專利名稱：珠子草藥材指紋圖譜的建立方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥材指紋圖譜的建立方法，尤其是珠子草藥材高效液相色譜 (HPLC)指紋圖譜的建立方法，以及由此方法所得到的珠子草藥材HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，屬于藥物分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
珠子草為大戟科葉下珠屬植物珠子草niruri Zi/w)的干燥全草， 作為傳統(tǒng)的傣藥，有上千年的應(yīng)用歷史。以珠子草為主要原料生產(chǎn)的“珠子肝泰膠囊”，是目前治療肝病首選的中成藥。該藥自1999年成功上市以來，銷量成倍增長，也被國家推薦為治療肝病的18種藥物之一。然而，優(yōu)良藥物的生產(chǎn)離不開藥物生產(chǎn)原料在質(zhì)量品質(zhì)上的穩(wěn)定和有效。目前珠子草藥材以野生為主，人工栽培較少，而且不同地區(qū)用藥習(xí)慣的不同造成品種混亂，其質(zhì)量各不統(tǒng)一，有時(shí)差異甚大。另一方面，云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)中收載的“珠子草”品種項(xiàng)下，對珠子草的質(zhì)量控制也顯得非常薄弱，只包括顯微鑒別以及水分、灰分、浸出物等常規(guī)性檢查，缺乏完善的質(zhì)量評價(jià)體系，難以達(dá)到對珠子草質(zhì)量的有效控制。隨著科技的發(fā)展，指紋圖譜質(zhì)控技術(shù)在中藥領(lǐng)域被提出并得到廣泛認(rèn)可，其在中藥材及其提取物/制劑等質(zhì)控中的應(yīng)用也越來越多，它為中藥材及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制及評價(jià)提供了新的思路和方法。目前獲得指紋圖譜的主要手段是色譜法和光譜法，其中色譜指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒別手段，可以判斷藥材的真?zhèn)巍⒃u價(jià)優(yōu)劣，可以在整體和局部區(qū)分不同品種的藥材、同一品種野生和種植或者組織培養(yǎng)材料、同一品種不同產(chǎn)地的藥材、同一品種同一產(chǎn)地不同年份的藥材。因此，有必要利用色譜指紋圖譜對珠子草藥材的質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)。迄今為止，對珠子草的報(bào)道多集中在藥理方面，未見有關(guān)珠子草藥材指紋圖譜的專利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對珠子草藥材缺乏完善的質(zhì)量評價(jià)體系，難以有效控制其質(zhì)量的問題，提供一種珠子草藥材HPLC指紋圖譜的建立方法，以及由此方法所得到的珠子草藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以此達(dá)到完善其質(zhì)量評價(jià)體系，有效控制珠子草藥材質(zhì)量的目的。本發(fā)明所述珠子草為大戟科葉下珠屬植物珠子草niruri Linnm
干燥全草。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下。珠子草藥材指紋圖譜的建立方法，包括下述主要步驟。(1)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備精密稱取對照品沒食子酸2. 69mg，柯里拉京2. 33mg，用甲醇配制成沒食子酸2. 69mg · mL—1，柯里拉京2. 33 mg · mL—1的儲備溶液，使用時(shí)稀釋成工作對照品溶液。(2)供試品溶液的制備干燥的藥材粉碎過60目篩，精密稱取藥材粉末3份，每份
45g，置平底燒瓶中，精密加入超純水100 300mL，94°C水浴提取1 3h，過濾，濾液濃縮，定容至50ml，用微孔濾膜(0. 45Mfli)濾過，既得。(3)高效液相色譜分析分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液，分別注入高效液相色譜儀中進(jìn)行高效液相色譜檢測，記錄90min內(nèi)的HPLC圖譜；其中，色譜條件為色譜柱 Sphenomenex Gemini C18 色譜柱(4. 6mmX 250mm, 5Mm)；以乙腈 _0· 4% 磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫的程序設(shè)為時(shí)間梯度0、25、35、60、75、90、110、115、120min，乙腈對應(yīng)的濃度梯度為 3%、8%、12%、15%、18%、20%、60%、3%、3% ；流速為 0. 2 2. OmL · mirT1 ；檢測波長 220 480nm ；柱溫20 50°C ；進(jìn)樣量為1 20μ ；在此高效液相色譜條件下分析供試品溶液，得到珠子草藥材的指紋圖譜。(4)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的確定按照本發(fā)明提供的方法，對15批的珠子草藥材建立了 HPLC指紋圖譜，通過分析比較，確定了 26個共有特征峰，這些共有特征峰構(gòu)成了珠子草藥材的指紋特征，可作為珠子草藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。通過分析比較，確定了珠子草藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜具有如下26個共有特征峰，其中第3個為沒食子酸的特征峰，第19個為柯里拉京的特征峰，以第17個特征峰為參照，計(jì)算其余特征峰相對應(yīng)的相對保留時(shí)間和相對峰面積。所得結(jié)果見下述表1。表1 珠子草藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜
權(quán)利要求
1.一種珠子草藥材高效液相色譜指紋圖譜的建立方法，其特征包括標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備、供試品溶液的制備、指紋圖譜的制作和標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的確定。
