一種檢測Tim-3的ELISA試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測Tim-3蛋白的ELISA試劑盒及其使用方法。本發(fā)明還公開了所述ELISA試劑盒中抗人Tim-3中和性單克隆抗體L3C的序列及制備過程，本發(fā)明還公開了檢測人Tim-3蛋白的ELISA試劑盒的特異性和靈敏度。本發(fā)明公開的檢測Tim-3蛋白的ELISA試劑盒能夠準確檢測出樣品中Tim-3的含量，其靈敏度達到1ng/ml。
【專利說明】—種檢測Tim-3的ELISA試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種ELISA試劑盒，具體而言涉及檢測人Tim-3的ELISA試劑盒，還涉及該ELISA試劑盒中Tim-3單克隆抗體的制備和試劑盒的使用方法。
【背景技術】 [0002]Tim-3在結構上屬于T細胞免疫球蛋白及粘蛋白(T cell Immunoglobulindomainand Mucin domain protein, Tim)家族成員。由于Tim家族廣泛參與了機體的免疫調(diào)節(jié)過程，其功能正日益受到人們的重視。Tim-3特異性表達于活化的Thl、Thl7效應細胞表面，而不表達于Th2細胞。現(xiàn)已知半乳糖結合蛋白-9 (Galectin-9, Gal-9)為Tim_3的天然配體，該分子廣泛表達于外周免疫系統(tǒng)，Gal-9與Thl、Thl7細胞上的Tim_3分子特異性結合，可引發(fā)后者的調(diào)亡，下調(diào)免疫反應，誘導免疫耐受。除了膜結合形式的Tim-3分子，可溶性的Tim-3分子是否，以及如何影響免疫調(diào)節(jié)過程是目前尚不清楚的內(nèi)容。目前，研究證實Tim-3分子主要通過調(diào)節(jié)不同CD4+ T細胞亞群的功能廣泛參與了自身免疫病、移植排斥、抗感染等免疫應答過程[Anderson DE.TIM-3 as a therapeutic target inhumaninflammatory diseases.Expert OpinTher Targets.2007 ；11 (8): 1005-9.Anderson AC,Anderson DE.TIM-3 in autoimmunity.CurrOpinImmuno1.2006 ；18(6):665-9.DegauqueN,Mariat C,Kenny J,et al.Regulation of T~celI immunity by T—cell immunoglobulinand mucin domain proteins.Transplantation2007 ；84:S12-16.Zhu C, Anderson AC,Schubart A,et al.The Tim-3 ligand galectin-9negatively regulates T helper typeI immunity.Nat Tmmunol 2005;6:1245-1252.]。
[0003]目前的研究證實Tim-3表達的異常與許多疾病有密切的關系，如研究發(fā)現(xiàn)HIV，HCV感染的患者以及一些腫瘤患者，其T細胞上Tim-3表達升高，由于Tim-3能介導T效應細胞的調(diào)亡，傳遞負性調(diào)節(jié)信號，可導致機體的免疫功能癱瘓。任何阻斷Tim-3/Gal-9結合的因素均可以使Thl、Thl7細胞避開死亡，增強T效應細胞的活性，恢復免疫功能[Kassu A, Marcus RA, D' Souza MB, et al.Regulation ofVirus-Specific CD4+ T CellFunction by Multiple Costimulatory Receptors duringChronic HIV Infection.1mmunol.2010 ; 185 (5):3007-18.Huang X, et al.Lymphomaendothelium preferentiallyexpresses Tim-3 and facilitates the progression oflymphoma by mediating immuneevasion.Exp Med.2010 ；207 (3):505.N.Castelblanco, V.Kuchroo, D.R.Gretch, andH.R.Rosen.2009.Negative immuneregulator Tim-3 is overexpressed on T cells inhepatitis C virus infection and itsblockade rescues dysfunctional CD4+ andCD8+T cells.Virol.83:9122-9130.]。
