專利名稱：一種氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫化學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡及其制備方法。
背景技術(shù)：
氟喹諾酮類藥物(fluoroquinolones，F(xiàn)Qs)是20世紀(jì)80年代之后研制并得到廣泛應(yīng)用的一類人工合成抗生素，它們是在第一代萘啶酸和第二代吡哌酸的基礎(chǔ)上，在喹諾酮萘啶環(huán)的6號(hào)位引入氟原子，7號(hào)位上連接哌嗪環(huán)而開發(fā)出的第三代喹諾酮藥物，具有良好的組織滲透性。氟喹諾酮類藥物的作用機(jī)理是抑制細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶，使酶不能在DNA雙鏈上引入切口，破壞細(xì)菌的代謝和繁殖，達(dá)到迅速殺滅細(xì)菌的目的，其對(duì)革蘭氏陽性和陰性桿菌、葡萄球菌和肺炎球菌均有很強(qiáng)的抗菌活性。最初這類藥物用于治療尿道感染，后來發(fā)展到治療系統(tǒng)感染性疾病，主要用于泌尿系統(tǒng)感染、皮膚感染、呼吸道感染、消化道炎癥、傷寒和敗血癥等疾病的治療。由于它們具有吸收好、半衰期長、抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、低毒高效、安全價(jià)廉，多數(shù)品種可以口服等許多優(yōu)點(diǎn)，因此在臨床中得到了廣泛應(yīng)用，并且在動(dòng)物飼養(yǎng)中作為預(yù)防和治療藥物普遍使用，有時(shí)還作為飼料添加劑促進(jìn)動(dòng)物生長，提高生長速度與產(chǎn)量。氟喹諾酮類藥物在獸醫(yī)臨床上長期和大量使用，必然會(huì)導(dǎo)致其在動(dòng)物性食品中的殘留，從而給食品衛(wèi)生及人類健康帶來潛在的危害。研究表明:長期使用氟喹諾酮類抗生素易導(dǎo)致動(dòng)物群體體內(nèi)致病菌產(chǎn)生耐藥性，并且這種耐藥性可能由動(dòng)物微生物向人類病原菌傳播；而且該類藥物在動(dòng)物體內(nèi)代謝緩慢，人體攝入后，會(huì)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)及關(guān)節(jié)部位造成不良反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)，可引起食用者產(chǎn)生遠(yuǎn)期毒性及潛在的致癌、致畸、致突變效應(yīng)。因此，氟喹諾酮類藥物殘留問題越來越引起人們的廣泛關(guān)注。我國以及世界衛(wèi)生組織、歐盟、美國、日本等國家和組織都將氟喹諾酮類藥物列入限制使用的獸藥藥物清單中，并制訂出相應(yīng)的最高殘留限量(maximum residue limit, MRL)和休藥期,而且加大了其殘留監(jiān)管力度。歐盟規(guī)定:動(dòng)物肌肉、肝臟和腎臟中二氟沙星、恩諾沙星(恩諾沙星+環(huán)丙沙星)、沙拉沙星等氟喹諾酮類獸藥最高殘留量為0.0Γ1.9 mg/kg ;美國和加拿大規(guī)定:氟喹諾酮為養(yǎng)蜂業(yè)禁用藥物，蜂王漿中各種氟喹諾酮類藥物MRL為5 μ g/kg ;日本2006年5月29日開始實(shí)施“肯定列表制度”后，除有暫定標(biāo)準(zhǔn)的藥物如恩諾沙星、噁喹酸等外，其余FQs均按10 yg/kg的“一律標(biāo)準(zhǔn)”；我國規(guī)定FQs在牛奶中的MRL分別為:恩諾沙星(恩諾沙星+環(huán)丙沙星)為100 yg/L,達(dá)氟沙星為30 yg/L,氟甲喹為50 μ g/L。國內(nèi)外用于FQs藥物殘留檢測的方法較多，主要包括高效液相法(HPLC)以及與此相關(guān)的 HPLC-UV、HPLC-FD, HPLC-DVD, LC-MS/MS，LC-ES1-MS/MS，另外還有熒光光譜法、高效毛細(xì)管電泳法、薄層色譜法、ELISA、膠體金試紙、微生物學(xué)方法和電解分析法等。理化分析方法靈敏度高，但需要昂貴的儀器設(shè)備，繁瑣復(fù)雜的操作程序，相對(duì)費(fèi)時(shí)且檢測費(fèi)用較高，不適合批量樣品的篩選。ELISA方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，測定方法簡單快速，可同時(shí)篩選大量樣品。