專(zhuān)利名稱(chēng)：辣蓼藥材的hplc特征指紋圖譜研究技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高效液相色譜(HPLC)儀器、中藥等領(lǐng)域中應(yīng)用的一種質(zhì)量控制過(guò)程， 尤其是應(yīng)用于辣蓼藥材HPLC特征指紋圖譜。
背景技術(shù)：
辣蓼為蓼科植物水辣蓼/ ^ ^/ 腫hydropiper L.或旱辣蓼尺flaccidum Meisn .的干燥全草[1]。其味辛酸、性溫，歸脾、大腸經(jīng)，有導(dǎo)滯化濕；辣蓼是中國(guó)的一種資源十分豐富傳統(tǒng)中草藥，于北半球溫帶或亞熱帶地區(qū)都有分布，在中國(guó)大部分地區(qū)都有生長(zhǎng)。我國(guó)古代的許多醫(yī)書(shū)中都對(duì)辣寥的功用作了描述《本草綱目》“辣蓼，辛，溫，”《別錄》“蓼葉， 歸舌，除大小腸邪氣，利中益志?！薄短票静荨贰爸鞅簧邆?，搗敷之；絞汁服，治蛇毒人腹心悶； 水煮浸腳持之，消腳氣腫?！薄侗静菔斑z》“蓼葉，主痃癖，每日取60g煮服之；由霍亂轉(zhuǎn)筋，多取煮湯及熱搏腳；葉搗敷狐刺痣；亦主小兒頭瘡?！薄稁X南采藥錄》:“敷跌打，洗痣疥，止癢消腫?！睆幕瘜W(xué)成分角度而言，辣蓼主要含槲皮素、蘆丁、山奈酚、金絲桃苷、兒茶素和表兒茶素等黃酮成分；還有酚酸(沒(méi)食子酸、綠原酸、咖啡酸和阿魏酸)等成分。主要用于痢疾、腸胃炎、腹瀉、腳氣、疥癬、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、跌打腫痛、功能性子宮出血；外用治毒蛇咬傷、皮膚濕疹等癥狀[2]。國(guó)外近年來(lái)的研究表明，辣蓼具有抗微生物、殺蟲(chóng)、抗氧化、抗腫瘤等多種生物功效，由于地域與氣候條件的不同，其化學(xué)成分也有差異，現(xiàn)有技術(shù)中，尚沒(méi)有針對(duì)辣蓼藥材 HPLC特征指紋圖譜的研究方法。參考文獻(xiàn)羅杰，陸霞.HPLC法測(cè)定水辣蓼中蘆丁的含量[J].中草藥，3503085486.李安仁.中國(guó)植物志(第25卷第一分冊(cè))[M].北京科學(xué)出版社，1998:1-118·。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種針對(duì)辣蓼藥材HPLC特征指紋圖譜技術(shù)； 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明中采用了如下的技術(shù)方案，即采用辣蓼藥材HPLC特征指紋圖譜的具體方法(1)收集藥材包括Si、S2共2批為重慶地區(qū)收集，S3、S4、S5和S6共4 批為海南地區(qū)收集，S7、S8共2批為廣西地區(qū)收集，S9、SlO和Sll共3批分別來(lái)源于成都、廣東和江西各1批，共計(jì)11批辣蓼藥材，粉碎加工炮制成飲片(圖1)，減壓低溫干燥，備用。(2)辣蓼中主含2類(lèi)主要活性物質(zhì)黃酮成分(如槲皮素、蘆丁、山奈酚、金絲桃苷、兒茶素和表兒茶素等)和酚酸類(lèi)成分(沒(méi)食子酸、綠原酸、咖啡酸和阿魏酸)；由于其活性物質(zhì)的極性也有差別，最大吸收波長(zhǎng)的不同，對(duì)極性差別采用不同溶劑進(jìn)行提取，對(duì)最大吸收波長(zhǎng)的不同，采用日本島津HPLC-2010AHT高效液相色譜儀(包括自動(dòng)進(jìn)樣器，四元梯度泵，在線脫氣機(jī)，Lcbsolution化學(xué)工作站)，建立2個(gè)特征吸收波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)2類(lèi)有效物質(zhì)的指紋圖譜，并對(duì)指紋圖譜建立后進(jìn)行精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性分析，同時(shí)結(jié)合量化數(shù)據(jù)相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，及化學(xué)計(jì)量學(xué)中相似度分析方法，最終建立辣蓼的色譜指紋圖譜，以實(shí)現(xiàn)指紋圖譜的全面和整體評(píng)價(jià)。
以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。


圖1辣蓼藥材飲片
圖2參照物HPLC圖譜
圖3辣蓼藥材對(duì)照指紋圖譜(注-J號(hào)峰為參照物成分蘆丁) 圖4 11批不同產(chǎn)地辣蓼指紋圖譜匹配5 11批辣蓼藥材非共有峰面積之和占總峰面積的百分比。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明控制辣蓼藥材質(zhì)量方法一、實(shí)驗(yàn)材料與儀器
1、藥材
收集為重慶、海南、廣西、成都、廣東和江西辣蓼藥材，經(jīng)楊憲高工鑒定為蓼科植物水辣 MPolygonum hydropiper L.或旱辣蓼/7. flaccidum Meisn.的干燥全草。2、儀器和試劑