[0004]一方面，在一些自身免疫病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、哮喘等疾病中，由于Gal-9或Tim-3表達的升高，導致Thl細胞的功能受到抑制，進而打破體內(nèi)的免疫平衡，引起病理性的Th2細胞的活性增強，導致疾病的發(fā)病。在這種情況下，任何阻斷Tim-3/Gal-9結合的因素均能有利于體內(nèi)免疫平衡的恢復，緩解疾病的進程。如給哮喘模型動物注射抗Tim-3抗體或重組Tim-3融合蛋白均能通過阻斷Tim-3/Gal_9結合，增強Thl細胞活性，糾正由Th2細胞介導的哮喘癥狀，恢復體內(nèi)Thl/Th2細胞平衡[Hu WK，Lu XX，Yang S etal.Expression of theThl—specific cell—surface protein Tim-3 increases in amurine model of atopicasthma.Asthma.2009 ；46 (9):872.Pan HF，Zhang N，Li WX, TaoJH, Ye DQ.TIM-3as a new therapeutic target in systemic lupus erythematosus.Mol Biol Rep.2010 ；37 (I):395-8.Wang Y，Meng J, Wang X, Expression of humanTIM-1 and TIM_3on lymphocytes from systemic lupus erythematosus patients.Scand Immunol.2008 ；67 (I):63-70.Kearley J，McMillan SJ, Lloyd CM.Th2_driven，allergen-1nducedairway inflammation is reduced after treatment with ant1-Tim-3antibody in viv0.ExpMed 2007 ；204:1289 ；Fukushima A，Sumi T，F(xiàn)ukuda K，Kumagai N，et al.Antibodiesto T-cell Ig and mucin domain-containing proteins(Tim)-1 and-3 suppress theinduction and progression of murine allergic conjunctivitis.Biochem Biophys ResCommun.2007 ；353 (I):211.]。另一方面，在一些自身免疫病如炎性腸病以及I型糖尿病模型中，研究發(fā)現(xiàn)阻斷Tim-3的活性增強了體內(nèi)Thl效應細胞的功能，進一步加重了自身免疫損傷，該結果再次證明Tim-3在體內(nèi)免疫平衡的維持中發(fā)揮重要作用[Sanchez-Fueyo A，Tian J，Picarella D，et al.Tim-3 inhibits T helpertype1-mediated auto- and alloimmune responses and promotes immunologicaltolerance.Nat Immunol 2003 ;4:1093-1101.Li X，et al.Clinical Immunol.2010，134:169-177.]。[0005]上述研究資料表明，Tim-3通路具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能，其表達的異常與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切關系。盡管研究表明Tim-3的中和抗體也在一些疾病模型中發(fā)揮了很好的干預作用，但目前國內(nèi)外尚沒有上市的Tim-3抗體，因此建立和發(fā)展具有自主知識產(chǎn)權的以抗體為基礎的檢測和診治用品，對于多種相關性疾病的干預具有重要的現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為解決上述問題，本發(fā)明公開了一種檢測Tim-3蛋白的ELISA試劑盒及其使用方法，所述試劑盒能夠準確檢測出樣品中的Tim-3蛋白含量。本發(fā)明還公開了試劑盒中抗Tim-3抗體的序列及其制備方法。
[0007]本發(fā)明公開了一種抗人Tim-3的單克隆抗體L3C，所述單克隆抗體包括輕鏈和重鏈，其氨基酸可變區(qū)序列分別如序列表中SEQ ID N0:U SEQ ID NO:2所示，其編碼基因分別如序列表中SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。