膠體金標(biāo)記免疫分析法是近年來迅速發(fā)展的一種新型分析技術(shù)，其特點(diǎn)是簡便快速、成本低、無污染、無需培訓(xùn)，非常適合于現(xiàn)場檢測，與ELISA相比，具有樣品前處理簡單，顯色時(shí)間短(3-5 min)，且所有試劑包含在一根試紙條上，無需儀器等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的市場前景和應(yīng)用價(jià)值。目前，市場上銷售的試紙卡多用來檢測某一具體的藥物，尚末見到能夠同時(shí)檢測多種FQs獸藥殘留的試紙卡。因此，研制快速、靈敏、高效的氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡對(duì)于保障動(dòng)物性食品安全具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供了一種操作簡便、快速準(zhǔn)確、靈敏度高、成本低廉、穩(wěn)定性好且可進(jìn)行批量檢測的氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡，該試紙卡能夠同時(shí)檢測環(huán)丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、培氟沙星、依諾沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、洛美沙星和麻保沙星等9種氟喹諾酮類藥物殘留。本發(fā)明解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供了一種氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡，其特征在于:所述的氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡包括塑料盒體和封裝于塑料盒體內(nèi)的試紙條，所述試紙條的底層為支撐層，該支撐層上由左到右依次附著有緊密相連的樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，所述的塑料盒體上開有加樣孔和觀察窗，該加樣孔的位置與試紙條上的樣品墊位置相對(duì)應(yīng)，觀察窗與試紙條上的硝酸纖維素膜位置相對(duì)應(yīng)，所述的硝酸纖維素膜上有諾氟沙星一雞卵清白蛋白偶聯(lián)物溶液印制的檢測線和羊抗鼠IgG溶液印制的質(zhì)控線，所述的結(jié)合墊上灌注有膠體金標(biāo)記的抗氟喹諾酮類藥物類特異性單克隆抗體。本發(fā)明所述的支撐層為PVC板。本發(fā)明所述的吸收墊是以植物長纖維為原材料制成的純白濾紙。本發(fā)明所述的樣品墊和金標(biāo)抗體結(jié)合墊是由玻璃纖維棉制作而成的。本發(fā)明所述的樣品墊和金標(biāo)抗體結(jié)合墊的疊壓寬度為2 _，吸收墊與硝酸纖維素膜的疊壓寬度為2 mm。本發(fā)明所述的樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊和吸收墊上方覆蓋有膠膜保護(hù)層。本發(fā)明所述的硝酸纖維素膜兩端分界處有標(biāo)記線。本發(fā)明所述的氟喹諾酮類藥物為環(huán)丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、培氟沙星、依諾沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、洛美沙星和麻保沙星中的至少一種。本發(fā)明所述的膠體金標(biāo)記的抗氟喹諾酮類藥物類特異性單克隆抗體是由環(huán)丙沙星一牛血清白蛋白偶聯(lián)物免疫Balb/C小鼠制備而來的。一種氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡的制備方法，其特征在于:首先將樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊按照由左到右的順序附著于支撐層上，所述的硝酸纖維素膜上有諾氟沙星一雞卵清白蛋白偶聯(lián)物溶液印制的檢測線和羊抗鼠IgG溶液印制的質(zhì)控線，然后用切割機(jī)制成試紙條，然后將試紙條封裝于帶有加樣孔和觀察窗的塑料盒體內(nèi)，這樣就制得了氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡。本發(fā)明所述的樣品墊的制備方法為:將玻璃纖維棉用含有質(zhì)量濃度為2%的BSA、質(zhì)量濃度為1%的蔗糖、質(zhì)量濃度為0.5%的硼酸鈉和質(zhì)量濃度為0.1%的NaN3的PBS緩沖液處理后，干燥備用，即為樣品墊。本發(fā)明所述的金標(biāo)抗體結(jié)合墊的制備方法為:將玻璃纖維棉裁成4 mm寬的細(xì)條，放入含有質(zhì)量濃度為5%的BSA、質(zhì)量濃度為2%的蔗糖、質(zhì)量濃度為0.8%的NaCl和質(zhì)量濃度為0.05%的NaN3的PBS緩沖液中20 min, 37 1:恒溫烘干，然后將金標(biāo)抗體灌注于已處理好的玻璃纖維棉上，真空凍干4 h，即為金標(biāo)抗體結(jié)合墊。本發(fā)明所述的硝酸纖維素膜的制備方法為:將硝酸纖維素膜置于X-only單向噴點(diǎn)儀平臺(tái)上，檢測抗原放于A池，RaMIgG放于B池，展平壓緊，開機(jī)后將抗原和二抗分別點(diǎn)射于硝酸纖維素膜上，形成檢測線和質(zhì)控線，室溫自然干燥后，將其浸入BSA質(zhì)量濃度為1%的PBS緩沖液，pH值為7.4的封閉液中30 min, 37 °C烘干后，加入干燥劑，4 °C密封保存。本發(fā)明所述的諾氟沙星一雞卵清白蛋白偶聯(lián)物的制備方法為:將36 mg諾氟沙星溶解于2 mL DMF和2 mL 二氧六環(huán)中，4 °C預(yù)冷30 min，加入20 μ L三丁胺，冰浴10 min后加入40 μ L氯甲酸異丁酯,反應(yīng)60 min,即A液,將40 mg雞卵清白蛋白溶解于5 mL pH為9.6的Na2CO3的緩沖溶液，即B液，將A液逐滴加入到B液中，避光振蕩反應(yīng)4 h，反應(yīng)完成后先用蒸餾水透析3 d，再用PBS緩沖液透析3 d，紫外掃描透析液無小分子吸收峰時(shí)分裝于安瓿瓶中，一 20 °C凍干保存。本發(fā)明所述的吸收墊的制備方法為:將以植物長纖維為原材料制作的純白濾紙用切割機(jī)切成4 mm寬的細(xì)條，并用膠膜進(jìn)行一側(cè)封閉，干燥備用，即為吸收墊。本發(fā)明的氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡具有如下優(yōu)點(diǎn):
(1)廣譜特異性，能檢測9種FQs獸藥殘留。氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡以膠體金標(biāo)記高親和力的抗FQs類特異性單克隆抗體制備而成,金標(biāo)抗體中金顆粒與抗體分子通過異性電荷間范德華力相結(jié)合，膠體金對(duì)單克隆抗體的特異性和親和力影響很小。因此，快速檢測試紙卡能識(shí)別多種FQs獸藥殘留，其在PBS緩沖液中的靈敏度分別為:環(huán)丙沙星(5ng/mL)、諾氟沙星(5 ng/mL)、恩諾沙星(5 ng/mL)、培氟沙星(6 ng/mL)、依諾沙星(6 ng/mL)、沙拉沙星(8 ng/mL)、氧氟沙星(8 ng/mL)、洛美沙星(10 ng/mL)和麻保沙星(10 ng/mL)；
(2)操作簡單、方便快捷。使用快速檢測試紙卡時(shí)無需其它任何試劑，只要將處理后的樣品溶液用滴管滴入試紙卡加樣孔內(nèi)3 4滴，3飛min即可觀察結(jié)果；
(3)檢測結(jié)果形象、直觀。試紙卡以紅色印跡線“I ”或“ Il ”作為檢測線的陽性和陰性標(biāo)記，即在硝酸纖維素膜上質(zhì)控線(C線)顯示一條紅色“ I ”印跡時(shí)，表示被檢測樣品溶液呈陽性；若硝酸纖維素膜上質(zhì)控線(C線)和檢測線(T線)同時(shí)出現(xiàn)兩條紅色“ Il ”印跡時(shí)，表示樣品溶液呈陰性。結(jié)果形象直觀，簡單準(zhǔn)確，不容易出現(xiàn)誤判；
(4)膠膜的使用可以延長檢測結(jié)果觀察時(shí)間，試紙卡穩(wěn)定性好。本試紙卡樣品吸收墊將檢測溶液完全吸收，使之與偶聯(lián)墊上金標(biāo)抗體充分反應(yīng)，可以有效減少誤差率；還可以防止外界雜質(zhì)干擾，影響金標(biāo)抗體與檢測抗原的結(jié)合；
(5)成本低、投資少。使用本發(fā)明試紙卡，不需要另配復(fù)雜的儀器設(shè)備和昂貴的試劑，現(xiàn)場檢測一步到位，成本低廉，見效快；
