專利名稱：一種制備型多維液相色譜儀的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在線二維制備液相色譜體系，通過二位十通閥及軟件將中高壓系統(tǒng)有機結(jié)合。一維系統(tǒng)既可以是中低壓系統(tǒng)，也可以是高壓系統(tǒng)；當(dāng)一維分離系統(tǒng)完成分離制備后，經(jīng)過二位十通閥切換，可以進入到第二維色譜柱，進行第二維分離；可以有兩根富集柱同時在線進行富集。本發(fā)明的優(yōu)點是項目集合了最前沿的相關(guān)色譜技術(shù)并加以創(chuàng)新，實現(xiàn)高中低高壓柱色譜與制備型RP-HPLC的全二維聯(lián)用，以二位十通閥-色譜工作站-自動流份收集器的結(jié)合實現(xiàn)自動化操作。通過本系統(tǒng)，將省去成分分離過程中溶液濃縮、樣品轉(zhuǎn)移及薄層檢測等人工操作，大大提高成分分離的效率。其創(chuàng)新點如下
背景技術(shù)：
天然來源成分的分離與制備一直是中藥及天然藥物研究過程中的一大瓶頸。由于 天然產(chǎn)物是復(fù)雜體系，通常一個樣品中包含了幾十甚至幾百種組分，而各組分之間量的差別通常又很大。因此，為了達到成分分離的目的，往往要結(jié)合多種色譜填料，進行反復(fù)的柱色譜分離操作。這一過程是繁瑣、漫長而枯燥的首先用柱色譜對天然產(chǎn)物提取物進行分離并對分離的流份進行分段收集，通過TLC檢測確定所需合并的流份，濃縮后再根據(jù)情況進行進一步的色譜柱分離(有時可能需要多次重復(fù)上述過程)，最終，用制備型HPLC進行分離，色譜峰收集后進行濃縮，由于流動相一般含有相當(dāng)比例的水，濃縮步驟也比較耗時。天然產(chǎn)物往往在冗長、繁多的柱色譜分離、溶劑濃縮和樣品轉(zhuǎn)移操作中受到損失或者結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，研究者不得不加大投料量以求獲得理想的結(jié)果。因此，如何最大限度減少人工操作、實現(xiàn)自動化分離，以提高效率、突破傳統(tǒng)方法所形成的瓶頸，顯得迫在眉睫。多維液相色譜技術(shù)近10年來，分析型的色譜儀器獲得了突飛猛進的發(fā)展，UPLC、HPLC-DAD_MS已經(jīng)普及，MDLC(multidimensional liquid chromatography,多維液相色譜)的出現(xiàn)更為中藥及天然產(chǎn)物成分的分析提供了更強有力的工具。MDLC是在高效液相色譜(HPLC)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項技術(shù)，它通過在技術(shù)上及設(shè)備上的改進，組合不同的分離模式構(gòu)建多維系統(tǒng)，有效地解決了復(fù)雜體系樣品的分析問題。與一維液相色譜系統(tǒng)相比，MDLC主要的優(yōu)勢在于提供了不同尋常的峰容量，這使得大多數(shù)目標(biāo)化合物和可實現(xiàn)基線分離。多維液相柱色譜的實現(xiàn)主要通過改變一定條件下特定樣品的選擇性，并在不同色譜柱間的切換來實現(xiàn)。在構(gòu)建多維液相色譜最關(guān)鍵的是固定相的選擇以及如何將樣品組分有效地導(dǎo)入第二維色譜柱中，即接口切換技術(shù)。接口切換技術(shù)是MDLC的核心技術(shù)之一。Jorgenson等人早在1990年在研究“中心切割”技術(shù)的基礎(chǔ)上第一次實現(xiàn)了“全二維切割”，他們用兩個定量管和一個八通閥實現(xiàn)了離子交換色譜(IE)和體積排阻色譜(SEC)的在線連接。自此，以四通閥、六通閥、八通閥、十通閥為代表的接口模式偶聯(lián)的全二維或多維色譜模式紛紛被設(shè)計運用。現(xiàn)有MDLC技術(shù)的不足由于蛋白質(zhì)組學(xué)的需要，MDLC技術(shù)得到快速發(fā)展，相關(guān)的技術(shù)方法也是為了適應(yīng)蛋白質(zhì)組學(xué)大分子分析目的而建立的。在中藥研究上雖然有所應(yīng)用，但也僅局限于樣品的分析。