專(zhuān)利名稱(chēng)：用于檢測(cè)氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留的單克隆抗體及酶聯(lián)免疫方法與試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于檢測(cè)分析和免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種能檢測(cè)氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留的單克隆抗體及酶聯(lián)免疫方法(ELISA)與試劑盒。
背景技術(shù)：
氟喹諾酮類(lèi)藥物是一族人工合成的抗菌藥，由于其抗菌譜廣，抗菌カ強(qiáng)而被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)及養(yǎng)殖業(yè)。但是由于不合理用藥及濫用藥物，該類(lèi)藥物的不良反應(yīng)及耐藥菌株的出現(xiàn)給人類(lèi)健康帶來(lái)了潛在的危害，因此歐盟和我國(guó)農(nóng)業(yè)部分別對(duì)該類(lèi)藥物規(guī)定了最大殘留限量(MRL)。建立殘留檢測(cè)方法是控制藥物殘留的重要手段，目前報(bào)道的氟喹諾酮類(lèi)藥物的殘留檢測(cè)分析方法主要有理化方法、儀器分析法、微生物法及酶聯(lián)免疫法等。理化法缺乏專(zhuān)一性及敏感性，在殘留分析中應(yīng)用不多；微生物法的靈敏度不高，僅限于樣品的初篩(王瑩，2006 ;李巖松，2005 ;盧圣欣，2007);氣相色譜、液相色譜、質(zhì)譜及其聯(lián)用技術(shù)很高的靈敏度和準(zhǔn)確度，但需要昂貴的儀器設(shè)備、復(fù)雜的樣品前處理，不適用于大批量樣品的殘留分析；90年代發(fā)展起來(lái)的酶聯(lián)免疫分析法不但具有較高的靈敏度和特異性，而且經(jīng)濟(jì)、快速且操作簡(jiǎn)單，比較適合于大量樣品的殘留檢測(cè)。目前關(guān)于檢測(cè)氟喹諾酮類(lèi)藥物的酶聯(lián)免疫分析大部分是通過(guò)3位的羧基與蛋白偶聯(lián)制備免疫原免疫動(dòng)物后獲得抗體，如Holtzapple等(1997)首次報(bào)道了以沙拉沙星(SAR)為半抗原獲得的單克隆抗體能識(shí)別5種氟喹諾酮類(lèi)藥物(諾沙星、諾氟沙星、萘啶酸、曲伐沙星及ニ氟沙星);Duan等(2001)以環(huán)丙沙星為半抗原制備的多克隆抗體LOD為0. 32ppb，對(duì)諾氟沙星的交叉反應(yīng)率為44. 6% ;Watanabe等(2002)以恩諾沙星為半抗原與蛋白通過(guò)碳ニ亞胺法偶聯(lián)后制備的單抗能夠在MRL水平以下以親和色譜的形式識(shí)別恩諾沙星；魏東(2007)分別以環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、諾氟沙星及沙拉沙星為半抗原合成免疫原制備抗血清，最終獲得了以沙拉沙星為免疫原的多克隆抗體，該抗體能夠識(shí)別6種氟喹諾酮類(lèi)藥物沙拉沙星(100%)、諾氟沙星(91. 83%)、環(huán)丙沙星(85. 7%)、恩諾沙星(77. 09%)、達(dá)氟沙星(38. 37%)及培氟沙星(47. 94%)?？梢?jiàn)，上述抗體識(shí)別的氟喹諾酮類(lèi)藥物種類(lèi)不多，難以滿(mǎn)足族特異性檢測(cè)的需求。近年來(lái)，Bucknall等(2003)制備了族特異性多克隆抗體，該抗體能夠識(shí)別9種該類(lèi)藥物，其交叉反應(yīng)率分別為諾氟沙星(100%)、萘啶酸(15%)、恩諾沙星(6%)、氟甲喹(6%)、環(huán)丙沙星(9%)、氧氟沙星(17%)、惡喹酸(40%)、吡哌酸(18%)、依諾沙星(143%)。HuetA C等(2006)以SAR為免疫原，以諾氟沙星卵清蛋白偶聯(lián)物(N0R-0VA偶聯(lián)物)為包被原，獲得的抗體能識(shí)別12種氟喹諾酮類(lèi)藥物SAR (100%)、諾氟沙星(105%)、ニ氟沙星(64%)、 環(huán)丙沙星(17%)、培氟沙星(30%)、氧氟沙星(55%)、達(dá)氟沙星(88%)、恩諾沙星(66%)、馬波沙星(45%)、洛美沙星(24%)、依諾沙星(27%)、萘啶酸(14%)。Wang等(2007)獲得了能夠識(shí)別12種氟喹諾酮類(lèi)藥物的單克隆抗體，分別是環(huán)丙沙星(100%)、恩諾沙星(82%)、諾氟沙星(71%)、氧氟沙星(54%)、達(dá)氟沙星(54%)、培氟沙星(49%)、氨氟沙星(51%)、洛美沙星(40%)、依諾沙星(45%)、氟甲喹(35%)、惡喹酸(40%)、馬波沙星(41%)。