(6)易于大范圍推廣應(yīng)用。本試紙卡操作簡單，適合不同類別的人員使用，如實(shí)驗(yàn)室檢測、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生監(jiān)督、規(guī)模養(yǎng)殖及個(gè)體生產(chǎn)等，具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。


圖1為本發(fā)明的氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明的氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡中試紙條的側(cè)視圖；圖3為本發(fā)明的氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡中試紙條的俯視圖。圖面說明:1、塑料盒體、2、試紙條、3、支撐層、4、樣品墊、5、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、6、硝酸纖維素膜(NC膜)、7、吸收墊、8、加樣孔、9、觀察窗、10、質(zhì)控線(C線)、11、檢測線(T線)、12、膠膜、13、標(biāo)記線。
具體實(shí)施例方式結(jié)合附圖詳細(xì)描述實(shí)施例。一種氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡，包括塑料盒體I和封裝于塑料盒體I內(nèi)的試紙條2，所述的試紙條2的底層為支撐層3，該支撐層3上由左到右依次附著有緊密相連的樣品墊4、金標(biāo)抗體結(jié)合墊5、硝酸纖維素膜6和吸收墊7，所述的塑料盒體I上開有加樣孔8和觀察窗9，該加樣孔8的位置與試紙條2上的樣品墊4位置相對(duì)應(yīng)，觀察窗9與試紙條2上的硝酸纖維素膜6位置相對(duì)應(yīng)，所述的硝酸纖維素膜6上有諾氟沙星一雞卵清白蛋白(NOR - 0VA)偶聯(lián)物溶液印制的檢測線(T線)11和羊抗鼠IgG溶液印制的質(zhì)控線(C線)10，兩者間距5 mm，其中諾氟沙星一雞卵清白蛋白偶聯(lián)物溶液印制的檢測線(T線)11位于靠近樣品墊4的一側(cè)，所述的結(jié)合墊5上灌注有膠體金標(biāo)記的抗氟喹諾酮類藥物類特異性單克隆抗體。本發(fā)明所述的支撐層3是由聚氯乙烯樹脂與穩(wěn)定劑及輔料配合制成的PVC板。本發(fā)明所述的吸收墊7是由吸水能力極強(qiáng)的植物長纖維為原材料制成的純白濾紙。本發(fā)明所述的樣品墊4和金標(biāo)抗體結(jié)合墊5是由玻璃纖維棉制作而成的。本發(fā)明所述的樣品墊4和金標(biāo)抗體結(jié)合墊5的疊壓寬度為2 mm,吸收墊7與硝酸纖維素膜6的疊壓寬度為2 _。本發(fā)明所述的樣品墊4、金標(biāo)抗體結(jié)合墊5和吸收墊7上方覆蓋有膠膜保護(hù)層12。本發(fā)明所述的硝酸纖維素膜6兩端分界處有標(biāo)記線13。一、本發(fā)明氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡的制備方法:
1、所述的抗氟喹諾酮類藥物類特異性單克隆抗體由環(huán)丙沙星一牛血清白蛋白(CIP —BSA)偶聯(lián)物免疫Balb/C小鼠制備而來，由以下步驟實(shí)現(xiàn):
(I)載體蛋白的活化:將200 mg BSA、11.2 mg EDC溶于4 mL PBS緩沖液中，攪拌條件下，緩慢加入6 mg乙二胺(溶于4 mL PBS), 37 1:振蕩反應(yīng)2 h。反應(yīng)液用PBS透析3 d，活化的載體蛋白BSA凍干保存。(2)環(huán)丙沙星衍生化:稱取環(huán)丙沙星38.6 mg (約0.1 mmoL), NHS 12 mg (約0.1mmoL)和EDC 19.2 mg (約0.1 mmoL)溶于2 mL的DMF，室溫下避光攪拌12 h。反應(yīng)產(chǎn)物于8000 r/min離心10 min,取上清稱為A液。氨基丁酸10 mg (約0.1 mmoL)溶于2 mL PBS中，即B液。攪拌狀態(tài)下將B液緩慢滴入A液中，反應(yīng)4 h，然后8000 r/min離心10 min,取上清液用飽和NaHCO3調(diào)至偏堿性，棄沉淀。上清液再用稀鹽酸(0.1 mol/L)調(diào)至偏酸性，收集沉淀，即為環(huán)丙沙星半抗原衍生物。(3)免疫原的合成:采用優(yōu)化的EDC兩步法合成CIP-BSA免疫原。將35 mg衍生化的CIP用3 mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解后，加入12 mg NHS和38 mg EDC, 37 V條件下避光反應(yīng)24 h。