[0008]本發(fā)明所述的單克隆抗體的輕鏈蛋白質分子可變區(qū)的互補決定區(qū)⑶R1、⑶R2、CDR3的氨基酸序列，分別如序列表中SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示。所述單克隆抗體的重鏈蛋白質分子可變區(qū)的互補決定區(qū)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分別如序列表中 SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO:10 所示。
[0009]本發(fā)明還公開了上述單克隆抗體L3C的制備方法，主要包括如下:
[0010]1.抗人Tim-3單克隆抗體雜交瘤細胞株的構建
[0011]首先，原核表達人Tim-3蛋白，免疫Balb/c小鼠，用常規(guī)方法進行細胞融合。用間接ELISA法篩選陽性細胞克隆再反復亞克隆，直到所有雜交瘤細胞培養(yǎng)上清檢測為100%陽性。對雜交瘤細胞L3C進行了染色體核型分析，雜交瘤細胞L3C染色體平均數(shù)目為106條，用雙相瓊脂擴散實驗證明L3C雜交瘤細胞所分泌的免疫球蛋白亞型為IgG2a。
[0012]2.雜交瘤細胞L3C輕、重鏈基因的釣取
[0013]提取中和性單克隆抗體L3C細胞的RNA，經(jīng)RT-PCR，用特異性引物釣取抗體的輕重鏈基因。常規(guī)法連接入載體，轉化感受態(tài)細菌，培養(yǎng)后挑取單個菌落，提取質粒PCR鑒定后進行DNA測序分析。
[0014]通過上述步驟，構建了含有人Tim-3中和抗體L3C輕、重鏈基因的載體，經(jīng)序列分析、比對，編碼序列為小鼠免疫球蛋白輕、重鏈基因，其氨基酸序列分別為SEQ ID N0:1和SEQ ID NO:2o
[0015] 3.單克隆抗體L3C輕、重鏈可變區(qū)基因序列和氨基酸序列的確定
[0016]用WWW.expasy.0rg在線軟件將編碼人Tim_3中和性單克隆抗體L3C的輕、重鏈可變區(qū)核苷酸序列翻譯為其編碼的氨基酸序列，單克隆抗體L3C的輕、重鏈可變區(qū)氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。根據(jù)Kabat數(shù)據(jù)庫確定輕鏈可變區(qū)序列中的互補決定區(qū)CDRl、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別如序列表中SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6和SEQ ID N0:7所示。重鏈可變區(qū)序列中的互補決定區(qū)⑶R1XDR2和⑶R3的氨基酸序列分別如序列表中SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。
[0017]本發(fā)明應用一套設計的引物成功地從培養(yǎng)的人Tim-3中和性單克隆抗體L3C雜交瘤細胞中克隆了抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。所得輕鏈和重鏈可變區(qū)基因可編碼正確的小鼠抗體可變區(qū)。本發(fā)明的單克隆抗體基于上述已克隆到的人Tim-3中和性單克隆抗體L3C輕、重鏈可變區(qū)基因，可構建和表達多種小分子基因工程抗體，如單鏈抗體、單域抗體、嵌合抗體、Fab抗體、抗體融合蛋白等；基于上述基因所編碼的多肽或蛋白質，可以交聯(lián)上多種生物活性分子，制備用于Tim-3表達水平檢測、診斷和治療Tim-3高表達所導致疾病的診斷或治療藥物。
[0018]本發(fā)明基于L3C抗體構建了用于檢測Tim-3的ELISA試劑盒，所述的ELISA試劑盒包括:rhGal-9蛋白、抗Tim_3抗體L3C、HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體、辣根過氧化物酶底物緩沖液、蛋白標準品人Tim-3(100ug/ml，0.1ml)、陰性對照樣品BSA。
[0019]本發(fā)明還公開了檢測Tim-3的ELISA試劑盒的使用方法:
[0020]I)包被重組人rhGal-9蛋白(10ug/ml)到高親和力ELISA板中，4°C過夜后用含
0.2%吐溫的PBS緩沖液洗滌5次；
[0021]2)按合適的稀釋度(1: 2~1: 10)稀釋正常人或患者的血漿，加入到包被有rhGal-9的ELISA板條中，37°C孵育I小時，用含0.2%吐溫的PBS緩沖液洗滌5次；
[0022]3)加入抗人Tim-3的抗體L3C，37°C孵育I小時，用含0.2%吐溫的PBS緩沖液洗滌5次；