上述抗體及相應(yīng)的ELISA檢測(cè)方法在一定程度上能滿(mǎn)足氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留檢測(cè)的需要，但由于不能識(shí)別獸醫(yī)上常用的ニ氟沙星和沙拉沙星，且對(duì)個(gè)別藥物的交叉反應(yīng)率差異較大，導(dǎo)致檢測(cè)的準(zhǔn)確度難以控制。因此制備ー種能夠識(shí)別包括ニ氟沙星和沙拉沙星的族特異性單克隆抗體，并建立相應(yīng)的ELISA檢測(cè)方法和試劑盒具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供ー種能識(shí)別氟喹諾酮類(lèi)藥物的單克隆抗體和檢測(cè)氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留的酶聯(lián)免疫方法與試劑盒。本發(fā)明還提供所述單克隆抗體在制備檢測(cè)氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng)用以及酶聯(lián)免疫方法和試劑盒在氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留檢測(cè)中的應(yīng)用。上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的 ー種能識(shí)別氟喹諾酮類(lèi)藥物的單克隆抗體，它是由保藏號(hào)為CCTCC N0:C201149的雜交瘤細(xì)胞5B11所分泌的。所述的雜交瘤細(xì)胞5B11，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)為CCTCCN0:C201149o所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng)用。包含所述的單克隆抗體的試劑盒。所述的試劑盒，是檢測(cè)氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒。所述的試劑盒在氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留檢測(cè)中的應(yīng)用。一種檢測(cè)氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留的酶聯(lián)免疫方法，其步驟如下(I)將半抗原諾氟沙星與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到免疫原(NOR-BSA偶聯(lián)物);(2)將半抗原諾氟沙星與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)得到包被原(NOR - OVA偶聯(lián)物)；(3)利用步驟(I)的免疫原制備得到保藏號(hào)為CCTCC N0:C201149的雜交瘤細(xì)胞5B11 ；(4)利用保藏號(hào)為CCTCC N0:C201149的雜交瘤細(xì)胞5B11制備單克隆抗體；(5)用步驟(2)的包被原包被固相載體(如酶標(biāo)板)；(6)將待測(cè)樣品用こ腈在堿化條件下提取、氮?dú)獯蹈?、正己烷去脂和?. 05體積％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液重新溶解得到待測(cè)物；( 7 )對(duì)步驟(6 )的待測(cè)物進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測(cè)。所述的酶聯(lián)免疫方法在氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是(I)本發(fā)明制備的單克隆抗體能夠識(shí)別15種氟喹諾酮類(lèi)藥物，現(xiàn)有技術(shù)中還沒(méi)有單克隆抗體能識(shí)別這么多氟喹諾酮類(lèi)藥物，特別是能夠同時(shí)識(shí)別獸醫(yī)上常用的ニ氟沙星和沙拉沙星，因此適用范圍廣；(2)本發(fā)明建立的檢測(cè)氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留的酶聯(lián)免疫方法與試劑盒靈敏度、精密度高、準(zhǔn)確性好；
(3)本發(fā)明涉及的樣品處理方法簡(jiǎn)便，易操作，樣品處理所用的主要有機(jī)試劑為こ腈和正己烷，對(duì)操作者身體健康危害較小。