然而，在多數(shù)情況下，僅僅滿足分析需求是不夠的，如在關(guān)注天然產(chǎn)物中的未知及微量成分的時候，在需要更多的單體用于活性測定的時候，就需要對天然產(chǎn)物組分進行分離和制備，現(xiàn)有的MDLC技術(shù)無法滿足需求，主要體現(xiàn)在I、大容量樣品、流動相與現(xiàn)有接口切換技術(shù)不兼容現(xiàn)有的MDLC接口切換技術(shù)能夠滿足分析的需求，卻無法直接應(yīng)用于成分的分離制備。這是由于分離制備操作過程中需要處理的更大樣品量，接口要經(jīng)過體積更大的流動相的緣故。分析操作時，通過降低一維色譜流速、減少二維色譜的進樣量，由流動相所帶來的溶劑效應(yīng)基本可以忽略。但在制備色譜中，溶劑效應(yīng)問題是必須要解決的，這對接口切換技術(shù)提出更高的要求。II、固定相選擇的局限目前的MDLC更多采用的是SEC、RP、AC、IEC、HILIC之間的組合，這對大分子的分析更為有利。MDLC應(yīng)用于中藥成分分析時，常常以O(shè)DS(RP)作為二維，一維的色譜柱常常選·擇IEC、HILIC，CN柱、NH2柱或其它類型的RP柱。IEC的使用范圍有限，多用于含生物堿樣品的分析；HILIC，CN柱、NH2柱等其它類型的RP柱與ODS柱之間的正交性較差，聯(lián)用之后的峰容量提高有限。在天然產(chǎn)物成分研究中最常使用的色譜填料Sephadex LH20，聚酰胺(PA)，卻沒有得到應(yīng)有的重視。Sephadex LH20兼具分子篩和分配的色譜作用，特別適合天然產(chǎn)物成分的分離；聚酰胺(PA)所獨具的氫鍵作用力色譜行為使其在分離具有酚羥基或羰基的化合物時有特殊的效果。將Siiphadex LH20，聚酰胺的作用力特點與ODS的分配機理結(jié)合，能夠獲得更高的峰容量。

發(fā)明內(nèi)容
雖然MDLC技術(shù)在分析色譜中得到了較成功的應(yīng)用，但要將其應(yīng)用于天然產(chǎn)物成分分離的制備色譜中，需要對現(xiàn)有系統(tǒng)加以改造創(chuàng)新，也還有很多技術(shù)問題需要解決。本項目將通過制備型MDLC的構(gòu)建，借以突破天然產(chǎn)物成分研究中的瓶頸，改觀目前成分分離技術(shù)水平低下、步驟繁瑣、周期漫長的現(xiàn)狀。I.項目集合了最前沿的相關(guān)色譜技術(shù)并加以創(chuàng)新，以流動相稀釋-富集柱捕集接口為關(guān)鍵的技術(shù)突破，實現(xiàn)高中低壓柱色譜與制備型RP-HPLC的全二維聯(lián)用，以二位十通閥-色譜工作站-自動流份收集器的結(jié)合實現(xiàn)自動化操作。通過本系統(tǒng)，將省去成分分離過程中溶液濃縮、樣品轉(zhuǎn)移及薄層檢測等人工操作，大大提高成分分離的效率。其創(chuàng)新點如下2.項目方案所設(shè)計的制備型MDLC儀器系統(tǒng)，該系統(tǒng)由高中低壓柱ID色譜，制備型RP-HPLC的2D色譜系統(tǒng)構(gòu)成。色譜柱間以基于二位十通閥的流動相稀釋-富集柱捕集接口實現(xiàn)全二維切換。3.首次將MDLC應(yīng)用于成分分離制備，現(xiàn)有的MDLC系統(tǒng)均只能滿足分析的需求，卻無法直接應(yīng)用于成分的分離制備。這是由于分離制備操作要處理的樣品量更大，所要經(jīng)過的流動相體積更大的緣故。MDLC系統(tǒng)進行分析操作時，可以通過降低一維色譜流速、減少二維色譜的進樣量等方式來消除由流動相所帶來的溶劑效應(yīng)。但在制備色譜中，溶劑效應(yīng)問題是必須要解決的，這對接口切換技術(shù)提出更高的要求，我們?yōu)榇藢ｉT設(shè)計的流動相稀釋-富集柱捕集接口能夠很好地解決上述問題，可以很好的用于成分分離制備。這項工作在國內(nèi)外均屬首次嘗試。實施方式實施例I結(jié)合

圖1，圖2說明本發(fā)明的制備二維色譜分離系統(tǒng)。步驟I :二位十通閥在圖I狀態(tài)下，將分離待純化的物質(zhì)提取液由泵2泵入到一維柱色譜進行粗分。得到的化合物組分群經(jīng)由出口 3進入到富集柱2，富集柱2將目標(biāo)化合物富集。步驟2 :將二位十通閥切換到圖2狀態(tài)，泵I將洗脫液泵入到富集柱2中，將步驟I富集得到的化合物洗脫到二維色譜柱中進行精細分離，得到目標(biāo)化合物。與此同時，泵2繼續(xù)將一維柱色譜得到的組分經(jīng)出口 I泵入到到富集柱1，富集柱I將目標(biāo)化合物富集。 反復(fù)進行步驟I及步驟2，整個過程始終保持一維柱色譜粗分得到的化合物直接注入到富集柱I或者2，與此同時，另一根富集柱富集到的化合物泵入到二維色譜柱進行精細分離。