[0023]4)最后加入羊抗小鼠HRP標記的抗體，37度孵育0.5小時，用含0.2%吐溫的PBS緩沖液洗滌5次；
[0024]5)最后加入TMB顯色，2N硫酸終止后檢測0D450的值。
[0025]通過分析0D450值的大小，判斷人血清中Tim_3濃度。
[0026]本發(fā)明還對單克隆抗體L3C的靈敏性進行了檢測，結果顯示本發(fā)明的試劑盒能夠靈敏的檢測樣品中Tim-3的含量，其靈敏度能夠達到lng/ml?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0027]圖1抗Tim-3抗體L3C的蛋白電泳圖。
[0028]圖2 L3C抗體特異性檢測結果，用L3C抗體檢測不同濃度的Tim-3-Trx和Trx，L3C抗體特異性的結合Tim-3-Trx中的Tim_3。
[0029]圖3 L3C抗體靈敏性檢測結果，用L3C抗體和mlgG檢測不同濃度的Tim-3-Trx，L3C抗體對Tim-3的檢測靈敏度達到lng/ml。
[0030]圖4檢測Tim-3的ELISA試劑盒的設計原理，以Tim_3的配體rhGal-9為包被蛋白，以抗人Tim-3抗體為檢測抗體，檢測樣品中Tim-3的含量。
[0031]圖5 rhGal-9蛋白的SDS電泳圖。
[0032]圖6 rhGal-9蛋白與Tim_3的結合活性檢測，rhGal-9能特異性的與重組人Tim-3 (rh Tim-3)結合。
[0033]圖7 rhGal-9蛋白誘導淋巴細胞凋亡的活性檢測，rhGal-9蛋白能特異性結合THPl細胞的Tim-3，誘導THPl細胞凋亡。
[0034]圖8檢測Tim-3的ELISA試劑盒的臨床樣品檢測，膿毒血癥患者血清(sepsislsepsis2)中Tim-3的含量明顯少于正常人血清(Health control)中Tim-3的含量。
【具體實施方式】
[0035]通過參閱下述實施例可以更容易地了解本發(fā)明的內(nèi)容，這些實施例只是為進一步說明本發(fā)明，并不意味著限定本發(fā)明的范圍。
[0036]實施例一抗人Tim-3單克隆抗體雜交瘤細胞株的構建
[0037]1.材料
[0038]福氏完全佐劑及福氏不完全佐劑，顯色試劑TMB =Sigma公司產(chǎn)品；20%胎牛血清:北京元亨圣馬生物技術研究所產(chǎn)品；無血清RPMI 1640 =Gibco公司產(chǎn)品；SP2/0細胞:ATCC引進，軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所保存；Balb/c以及C57BL/6小鼠:軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供；其余試劑均為市購。
[0039]2.方法和結果
[0040](l)Balb/c小鼠免疫。選用4~6周齡的雌性Balb/c小鼠6只,用100 μ g ricin于腹股溝皮下免疫，第一針加福氏完全佐劑，第二針加福氏不完全佐劑，每3周免疫I次，共免疫3次。第3次免疫后尾靜脈采血，用間接ELISA檢測抗體產(chǎn)生情況，在融合前3天，以100 μ g ricin腹腔加強免疫一次,第3天融合。
[0041](2)細胞融合。將免疫的小鼠摘眼球后脫頸處死，無菌摘取小鼠脾細胞，按常規(guī)方法進行細胞融合。具 體方法為:①將免疫的小鼠摘眼球放血后脫頸處死，75%酒精浸泡3min，無菌取出脾臟，用200目鋼網(wǎng)研磨單個細胞懸液，無血清RPMI 1640洗兩次并記數(shù)收集對數(shù)生長期的SP2/0細胞，用無血清RPMI1640洗兩次并記數(shù)；③按SP2/0細胞:脾細胞=1: 5的比例混合兩種細胞，用RPMI 1640洗I次，棄盡上清，輕輕將細胞打散；④在Imin時間里緩慢加入lml50% PEG(Mw為1500)溶液，置37°C水浴Imin ;⑤在lmin、2min、5min時間內(nèi)加無血清RPMI1640 1ml、5ml、10ml、IOml !⑥800r/min離心7min,棄上清,盡可能輕地將細胞懸起；⑦加含20% FCS的HAT(Sigma)-RPMI 1640培養(yǎng)液，調(diào)整細胞濃度為2 X 106/ml，混勻后滴加在鋪有滋養(yǎng)細胞(IX IO4細胞/孔)96孔培養(yǎng)板(Gibco)中，100 μ I/孔，置于37°C的5% CO2孵箱中培養(yǎng)。
[0042](3)用間接ELISA篩選抗人Tim_3單克隆抗體雜交瘤細胞。用10 μ g/ml重組人Tim-3 (rhTim-3)包被ELISA板，于4°C過夜并封閉。依次加入待測細胞培養(yǎng)上清液(37°Clh，PBST洗板4次)，以及 1: 500 稀釋的 50 μ I HRP_GAM(37°C 45min，PBST 洗板 4 次)。以TMB底物顯色后，于450nm波長測定OD值。