圖I為本發(fā)明的技術(shù)路線(xiàn)圖。圖2為本發(fā)明的單克隆抗體與達(dá)氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)曲線(xiàn)，X軸為達(dá)氟沙星(DNA)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對(duì)數(shù)值，Y軸為達(dá)氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品溶液的光密度值除以“零”孔光密度值(B/B0)。
具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步說(shuō)明，但不限制本發(fā)明。實(shí)施例I免疫原和包被原的制備免疫原(NOR-BSA偶聯(lián)物)的合成準(zhǔn)確稱(chēng)取諾氟沙星32. 4mg溶解于I. 5mLN，N- ニ甲基甲酰胺(DMF)中，溶液在4 °C的冰浴中冷卻25min后加入碳ニ亞胺(EDC)192. 42mg和N —羥基琥珀酰亞胺(NHS) 16. 05mg,然后4°C反應(yīng)過(guò)夜(A液)。準(zhǔn)確稱(chēng)取BSA57. 86mg溶解于15ml碳酸鹽緩沖液(CBS)中(B液)。然后將A液逐滴緩慢滴入B液中，于4°C反應(yīng)過(guò)夜后將反應(yīng)混合物移入處理過(guò)的透析袋內(nèi)，用0. Olmol磷酸鹽緩沖液(PBS，PH7. 4)在4°C的條件下透析，期間不斷換液，以移走游離的諾氟沙星小分子物質(zhì)。將所得產(chǎn)物低壓凍干，干-20°C保存?zhèn)溆?。包被?NOR - OVA偶聯(lián)物)的合成稱(chēng)取諾氟沙星16. 3mg溶解于2mL DMF中，充分溶解后，加入NHS 20mg, EDC 192mg，反應(yīng)在避光條件下進(jìn)行24h (A液)。準(zhǔn)確稱(chēng)取OVA39. 75mg溶解于20mL PBS (pH7. 4)中(B液)。將A液逐滴滴入B液中，反應(yīng)在4°C條件下過(guò)夜最后將該反應(yīng)液轉(zhuǎn)入透析袋中，在PBS液(pH7. 4)中4°C透析，每天不斷更換透析液，直至透析完全為止。實(shí)施例2單克隆抗體的制備2.1小鼠免疫以實(shí)施例I制備的NOR - BSA偶聯(lián)物為免疫原，免疫Balb/C雌性小鼠。免疫程序采用一次基礎(chǔ)免疫及數(shù)次加強(qiáng)免疫。首次免疫時(shí)用與等體積的弗氏完全佐劑乳化的含100 u g免疫原的蛋白乳液注射于小鼠的頸背部皮下進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，以后每隔15天用弗氏不完全佐劑乳化的含100 u g免疫原的蛋白乳液進(jìn)行加強(qiáng)免疫。從免疫三次起，毎次免疫后第8天采尾血，分離血清，間接ELISA法檢測(cè)血清抗體效價(jià)。免疫合格的小鼠(效價(jià)高、靈敏度好)停止免疫以備融合。2. 2細(xì)胞融合與篩選在融合前3天(最好與上次免疫相隔3周以上)給免疫合格的小鼠腹腔注射含IOOiIg免疫原的蛋白溶液(不加佐劑)，強(qiáng)化免疫。融合前I天取未免疫的Balb/C鼠一只制備飼養(yǎng)細(xì)胞。根據(jù)骨髓瘤細(xì)胞的計(jì)數(shù)結(jié)果，取3 5X 107個(gè)骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞混合(比例為1:10 5:10)。1500r/min離心5min，將離心管上清倒盡后，倒扣在吸水紙上，控干水滴。輕輕地敲擊管底，使管底細(xì)胞成糊狀，將其放置于37°C水浴中,將吸有0. 8mL預(yù)溫至37°C的50%聚こニ醇(PEG，購(gòu)自Amersco)的ImL刻度吸管插入到管底，60sec內(nèi)緩緩加PEG到混合細(xì)胞上，邊加邊輕輕攪拌，加完后靜置90sec，將離心管插到離心管架上。移走水浴杯，用吸管吸取IOmL預(yù)溫至37°C的RPMI - 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液(購(gòu)自Hyclone)沿管壁緩緩加到融合細(xì)胞上,邊加邊輕輕晃動(dòng)離心管,第I分鐘逐滴加入lmL(3sec/滴)，第2分鐘再加2mL，最后加完剩下的7mL(5min內(nèi)加完)。加完第一個(gè)IOmL后，接著沿管壁補(bǔ)加RPMI - 1640培養(yǎng)基至50mL，加完后擰緊蓋，緩慢顛倒幾次，混勻。1500r/min離心5min，棄去上清，用含有飼養(yǎng)細(xì)胞的72mL HAT完全培養(yǎng)基輕輕將融合細(xì)胞攪拌重懸。將融合細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，2滴/孔。