離心后取上清液逐滴加入到4 mL含60 mg活化BSA的PBS緩沖液中，37 °C條件下避光振蕩反應(yīng)4 h。反應(yīng)完成后先用蒸餾水透析3 d，再用PBS透析3 d，紫外掃描透析液無小分子吸收峰時(shí)，將免疫原分裝于安瓿瓶中，一 2 O °C保存。(4)小鼠免疫:用CIP-BSA免疫8 10周齡雌性Balb/C小鼠5只，劑量為60 U g/只，體積為0.2 mL。首免用PBS稀釋的免疫原與等體積FCA完全乳化，以后每隔3 w加強(qiáng)免疫一次，換用FIA乳化。免疫5次后斷尾采血分離血清，用間接ELISA和間接競爭ELISA篩選效價(jià)高，抑制效果好的小鼠作為融合備用鼠。融合前3 d超免小鼠，尾靜脈和腹腔各注射60 // g免疫原。(5)細(xì)胞融合:融合前Γ5 d用含有8-氮鳥嘌呤的完全培養(yǎng)基(含15%FBS的RPM1-1640)傳代培養(yǎng)NSO細(xì)胞；前I d用HAT培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞；融合時(shí)眶下竇采血，脫頸致死小鼠。無菌取脾臟制備脾細(xì)胞，在PEG-1500作用下與NSO細(xì)胞融合(細(xì)胞數(shù)量比約為10:1)，將融合后的細(xì)胞懸液加入到已鋪有滋養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞板中，HAT培養(yǎng)。(6)類特異性單克隆細(xì)胞株的篩選:融合后1(T14 d用間接ELISA和ciELISA篩選強(qiáng)陽性、抑制率高、生長狀態(tài)好的雜交瘤細(xì)胞株，用有限稀釋法進(jìn)行3次亞克隆。然后用FQs標(biāo)準(zhǔn)品溶液篩選靈敏度高、呈類特異性的單克隆源細(xì)胞株，共取得5株。其中，C1E6細(xì)胞株靈敏度最高，識(shí)別FQs標(biāo)準(zhǔn)品種類最多，其抗體特異性結(jié)果見表一。表一 C1E6細(xì)胞株 抗體特異性
權(quán)利要求
1.一種氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡，其特征在于:所述的氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡包括塑料盒體和封裝于塑料盒體內(nèi)的試紙條，所述試紙條的底層為支撐層，該支撐層上由左到右依次附著有緊密相連的樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，所述的塑料盒體上開有加樣孔和觀察窗，該加樣孔的位置與試紙條上的樣品墊位置相對(duì)應(yīng)，觀察窗與試紙條上的硝酸纖維素膜位置相對(duì)應(yīng)，所述的硝酸纖維素膜上有諾氟沙星一雞卵清白蛋白偶聯(lián)物溶液印制的檢測線和羊抗鼠IgG溶液印制的質(zhì)控線，所述的結(jié)合墊上灌注有膠體金標(biāo)記的抗氟喹諾酮類藥物類特異性單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡，其特征在于:所述的樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊和吸收墊上方覆蓋有膠膜保護(hù)層。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡，其特征在于:所述的膠體金標(biāo)記的 抗氟喹諾酮類藥物類特異性單克隆抗體是由環(huán)丙沙星一牛血清白蛋白偶聯(lián)物免疫Balb/C小鼠制備而來的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡，其特征在于:所述的氟喹諾酮類藥物為環(huán)丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、培氟沙星、依諾沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、洛美沙星和麻保沙星中的至少一種。