[0043](4)雜交瘤細胞克隆化。用間接ELISA法篩選陽性的細胞克隆再反復亞克隆，直到所有雜交瘤細胞培養(yǎng)上清檢測為100%陽性。雜交瘤細胞的克隆化用有限稀釋法:①在克隆化的當天或前I天制備滋養(yǎng)細胞:脫頸處死昆明小鼠，75%酒精浸泡消毒皮膚，無菌剝離腹部皮膚，注射器抽取5ml 1640培養(yǎng)液注入小鼠腹腔，反復沖洗后吸出腹腔洗液，用加20%胎牛血清的1640培養(yǎng)液稀釋后滴入96孔板，每孔約0.1ml0②取少許待作克隆化的雜交瘤細胞移至另一無菌試管中，并準確計數(shù)。③有限稀釋法進行亞克隆。④將培養(yǎng)板置于37°C的5% C02孵箱中培養(yǎng)，約5天后在顯微鏡下可觀察到細胞克隆。適時換液，檢測，取陽性單克隆細胞株進行擴大培養(yǎng)，及時凍存細胞株。
[0044](5)雜交瘤細胞免疫球蛋白亞型的確定。用羊抗鼠IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3，就雜交瘤細胞濃縮后的培養(yǎng)上清作雙相瓊脂擴散實驗，結果表明雜交瘤細胞培養(yǎng)上清只能與羊抗鼠IgG2a抗體形成結合條帶，證明L3C雜交瘤細胞所分泌的免疫球蛋白亞型為IgG2a，通過上述步驟，篩選到人Tim-3單克隆抗體L3C。
[0045]實施例二人Tim-3中和性單克隆抗體雜交瘤細胞L3C輕、重鏈基因的釣取
[0046]1.材料
[0047]I)輕鏈上下游引物`
[0048]輕鏈上游引物MuLC5、MuLC6和MuLC7，其序列分別見序列表SEQ ID NO =IUSEQ IDN0:12和SEQ ID NO:13 ;輕鏈下游引物MuCK，其序列見序列表SEQ ID N0:14，引物在PCR擴增時的使用濃度為IOpM/μ I。
[0049]2)重鏈上下游引物
[0050]重鏈上游引物MuHC5、MuHC6、MuHC7 和 MuHC8，其序列見序列表 SEQ IDNO:15、SEQID NO 16、SEQ ID 17 和 SEQ ID 18 ;重鏈下游引物 MuIgG2a 見序列表中 SEQ ID N0:19，引物在PCR擴增時的使用濃度為IOpM/μ I。
[0051]3) DNA片段純化試劑盒:0MEGA生物科技公司產(chǎn)品；T4 DNA連接酶:New EnglandBiolabs產(chǎn)品；載體PGEM Teasy:Promega公司產(chǎn)品；感受態(tài)細菌JM109:購自Promega公司。其余同實施例一。
[0052]2.方法結果
[0053](I)取對數(shù)生長期的中和性單克隆抗體L3C細胞5X (IO6~IO7)個，離心去除上清，將細胞均勻彈起。加Iml TRIzol (Invitrogen)反復吹打使細胞充分裂解,振蕩5分鐘后，加入0.2ml氯仿，振蕩15秒，室溫放置2~3min，2°C~8°C 12000r/min，離心15分鐘，取上清于另一新管中，加500 μ I異丙醇混勻后室溫放置10分鐘，2°C~8°C 12000r/min離心lOmin。75%乙醇洗滌沉淀，干燥后，用20 μ I無RNA酶的去離子水溶解沉淀。
[0054](2)取含RNA 的溶液，依次加入 AMV5X 緩沖液 4 μ 1，Oligo (dT) (500ng/μ 1)0.5μ 1,2.5mmol/L dNTP2 μ 1，Rnasin (50U/μ 1)0.5 μ I，補去離子水至 20 μ 1、反轉錄酶2~5U，42°C延伸I小時。95°C變性5min，置冰浴中，產(chǎn)物為cDNA第一鏈。分別用特異性引物擴增輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)。
[0055]輕鏈可變區(qū)擴增體系:反轉錄產(chǎn)物2 μ 1，Taq酶IOXbuffer 2 μ 1，輕鏈上游引物MuLC5、MuLC6 和 MuLC7 各 I μ 1，下游引物 MuCK 3 μ 1,2.5mmol/L dNTP 4 μ 1，加 Taq 酶 I ~2U，補去離子水至50μ 1。951:變性2分鐘，循環(huán)參數(shù)為:94°C lmin，55°C lmin，72°C lmin，共30個循環(huán)，72°C后延伸lOmin。
[0056]重鏈可變區(qū)擴增體系:反轉錄產(chǎn)物2 μ 1，Taq酶IOXbuffer 2 μ 1，重鏈上游引物MuHC5、MuHC6、MuHC7 和 MuHC8 各 I μ I，下游引物 MuIgG2a 3 μ I，2.5mmol/LdNTP 4 μ I，加Taq酶I~2U，補去離子水至50μ I。95°C變性2分鐘，循環(huán)參數(shù)為:94°C lmin，55°C lmin,72°C lmin，共 30 個循環(huán)，72°C后延伸 lOmin。