一次融合可接種5塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37°C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從融合當(dāng)天算起為0d，前面3d盡量不要?jiǎng)蛹?xì)胞板，保持培養(yǎng)箱內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。第3d姆孔補(bǔ)加I滴HAT完全培養(yǎng)基(購(gòu)自Amersco)并觀察集落生長(zhǎng)情況；第5d姆孔吸出1/2培養(yǎng)上清(100 u L)，再加入I滴HT完全培養(yǎng)基(購(gòu)自Amersco)；以后每隔3d同上法吸去1/2培養(yǎng)上清，換入HT完全培養(yǎng)基。根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至占孔底面積1/4左右即可取細(xì)胞培養(yǎng)上清，以發(fā)明人制備的NOR - OVA偶聯(lián)物為包被原，利用ELISA方法篩選出 分泌抗氟喹諾酮抗體的陽(yáng)性細(xì)胞孔。對(duì)篩選出來(lái)的陽(yáng)性細(xì)胞孔利用有限稀釋法連續(xù)3次克隆化，最終建立一株穩(wěn)定分泌抗氟喹諾酮抗體的雜交瘤細(xì)胞株，對(duì)該雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)平均值為94. 4條，高于親本細(xì)胞的染色體數(shù)目(SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的染色體平均數(shù)為58條，脾細(xì)胞染色體為40條)，說(shuō)明融合細(xì)胞的確是SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的雜交產(chǎn)物。申請(qǐng)人將該雜交瘤細(xì)胞株命名為5B11，并于2011年6月29日送交位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號(hào)為CCTCC NO C201149。2. 3腹水單抗制備與鑒定在接種前7天取Balb/c小鼠數(shù)只，每只小鼠腹腔注射0. 5ml弗氏不完全佐劑進(jìn)行預(yù)處理。用RPMI - 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞并將細(xì)胞數(shù)調(diào)至I X IO6個(gè)/mL，每只小鼠腹腔接種0. 5ml。待小鼠腹部明顯膨大，精神變差，瀕死不動(dòng)時(shí)采集腹水，純化獲得單克隆抗體。以單克隆抗體亞型鑒定試紙條確定單克隆抗體為IgGl亞型。實(shí)施例3間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立3. I試劑配制碳酸鹽緩沖液(pH9. 6):準(zhǔn)確稱(chēng)取Na2CO3 I. 59g、NaHCO3 2. 93g，少量超純水溶解，定容至lOOOmL。洗滌液(pH7.4):準(zhǔn)確稱(chēng)取 NaCl 8. 00g, KH2PO4 0. 20g，Na2HPO4 12H20 2. 90g，KCl0. 20g，少量超純水溶解，加入Tween 20 0. 50mL，定容至lOOOmL。磷酸鹽緩沖液(pH7.4):準(zhǔn)確稱(chēng)取 NaCl 8. 00g, KH2PO4 0. 20g, Na2HPO4 12H202. 90g, KCl 0. 20g,少量超純水溶解，定容至1000mL。封閉液準(zhǔn)確稱(chēng)取卵清蛋白10. 00g，加入磷酸鹽緩沖液IOOOmL,攪拌混勻直至蛋
白完全溶解。底物混合液準(zhǔn)確吸取底物B液(購(gòu)自武漢市飛遠(yuǎn)科技有限公司)10mL，加入100 U L底物A液(購(gòu)自武漢市飛遠(yuǎn)科技有限公司)，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。 終止液準(zhǔn)確量取濃硫酸IOOmL,緩慢滴加到800mL超純水中。3. 2方陣滴定法采用方陣滴定法初步選擇包被原濃度和抗體稀釋度。使用碳酸鹽緩沖液將N0R-0VA包被原倍比稀釋成32、16、8、4、2 ii g/mL,從第一至第五列依次縱向加入96孔酶標(biāo)板，4°C過(guò)夜；洗滌3次，拍干，加入封閉液250yL，37°C封閉2h ;洗滌3次，拍干，單克隆抗體使用磷酸鹽緩沖液倍比稀釋成 1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200，從第一至第七行依次橫向加入96孔酶標(biāo)板，37°C孵育30min ;洗滌3次，拍干，各孔加入用磷酸鹽緩沖液1:5000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(簡(jiǎn)稱(chēng)ニ抗，以下所指ニ抗均為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，購(gòu)自武漢飛羿生物技術(shù)有限公司)100 u L，37°C孵育30min ;洗滌4次，拍干，各孔加入底物混合液100 u L，避光顯色15min ;カロ入終止液50ii L ;用自動(dòng)酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值(OD值)。