2.按照權(quán)利要求1所述的珠子草藥材高效液相色譜指紋圖譜的建立方法，其特征是所述的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備方法為精密稱取對照品沒食子酸纊3mg，柯里拉京2 3mg，用甲醇配制成沒食子酸2 3mg · mL—1，柯里拉京2 3 mg · mL—1的儲備溶液，使用時(shí)稀釋成工作對照品溶液。
3.按照權(quán)利要求1所述的珠子草藥材高效液相色譜指紋圖譜的建立方法，其特征是所述的供試品溶液的制備方法為干燥的藥材粉碎過60目篩，精密稱取藥材粉末3份，每份 5g，置平底燒瓶中，精密加入超純水100 300mL，94°C水浴提取1 3h，過濾，濾液濃縮，定容至50ml，用微孔濾膜(0. 45Mfli)濾過，既得。
4.按照權(quán)利要求1所述的珠子草藥材高效液相色譜指紋圖譜的建立方法，其特征是所述的指紋圖譜的制作過程為分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液，分別注入高效液相色譜儀中進(jìn)行高效液相色譜檢測，記錄90min內(nèi)的HPLC圖譜；其中，色譜條件為色譜柱為 C18色譜柱(4. 6mmX 250mm, 5Mm)；以乙腈-0. 4%磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫的程序設(shè)為時(shí)間梯度0、25、35、60、75、90、110、115、120111土11，乙腈對應(yīng)的濃度梯度為 3%、8%、12%、15%、 18%、20%、60%、3%、3% ；流速為 0. 2 2. OmL .mirT1 ；檢測波長 220 480nm ；柱溫 20 50°C ； 進(jìn)樣量為1 20μ ；在此高效液相色譜條件下分析供試品溶液，得到珠子草藥材的指紋圖譜。
5.按照權(quán)利要求1所述的珠子草藥材高效液相色譜指紋圖譜的建立方法，其特征是所述的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的確定結(jié)果為對15批珠子草藥材建立了 HPLC指紋圖譜，確定了 26個共有特征峰，以色譜圖中的17號特征峰為參照，計(jì)算得珠子草藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中各特征峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積分別如下相對保留時(shí)間1號峰0. 1597 0. 1896,2 號峰0.1769 0.2027,3 號峰0. 2368 0.2615，4號峰0. 3119 0. 3420,5 號峰0.3755 0.3989,6 號峰0. 4281 0.4576，7號峰0. 4716 0. 4971,8 號峰0.5089 0.5418,9 號峰0. 5670 0.5902，10號峰0. 6089 0. 6272，11號峰0. 6072 0. 6525，12 號峰0. 6672 --0.6882,13號峰0. 7227 0. 7437，14號峰0. 7523 0. 7900，15 號峰0. 8479 --0.8602,16號峰0. 8998 0. 9081，17號峰1,18號峰1. 0594 1. 0629,19號峰1. 1247 1. 1305,20號峰1. 1841 1. 1942,21 號峰1. 3599 --1. 3814，22號峰1. 4319 1. 4558,23號峰1. 6040 1. 6300,24 號峰1. 7270 --1. 7471，25號峰1. 7984 1. 8405,26號峰1. 8550 1. 8913 ；相對峰面積1號峰0. 0020 0. 0075，2 號峰0. 0286 0. 0507，3 號峰0. 2295 0. 4079， 4 號峰0. 0117 0. 0205,5 號峰0. 0104 0. 0618，6 號峰0. 0201 0. 0932， 7 號峰0. 0024 0. 0256,8 號峰0. 0237 0. 0349，9 號峰0. 0045 0. 0111， 10 號峰0. 0130 0. 0232，11 號峰0. 0102 0. 0251，12 號峰0. 0020 0. 0089， 13 號峰0. 0055 0. 0319，14 號峰0. 0016 0. 0131，15 號峰0. 0224 0. 0524， 16 號峰0. 0164 0. 0329，17 號峰1，18 號峰0. 0531 0. 0986，.19 號峰0. 6704 0. 9616,20 號峰0. 0225 0. 0360,21 號峰0. 1811 0. 2517， 22 號峰0. 0660 0. 1175,23 號峰0. 0528 0. 1161,24 號峰0. 2053 0. 4537， 25 號峰0. 0219 0. 0747，26 號峰0. 0064 0. 0369 ；這些共有特征峰構(gòu)成了珠子草藥材的指紋特征，可作為珠子草藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種珠子草藥材高效液相指紋圖譜的建立方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以沒食子酸和柯里拉京為對照品，將對照品溶液與供試品溶液在同一色譜條件下進(jìn)行HPLC檢測，梯度洗脫，記錄色譜圖，即得。通過對15批珠子草藥材HPLC指紋圖譜的對比，確定了26個共有特征峰，這些共有特征峰構(gòu)成了珠子草藥材的指紋特征，可作為珠子草藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。本發(fā)明具有方法簡便、重現(xiàn)性好、特征峰多、準(zhǔn)確可靠等特點(diǎn)，所建立的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜能有效的表征珠子草藥材的質(zhì)量，為完善珠子草藥材的質(zhì)量評價(jià)體系提供了理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。
文檔編號G01N30/86GK102331458SQ20111016103
公開日2012年1月25日 申請日期2011年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月16日
發(fā)明者唐德英, 李學(xué)蘭, 牛迎鳳, 陳曦 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所