[0057](3)用分離出欲回收的DNA片段，在長波紫外光下切下含目的DNA片段的膠塊，放入離心管中，加入三倍膠體積的化膠液，55°C水浴完全溶解膠塊。用DNA片段純化試劑盒回收DNA片段并將純化的DNA片段在水溶液里，將回收的PCR產(chǎn)物在T4 DNA連接酶緩沖液中按2: I的比例(摩爾比)和載體PGEMTeasy混合后，加入0.5U的T4 DNA連接酶于16°C連接過夜，連接反應的總體積為10 μ L。
[0058](4)取連接液10 μ 1，加于200 μ I感受態(tài)細菌JM109中并輕柔混勻，冰浴30min，42 °C水浴熱休克90秒，迅速轉入冰浴2min，加800 μ I LB培養(yǎng)基，轉入37 °C恒溫搖床，以150r/min的速度搖動45min, 4000r/min離心lmin,棄去800 μ I上清,取沉淀涂布于含Amp (終濃度為100 μ g/ml)的固體LB平板，將平板倒置于37°C孵箱12~18h。
[0059](5)在上述平板 中挑取單個克隆，接種于含氨卞青霉素(100 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基中。37°C恒溫搖床170rpm，震蕩培養(yǎng)過夜。取3ml菌液加入1.5mlEppendorf管中，1000Or/min離心lmin，棄上清。將沉淀菌體重懸于100 μ L溶液I中，加新鮮配制的溶液ΙΙ200 μ L，輕緩地上下顛倒數(shù)次，至液體變清澈為止。隨后，再加入150 μ L溶液III，輕柔地上下顛倒數(shù)次使液體混勻，此時出現(xiàn)大量白色絮狀沉淀。4°C，12000r/min離心5min，取上清加至另一 Eppendorf管中，加入等體積的Tris-HCl飽和酹，劇烈震蕩后，12000rpm離心5min,將上層水相移至一新管中。再加入500 μ L氯仿，重新抽提一次。其后，小心吸取上層水相，移至一新管中，加2倍體積的無水乙醇混勻，于_20°C放置3h。4°C, 12000rpm離心lOmin,棄上清，用70%乙醇洗沉淀2次，室溫干燥20min，以40 μ L無菌雙蒸水溶解，進行PCR鑒定及DNA測序分析。
[0060]通過上述步驟構建了含有人Tim-3中和抗體L3C輕、重鏈基因的載體，經(jīng)測序分析、序列比對為小鼠免疫球蛋白輕、重鏈基因，其對應的氨基酸序列分別為SEQ ID NO=USEQ ID NO:2o
[0061]實施例三單克隆抗體L3C的Protein A純化及其特異性及靈敏性檢測
[0062]1.材料
[0063]Protein A Sepharose CL 4B柱蛋白柱:北京本元正陽生物技術有限公司產(chǎn)品；其余同實施例一。
[0064]2.方法和結果
[0065](I)單克隆抗體L3C的純化[0066]將含有人Tim-3中和抗體L3C輕、重鏈基因的載體轉入哺乳動物細胞中，進行表達。收集表達上清，加入ImL pH 8.0，0.1moL/L磷酸緩沖液并用pH9.0，lmoL/L TRIS-HCL調(diào)整pH至9.0。把小鼠腹水加入已經(jīng)用0.1moL/L磷酸緩沖液pH8.0平衡好的Protein ASepharose CL 4B蛋白柱中，用上述緩沖液洗柱子，直到流出液中檢測不到雜蛋白為止。用PH3.0的檸檬酸緩沖液洗脫，收集流出液，并立即用ImoL/L pH8.5 TRIS-HCL緩沖液中和，用pH7.2,0.01M PBS透析72h。取樣在紫外分光光度計上測0D260、0D280，計算蛋白質含量，凍干后于_20°C保存，純化后單克隆抗體L3C的蛋白電泳圖見圖1。
[0067](2)單克隆抗體L3C的特異性
[0068]以Tim-3-Trx或Trx (硫氧還蛋白)包被酶標板每孔50uL,濃度梯度分別為:10ug/ml、2ug/ml、400ng/ml、80ng/ml、16ng/ml、3.2ng/ml、0.64ng/ml、0ng/ml。37 V 孵育 3-4 小時包被。PBST洗5遍，封閉，200ul封閉液封閉2小時，PBST洗5遍。按10ug/ml的終濃度加入L3C抗體50ul，37°C反應I小時，PBST洗5遍。加入300X稀釋ant1-mouse抗體(KPL公司)，37°C反應45min。PBST洗7遍，加入50ul/well的TMB，室溫避光孵育lOmin。加入50ul/well的2N的硫酸終止反應，酶標儀0D450nm檢測。
[0069]L3C抗體特異性結果見圖2，結果顯示本發(fā)明所述的L3C抗體能夠特異性的與Tim-3結合。
[0070](3)單克隆抗體L3C的靈敏性檢測