方陣滴定結(jié)果見(jiàn)表I，初步選擇幾個(gè)OD值接近2. 0，且相鄰兩孔OD值有較大變化的包被濃度及對(duì)應(yīng)的抗體稀釋度組合。結(jié)果表明，可選擇以下包被原濃度和抗體稀釋度組合(8，6400)和(16，12800)表I 5B11單克隆抗體方陣滴定
權(quán)利要求
1.一種能識(shí)別氟喹諾酮類(lèi)藥物的單克隆抗體，其特征在于，它是由保藏號(hào)為CCTCCN0:C201149的雜交瘤細(xì)胞5B11所分泌的。
2.權(quán)利要求I所述的雜交瘤細(xì)胞5B11，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC N0:C201149。
3.權(quán)利要求I所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng)用。
4.包含權(quán)利要求I所述的單克隆抗體的試劑盒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，該試劑盒是檢測(cè)氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒。
6.權(quán)利要求4或5所述的試劑盒在氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留檢測(cè)中的應(yīng)用。
7.—種檢測(cè)氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留的酶聯(lián)免疫方法，其步驟如下 (1)將半抗原諾氟沙星與牛血清白蛋白偶聯(lián)得到免疫原； (2)將半抗原諾氟沙星與卵清蛋白偶聯(lián)得到包被原；(3)利用步驟(I)的免疫原制備得到保藏號(hào)為CCTCCN0:C201149的雜交瘤細(xì)胞5B11 ； (4)利用保藏號(hào)為CCTCCN0:C201149的雜交瘤細(xì)胞5B11制備單克隆抗體； (5)用步驟(2)的包被原包被固相載體； (6)將待測(cè)樣品用乙腈在堿化條件下提取、氮?dú)獯蹈伞⒄和槿ブ秃?.05體積％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液重新溶解得到待測(cè)物； (7)對(duì)步驟(6)的待測(cè)物進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測(cè)。
8.權(quán)利要求7所述的酶聯(lián)免疫方法在氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種能識(shí)別氟喹諾酮類(lèi)藥物的特異性單克隆抗體，所述單克隆抗體是由雜交瘤細(xì)胞5B11所分泌的，該雜交瘤細(xì)胞保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO:C201149。本發(fā)明還公開(kāi)了檢測(cè)氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留的酶聯(lián)免疫方法與試劑盒及其在氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留檢測(cè)中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備得到的單克隆抗體能識(shí)別15種氟喹諾酮類(lèi)藥物，特別是能夠同時(shí)識(shí)別二氟沙星和沙拉沙星，因此適用范圍廣。本發(fā)明建立的酶聯(lián)免疫方法與試劑盒靈敏度、精密度高、準(zhǔn)確性好。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102766212SQ20121017649
公開(kāi)日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月31日
發(fā)明者劉振利, 彭大鵬, 曹光彩, 王玉蓮, 袁宗輝, 陳冬梅, 陶燕飛 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)