實施例粉碎的大黃藥材500g，水提取3次，每次3000ml水，合并濾液，HP20樹脂洗脫，得到待分類樣品。待分離的樣品的HPLC檢測條件儀器型號Agilent 1100型HPLC，色譜柱=Cosmosil 卩八0-(18，4.6\250臟，洗脫條件5%^ 100% MeOH，lml. min-1，40min，檢測波長254nm。HPLC分析圖譜見圖3樣品的多維制備分離第一維中低壓液相色譜參數(shù)中低壓輸液泵，流速lml. min- ;色譜柱Φ 2. 2cmX30cm,以粒徑75 μ M的ODS填充；流動相30 % — 60 %的甲醇/水梯度洗脫，共洗脫700ml ;稀釋液參數(shù)稀釋液為水，流速為lml. min-1 (I I混合)。富集柱0DS，粒徑5 μ Μ, Φ 2cmX 5cm(柱體積15· 7ml)。第二維制備型高效液相色譜參數(shù)流速8ml. min-1 ;色譜柱Cosmosil PAQ-C18,5 μ Μ, Φ2ο Χ 25cm(柱體積78.5ml);流動相20%— 80 %的甲醇/水梯度洗脫，50min ；254nm檢測。多維液相圖譜見圖4。圖4與圖3相比，經(jīng)過多維制備分離的樣品，已經(jīng)有效的將化合物組分群按照極性大小分離開，與普通的I維色譜相比，節(jié)約時間和使用的溶劑。
權(quán)利要求
1.一種制備型多維液相色譜儀，包括一維柱色譜，二維柱色譜，富集柱1，富集柱2，泵1，泵2，特征在于，泵2將待分離組分經(jīng)過一維柱色譜粗分的化合物群組分不斷的分配給富集柱I和富集柱2。當(dāng)泵2將化合物組分群分配給富集柱I時，泵I將富集柱2富集到的有效組分洗脫到二維柱色譜進行精細分離。當(dāng)泵2將化合物組分群分配給富集柱2時，泵I將富集柱I富集到的有效組分洗脫到二維柱色譜進行精細分離。
2.根據(jù)權(quán)利要求所述的制備型多維液相色譜系統(tǒng)，特征在于一維色譜柱可以使用高中低壓色譜柱。
3.權(quán)利要求I所述的制備型多維液相色譜儀的使用方法，特征在于包括如下操作步驟 a)二位十通閥在圖I狀態(tài)下，將分離待純化的物質(zhì)提取液由泵2泵入到一維柱色譜進行粗分。得到的化合物組分群經(jīng)由出口 3進入到富集柱2，富集柱2將目標(biāo)化合物富集。
b)步驟2:將二位十通閥切換到圖2狀態(tài)，泵I將洗脫液泵入到富集柱2中，將步驟I富集得到的化合物洗脫到二維色譜柱中進行精細分離，得到目標(biāo)化合物。與此同時，泵2繼續(xù)將一維柱色譜得到的組分經(jīng)出口 I泵入到到富集柱1，富集柱I將目標(biāo)化合物富集。
c)反復(fù)進行步驟I及步驟2，整個過程始終保持一維柱色譜粗分得到的化合物直接注入到富集柱I或者2，與此同時，另一根富集柱富集到的化合物泵入到二維色譜柱進行精細分離。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多維液相色譜聯(lián)用分離裝置。項目方案所設(shè)計的制備型多維液相色譜儀器系統(tǒng)，該系統(tǒng)由高中低壓柱1D色譜，制備型RP-HPLC的2D色譜系統(tǒng)構(gòu)成。色譜柱間以基于二位十通閥的流動相稀釋-富集柱捕集接口實現(xiàn)全二維切換。該系統(tǒng)集中高低壓柱色譜大容量的樣品處理能力，制備型RP-HPLC的高效分離能力于一體，實現(xiàn)高中低壓柱色譜與制備型RP-HPLC的全二維聯(lián)用，以二位十通閥-色譜工作站-自動流份收集器的結(jié)合實現(xiàn)自動化操作。通過本系統(tǒng)，將省去成分分離過程中溶液濃縮、樣品轉(zhuǎn)移及薄層檢測等人工操作，大大提高成分分離的效率。
文檔編號G01N30/08GK102961892SQ20111025630
公開日2013年3月13日 申請日期2011年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月1日
發(fā)明者李賀然, 丘鷹昆 申請人:李賀然, 丘鷹昆