5.一種權(quán)利要求1所述的氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡的制備方法，其特征在于:首先將樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊按照由左到右的順序附著于支撐層上，所述的硝酸纖維素膜上有諾氟沙星一雞卵清白蛋白偶聯(lián)物溶液印制的檢測線和羊抗鼠IgG溶液印制的質(zhì)控線，然后用切割機(jī)制成試紙條，然后將試紙條封裝于帶有加樣孔和觀察窗的塑料盒體內(nèi)，制得氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡的制備方法，其特征在于所述樣品墊的制備方法為:將玻璃纖維棉用含有質(zhì)量濃度為2%的BSA、質(zhì)量濃度為1%的蔗糖、質(zhì)量濃度為0.5%的硼酸鈉和質(zhì)量濃度為0.1%的NaN3的PBS緩沖液處理后，干燥備用，即為樣品墊。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡的制備方法，其特征在于所述金標(biāo)抗體結(jié)合墊的制備方法為:將玻璃纖維棉裁成4 mm寬的細(xì)條,放入含有質(zhì)量濃度為5%的BSA、質(zhì)量濃度為2%的蔗糖、質(zhì)量濃度為0.8%的NaCl和質(zhì)量濃度為0.05%的NaN3的PBS緩沖液中20 min，37 1:恒溫烘干，然后將金標(biāo)抗體灌注已處理好的玻璃纖維棉上，真空凍干4 h，即為金標(biāo)抗體結(jié)合墊。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡的制備方法，其特征在于所述硝酸纖維素膜的制備方法為:將硝酸纖維素膜置于X-only單向噴點(diǎn)儀平臺(tái)上，檢測抗原放于A池，RaMIgG放于B池，展平壓緊，開機(jī)后將抗原和二抗分別點(diǎn)射于硝酸纖維素膜上，形成檢測線和質(zhì)控線，室溫自然干燥后，將其浸入BSA質(zhì)量濃度為1%的PBS緩沖液，pH值為7.4的封閉液中30 min，37 °C烘干后，加入干燥劑，4 °C密封保存。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡的制備方法，其特征在于所述諾氟沙星一雞卵清白蛋白偶聯(lián)物的制備方法為:將36 mg諾氟沙星溶解于2 mL DMF和2 mL 二氧六環(huán)中，4 °C預(yù)冷30 min，加入20 μ L三丁胺，冰浴10 min后加入40 μ L氯甲酸異丁酯，反應(yīng)60 min，即A液，將40 mg雞卵清白蛋白溶解于5 mL pH值為9.6的Na2CO3的緩沖溶液中，即B液，將A液逐滴加入到B液中，避光振蕩反應(yīng)4 h，反應(yīng)完成后先用蒸餾水透析3 d，再用PBS緩沖液透析3 d，紫外掃描透析液無小分子吸收峰時(shí)分裝于安瓿瓶中，— 20 °C凍干保存。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡的制備方法，其特征在于所述吸收墊的制備方法為:將以植物長纖維為原材料制作的純白濾紙用切割機(jī)切成4mm寬的細(xì)條，并用膠膜 進(jìn)行一側(cè)封閉，干燥備用，即為吸收墊。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡及其制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案要點(diǎn)為一種氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡，包括塑料盒體和封裝于塑料盒體內(nèi)的試紙條，所述試紙條的底層為支撐層，該支撐層上由左到右依次附著有緊密相連的樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，所述的硝酸纖維素膜上有諾氟沙星－雞卵清白蛋白偶聯(lián)物溶液印制的檢測線和羊抗鼠IgG溶液印制的質(zhì)控線，所述的結(jié)合墊上灌注有膠體金標(biāo)記的抗氟喹諾酮類藥物類特異性單克隆抗體。本發(fā)明還公開了該氟喹諾酮類藥物殘留快速檢測試紙卡的制備方法。本發(fā)明操作簡單、快速準(zhǔn)確、靈敏度高、成本低、穩(wěn)定性好，可進(jìn)行批量檢測。
文檔編號(hào)G01N33/531GK103091495SQ201310014748
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月16日
發(fā)明者姜金慶, 陳俊杰, 張曉建, 李桂平, 楊志, 孟曉梅, 原小燕, 栗克文, 周麗霞, 杜同亮 申請人:河南知微生物工程有限公司, 河南科技學(xué)院