(cè)樣品，氮?dú)獯蹈刹⑵鋸?fù)溶于樣品稀釋液工作液中； (2)將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫20~25°C平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻； (3)取包被齊帕特羅抗原的酶標(biāo)板，加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μL7孔到對(duì)應(yīng)的微孔中； (4)加入齊帕特羅抗體工作液，50μL7孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)30 min ； (5)小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250μL7孔，充分洗滌4飛次，每次間隔10 S，用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭戳破； (6)加入齊帕特羅酶標(biāo)二抗100μL7孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)30 min，取出重復(fù)洗板步驟(5); (7)加入底物液100μL7孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng).15 ~20 min ； (8)加入終止液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處或雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè),測(cè)定每孔吸光度值,在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)；(9)以標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試的吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品的濃度對(duì)數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中齊帕特羅的含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測(cè)殘留齊帕特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒的使用方法，其特征在于其中在步驟(3)中，齊帕特羅標(biāo)準(zhǔn)品和處理好的樣品同時(shí)添加到對(duì)應(yīng)微孔中。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測(cè)殘留齊帕特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒的使用方法，其特征在于其中所述處理后的樣品是經(jīng)過(guò)以下處理的樣品: 尿樣取待檢尿樣，若樣品比較混池時(shí)，可5000 r/min以上,離心5 min或過(guò)濾。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測(cè)殘留齊帕特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒的使用方法，其特征在于其中所述處理后的樣品是經(jīng)過(guò)以下處理的樣品: 血清取待檢血清樣，若樣品比較混池時(shí)，可5000 r/min以上,離心5 min或過(guò)濾。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測(cè)殘留齊帕特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒的使用方法，其特征在于其中所述處理后的樣品是經(jīng)過(guò)以下處理的樣品: 對(duì)于豬肉、豬肝 準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0±0.05 g勻漿樣品至50 mL離心管中； (1)先加入3%三氯乙酸4mL，用渦旋儀渦動(dòng)至均勻后再加入2mL乙腈并充分振蕩搖勻；
(2)4000r/min 離心 10 min ； (3)取上清液3mL至另一離心管中，向其內(nèi)加入1 mol/LNa2C03溶液400 μ?,并混勻調(diào)節(jié) pH 值至 9.8±0.2 ； (4)加入5mL乙酸乙酯,振蕩30 s,4000 r/min離心5~10 min ;取3 mL上層液體于5(T60°C氮?dú)饬飨麓蹈桑? (5)加入ImL稀釋后的樣品稀釋液并充分振蕩搖勻； (6)取50KL用于分析。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述檢測(cè)殘留齊帕特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒的使用方法，其特征在于其中的樣品稀釋液用去離子水將齊帕特羅濃縮樣品稀釋液按1:1體積比進(jìn)行稀釋?zhuān)?1份齊帕特羅濃縮樣品稀釋液+1份去離子水。
【文檔編號(hào)】G01N33/543GK103808921SQ201210438110
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月6日
【發(fā)明者】杜道林, 洪霞 申請(qǐng)人:江蘇維賽科技生物發(fā)展有限公司