[0071]以Tim-3-Trx包被酶標板每孔50uL,濃度梯度分別為:10ug/ml、2ug/ml、400ng/ml、80ng/ml、16ng/ml、3.2ng/ml、0.64ng/ml、0ng/ml。37°C鮮育 3-4 小時包被。PBST 洗 5 遍，封閉，200ul封閉液封閉2小時。PBST洗5遍，按10ug/ml的終濃度加入L3C抗體和mlgG各50ul。37°C反應I小時。PBST洗5遍，加入300X稀釋ant1-mouse抗體(KPL公司)，37°C反應45min。PBST洗7遍,加入5`0ul/well的TMB,室溫避光孵育IOmin0加入50ul/well的2N的硫酸終止反應，酶標儀0D450nm檢測。
[0072]L3C抗體靈敏度結果見圖3，結果顯示本發(fā)明所述的L3C抗體對Tim-3檢測的靈敏度高，能夠達到lng/ml。
[0073]實施例四一種檢測Tim-3的ELISA試劑盒的制備
[0074]所述檢測Tim-3的ELISA試劑盒的設計原理如圖4所示。將Tim_3的配體rhGal-9蛋白包被于高親和力的96孔ELISA板上，用其捕獲人血清中的Tim-3，抗人Tim-3抗體L3C為檢測抗體，檢測血清中的Tim-3，用HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體檢測抗人Tim_3抗體L3C，最后加入TMB顯色，2N硫酸終止后檢測0D450的值，通過分析0D450值的大小，判斷患者中Tim-3的水平。
[0075]1.rhGal-9蛋白的制備
[0076]I) rhGal-9 基因的合成:
[0077]根據(jù)人hGal-9蛋白的基因序列設計引物，通過PCR方法合成hGal_9基因的全長序列如SEQ ID:N0.20。測序正確后，利用EcoR I和Xho I DNA限制性內(nèi)切酶，將合成的hGal-9全長序列插入到pET32a載體上，構建rhGal_9_pET32a載體，此載體可用于表達rhGal-9-Trx融合蛋白。
[0078]2) rhGal-9蛋白的表達、純化:
[0079]將構建好的rhGal-9 -pET32a 質粒轉化入 Ε.coli BL21 (DE3)感受態(tài)中，37°C Amp+抗性平板培養(yǎng)，挑單克隆菌落，于IOml含有100ug/ml氨芐青霉素(Amp+)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-5小時。將搖好的菌液按1: 100的比例接種到IL Amp+的LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)3_4小時，當菌液0D600 = 0.6左右時，加入IPTG至終濃度0.1禮，然后25°C過夜搖動培養(yǎng)。將得到的菌液離心收集菌體，超聲破碎菌體，離心收集包涵體，梯度尿素(1M-2M-4M-8M)變性洗滌包涵體，然后梯度尿素(8M-4M-2M-1M-0.5M)復性得到rhGal-9蛋白。最后利用N1-NTA親和純化得到具有較高純度的蛋白。將得到的rhGal-9蛋白除菌、去內(nèi)毒素，為以后的實驗備用。rhGal-9蛋白的SDS電泳圖見圖5。
[0080]2.rhGal-9蛋白與Tim_3的結合活性驗證
[0081]DELISA鑒定rhGal-9蛋白對hTim-3的親和力
[0082]96孔高親和力ELISA板上包被飽和劑量的rhGal-9蛋白(10ug/ml)，然后加入重組人Tim-3蛋白或無關蛋白Trx, 4°C包被過夜。洗漆后加入抗人Tim_3的抗體,最后加入羊抗小鼠HRP標記的抗體，TMB顯色，2N硫酸終止。
[0083]ELISA結果見圖6，結果表明，我們表達的rhGal-9能特異性地與人Tim_3分子結合。
[0084]2)rhGal-9蛋白誘導淋巴細胞凋亡的活性檢測
[0085]24孔板內(nèi)種THPl細胞至4*105/孔,分別加入rhGal-9-Trx融合蛋白和Trx蛋白，濃度梯度為0.2uM、0.5uM、luM。12小時后收細胞，用Annexin V和PI凋亡染色，流式細胞儀檢測，結果見圖7。上述結果表明，上述表達的rhGal-9蛋白能特異性結合人Tim_3，且具有生物學功能。
[0086]3.檢測Tim-3的ELISA試劑盒組裝
[0087]檢測Tim-3的ELISA試劑盒包括:rhGal_9蛋白、抗Tim_3抗體L3C、HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體、辣根過氧化物酶底物緩沖液、蛋白標準品人Tim-3(100ug/ml,0.1ml)、陰性對照樣品BSA。其中辣根過氧化物酶底物緩沖液:稱取IOmg 3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶于5ml無水乙醇中制備成TMB貯存液。待使用時取0.5ml TMB貯存液加到IOml磷酸檸檬酸底物緩沖液(0.2MNa2HP04,0.1M檸檬酸)中，再加入32 μ I 0.75% H2O2混勻，配置成辣根過氧化物酶底物緩沖液。