日本島津HPLC-2010AHT高效液相色譜儀(包括自動(dòng)進(jìn)樣器，四元梯度泵，在線脫氣機(jī)，Lcbsolution化學(xué)工作站)。瑞士 METTLER AE240分析天平；KQ-250E超聲清洗儀(上海綠宇生物科技有限公司)。蘆丁對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)100080-200707)。 沒(méi)食子酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110831-200803)。乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。二、方法及結(jié)果
1、供試品的制備，其特征在于
取收集并加工后的辣蓼樣品粉末適量，分別精密稱(chēng)取辣蓼約2. Og,精密加入80%甲醇 50ml，稱(chēng)定重量，加熱回流1小時(shí)，放冷，再稱(chēng)定重量，分別用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0. 45 μ m濾膜濾過(guò)，合并濾液，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；
2、參照物的制備，其特征在于
分別精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸和蘆丁對(duì)照品適量，加80%甲醇制成每IOOml含食子酸4. 21mg、 蘆丁 5. 16mg的參照物溶液；
3、色譜條件的建立，其特征在于
色譜柱，Waters ODS C18(250 mmX4. 6 mm, 5 μ m)；流動(dòng)相以0. 4%的磷酸緩沖鹽為A， 乙腈為B，梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?-8min，B的濃度(ν/ν)保持為9% ；8-20min,B的濃度變化 9%-14% ；20-40min, B 的濃度變化 14%-20% ；40_50min，B 的濃度變化為 20%_45% ；50_65min， B的濃度變化為45%-80% ；65-88min, B的濃度保持為80% ；流速為0. 9ml/min ；柱溫30°C ； 進(jìn)樣量10 μ 1 ；檢測(cè)波長(zhǎng):0-25min和55_88min范圍內(nèi)，設(shè)為273nm, 25_55min范圍內(nèi)，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為360nm。指紋圖譜方法學(xué)考察精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果辣蓼的共有峰為15個(gè)(圖3)，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間結(jié)果表明共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均不大于5. 0%， 共有峰相對(duì)峰面積均小于3. 0%;試驗(yàn)表明儀器精密度、重復(fù)良好，供試品溶液在48h內(nèi)基本穩(wěn)定。5、指紋圖譜的構(gòu)建 5. 1參照色譜峰的選擇
通過(guò)色譜圖比較，在共有峰確定的基礎(chǔ)上(見(jiàn)5. 2描述)，按峰面積由大到小統(tǒng)計(jì)各樣品色譜圖中強(qiáng)信號(hào)峰，根據(jù)各藥材的成分情況，隨機(jī)選擇一個(gè)出峰時(shí)間較居中的成分作為參照峰(s)，辣蓼藥材中含有沒(méi)食子酸成分(圖2)和蘆丁成分(圖2中和圖3中的7號(hào)峰)，而蘆丁既是常用藥材定量控制成分，出峰也居中，適合作為參照峰，本發(fā)明將蘆丁峰定為參照峰(S)。5. 2共有色譜峰確定
根據(jù)11批次各供試品HPLC圖譜，采用軟件《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A 版》(國(guó)家藥典委員會(huì))，通過(guò)色譜峰采用多點(diǎn)校正方法行色譜峰的自動(dòng)匹配，以辣蓼藥材第1批作為參照?qǐng)D，以平均數(shù)法作為對(duì)照指紋圖譜的生成方法，設(shè)定的時(shí)間窗寬度參數(shù)為 0. 50mino辣蓼藥材的對(duì)照色譜圖和11批藥材指紋圖譜匹配圖分別見(jiàn)圖3和圖4。通過(guò)峰匹配，11批辣蓼藥材共有峰為15個(gè)(圖3)；
5. 3相對(duì)保留時(shí)間(tK)和相對(duì)峰面積(Ak)的確定