[0088]4.檢測Tim-3的ELISA試劑盒的使用方法
[0089]I)包被重組人rhGal-9蛋白(10ug/ml)到高親和力ELISA板中，4°C過夜后用含
0.2%吐溫的PBS緩沖液洗滌5次；
[0090]2)按合適的稀釋度(1: 2~1: 10)稀釋正常人或患者的血漿，加入到包被有rhGal-9的ELISA板條中，37°C孵育I小時，用含0.2%吐溫的PBS緩沖液洗滌5次；
[0091]3)加入抗人Tim-3的抗體L3C，37°C孵育I小時，用含0.2%吐溫的PBS緩沖液洗滌5次；
[0092]4)最后加入羊抗小鼠HRP標記的抗體，37度孵育0.5小時，用含0.2%吐溫的PBS緩沖液洗滌5次；
[0093]5)最后加入TMB顯色，2N硫酸終止后檢測0D450的值。
[0094]通過分析0D450值的大小，判斷人血清中Tim_3濃度。
[0095]實施例五一種檢測Tim-3的ELISA試劑盒的臨床樣品檢測
[0096]利用本發(fā)明所述的試劑盒，按照實施例5中所述的試劑盒的使用方法，對正常人和膿毒血癥患者血清的Tim-3進行檢測。首先包被了人Gal-9蛋白，然后分別加入了標準品(Pos Control) Tim-3,正常人血清(Nor patient),以及膿毒血癥患者血清(sepsislsepsis2),然后用抗人Tim-3抗體(L3C)為檢測抗體。
[0097]檢測結果見圖8，實驗結果表明膿毒血癥患者血清中Tim-3 (sTim-3)的含量相對于正常人血清中Tim-3(sTim-3)的含量顯著降低。說明本發(fā)明試劑盒能夠用于臨床檢測。
[0098] 通過實施例三對單克隆抗體L3C的靈敏性檢測，說明本發(fā)明所述的試劑盒能夠準確檢測出樣品中Tim-3的含量，其靈敏度能夠達到lng/ml。
【權利要求】
1.一種抗人Tim-3中和性單克隆抗體或其片段，包括輕鏈⑶R1-3和重鏈⑶R1-3，其特征在于，所述輕鏈CDR1-3的氨基酸序列為: CDRl:如序列表中SEQ ID NO:5所示； CDR2:如序列表中SEQ ID NO:6所示； CDR3:如序列表中SEQ ID NO:7所示； 所述重鏈⑶R1-3的氨基酸序列為: CDRl:如序列表中SEQ ID NO:8所示； CDR2:如序列表中SEQ ID NO:9所示； CDR3:如序列表中SEQ ID NO:10所示。
2.如權利要求1所述的單克隆抗體或其片段，其特征在于，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。
3.如權利要求1-2任意一項所述的單克隆抗體或其片段，其特征在于，所述輕鏈可變區(qū)的編碼序列如序列表中SEQ ID NO:3的核甘酸序列所示，所述重鏈可變區(qū)的編碼序列如序列表中SEQ ID NO:4的核甘酸序列所示。
4.一種含有權利要求1-3任意一項所述的單克隆抗體或其片段的Tim-3檢測試劑盒。
5.—種檢測Tim-3的ELISA試劑盒,所述試劑盒包括如權利要求1_3任意一項所述的單克隆抗體或其片段。
6.如權利要求5所述的一種檢測Tim-3的ELISA試劑盒，還包括rhGal_9蛋白、HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體、辣根過氧化物酶底物緩沖液、蛋白標準品人Tim-3 (1OOug/ml，0.1ml)、陰性對照樣品BSA。
7.如權利要求5所述的種檢測Tim-3的ELISA試劑盒，其使用方法如下: 1)包被重組人rhGal-9蛋白(10ug/ml)到高親和力ELISA板中，4°C過夜后用含0.2%吐溫的PBS緩沖液洗滌5次； 2)按合適的稀釋度1: 2~1: 10稀釋正常人或患者的血漿，加入到包被有rhGal-9的ELISA板條中，37°C孵育I小時，用含0.2%吐溫的PBS緩沖液洗滌5次； 3)加入抗人Tim-3的抗體L3C，37°C孵育1小時，用含0.2%吐溫的PBS緩沖液洗滌5次； 4)最后加入羊抗小鼠HRP標記的抗體，37度孵育0.5小時，用含0.2%吐溫的PBS緩沖液洗滌5次； 5)最后加入TMB顯色，2N硫酸終止后檢測0D450的值，通過分析0D450值的大小，判斷人血清中Tim-3濃度。
【文檔編號】G01N33/68GK103665164SQ201210408986
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年10月24日 優(yōu)先權日:2012年10月24日
【發(fā)明者】韓根成, 陳國江, 王仁喜, 肖鶴, 侯春梅, 馮健男, 黎燕, 沈倍奮, 蔣興偉, 楊小梅, 李新穎, 郎小玲 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所