以選定的蘆丁成分在各批次藥材指紋圖譜的保留時(shí)間和峰面積為1，各指紋峰保留時(shí)間與同一圖譜中參照物的保留時(shí)間相比，比值為各指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間，同理，各共有峰的峰面積與同一圖譜中參照物的峰面積相比，比值為各共有峰的相對(duì)峰面積。11批辣蓼藥材的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積見(jiàn)表1和表2。5. 4非共有峰占占總峰面積的百分比
通過(guò)對(duì)11辣蓼藥材供試品測(cè)定，統(tǒng)計(jì)各批非共有峰占相應(yīng)圖譜總峰面積的百分比， 結(jié)果表明11辣蓼藥材的指紋圖譜中，非共有峰面積之和占總峰面積的百分比(圖5)為 5. 88-8. 22%，符合“中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求”規(guī)定小于10%的檢測(cè)要求。從而也間接說(shuō)明，原藥材的質(zhì)量變化由產(chǎn)地等因素影響，因此，通過(guò)對(duì)指紋圖譜的研究，原藥材的質(zhì)量得到控制，并符合要求，由它們制成的中藥的質(zhì)量得也才能保持穩(wěn)定性和一致性。5. 5相似度分析
選取色譜圖中的共有峰，由“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004年A版”中藥色譜圖分析和數(shù)據(jù)管理軟件輔助自動(dòng)進(jìn)行峰匹配，采用相關(guān)系數(shù)法(見(jiàn)圖3)進(jìn)行相似度計(jì)算， 結(jié)果見(jiàn)表3，辣蓼藥材相似度大于0. 95，表明各批次藥材之間具有較好的一致性，本方法可用于綜合評(píng)價(jià)辣蓼藥材的整體質(zhì)量分析
表1 11批辣蓼藥材的相對(duì)保留時(shí)間(tK)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種辣蓼藥材HPLC特征指紋圖譜建立方法，包括如下步驟a.供試品的制備取收集并加工后的辣蓼樣品粉末適量，分別精密稱(chēng)取辣蓼約2.0g， 精密加入80%甲醇50ml，稱(chēng)定重量，加熱回流1小時(shí)，放冷，再稱(chēng)定重量，分別用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0. 45 μ m濾膜濾過(guò)，合并濾液，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；b.參照物的制備分別精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸和蘆丁對(duì)照品適量，加80%甲醇制成每IOOml 含食子酸4. 21mg、蘆丁 5. 16mg的參照物溶液；c.色譜條件的建立色譜柱，litersODS C18(250 mmX4. 6 mm, 5 μ m ；流動(dòng)相，以0. 4% 的磷酸緩沖鹽為A，乙腈為B，梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?-8min，B的濃度(ν/ν)保持為9% ； 8-20min, B的濃度變化9%-14% ；20-40min, B的濃度變化14%-20% ；40-50min, B的濃度變化為20%-45% ；50-65min, B的濃度變化為45%_80% ；65_88min，B的濃度保持為80% ；流速為 0. 9ml/min ；柱溫:30°C ；流速，0. 9mL/min ；進(jìn)樣量 10 μ 1 ；檢測(cè)波長(zhǎng):0_25min 和 55_88min 范圍內(nèi)，設(shè)為273nm，25_55min范圍內(nèi)，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為360nm。
2.如權(quán)利要求1所述辣蓼藥材的檢測(cè)方法，其特征在于步驟c所述流動(dòng)相是0.4%的磷酸-乙腈。
3.如權(quán)利要求1所述辣蓼藥材的檢測(cè)方法，其特征在于步驟c所述檢測(cè)波長(zhǎng)0-25min 和55-88min范圍內(nèi)，設(shè)為273nm，25_55min范圍內(nèi)，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為360nm。
全文摘要
本發(fā)明提供了辣蓼高效液色譜(HPLC)特征指紋圖譜建立方法，包括11批不同產(chǎn)地的辣蓼藥材收集、供試品的制備、參照物的制備、色譜條件的建立、指紋圖譜的構(gòu)建等過(guò)程，通過(guò)建立辣蓼藥材高效液相色譜(HPLC-UV)指紋圖譜技術(shù)，達(dá)到對(duì)辣蓼藥材質(zhì)量進(jìn)行穩(wěn)定、可控的目的。
文檔編號(hào)G01N30/88GK102279240SQ201110185409
公開(kāi)日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月4日
發(fā)明者何興國(guó), 劉瑋琦, 張雪, 楊憲, 楊水平, 王伯初 申請(qǐng)人:楊憲