專利名稱：β淀粉樣蛋白的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及0淀粉樣蛋白(后文中以AP進(jìn)行說明)的高靈敏度測定方法。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默氏病是從剛進(jìn)入老年期到老年期發(fā)生的以進(jìn)行性的癡呆(認(rèn)知癥)為特征在疾病。目前，據(jù)說日本國內(nèi)的患者數(shù)量達(dá)到100萬人以上?？梢灶A(yù)計在未來，伴隨人口的老齡化，這一數(shù)字一定會增加。阿爾茨海默氏病的臨床癥狀為記憶障礙、高級腦功能障礙(失語、失用、失認(rèn)、結(jié)構(gòu)性失用(constructional aparaxia))等。這些癥狀在其他癡呆癥中也常見，僅通過臨床癥狀確診為阿爾茨海默氏病是非常困難的。
迄今為止，阿爾茨海默氏病沒有根本治療的方法，自1999年疫苗療法在小鼠模型中成功以來，對于開發(fā)根本治療的方法的期待不斷增加(參見非專利文獻(xiàn)I)。為了有效地利用這些根本治療的方法，需要早期診斷阿爾茨海默氏病。作為阿爾茨海默氏病的特征性病理組織觀察結(jié)果，有腦組織中的老年斑和神經(jīng)元纖維變化。前者的主要構(gòu)成成分是具有P折疊結(jié)構(gòu)的AP的凝集體，后者的主要構(gòu)成成分是過度磷酸化的微管聚合蛋白(tau蛋白)。目前，關(guān)于阿爾茨海默氏病的發(fā)病，AP蓄積是最初發(fā)生的病理變化，這一淀粉樣蛋白假說是非常有力的(參見非專利文獻(xiàn)2)。S卩，已知在阿爾茨海默氏病中，在出現(xiàn)臨床癥狀之前，發(fā)生AP在腦內(nèi)蓄積等上述病理上的組織變化。因此，作為標(biāo)記檢測腦內(nèi)的AP肽，成為TAP蓄積的疾病、特別是阿爾茨海默氏病的早期診斷方法之一。作為阿爾茨海默氏病的體外診斷劑，廣泛采用以使用對AP的特異性抗體的ELISA法為原理的診斷劑。根據(jù)ELISA法，基本確定了隨著阿爾茨海默氏病的進(jìn)行，腦脊液中由42個氨基酸構(gòu)成的AP (A ￠42)減少(參見非專利文獻(xiàn)3)。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I :Schenk D, Seubert P et al. , Nature 400:173-177, 1999.非專利文獻(xiàn)2:Hardy JA, Selkose DF, Science 297:353-356, 2002.非專利文獻(xiàn)3 :Hansson 0, Mithon L et al. , Lancet Neurol 5:228-234, 2006.

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的技術(shù)問題但是，例如以將機體組織清洗而得到的清洗液這樣的、以極低濃度(數(shù)PM的程度)含有AP的物質(zhì)為樣品，實施上述ELISA法等基于抗原抗體反應(yīng)的定量測定時，由于濃度極低，所以存在不能精確測定的問題。本發(fā)明是為了解決上述問題而完成的，其目的在于提供一種AP測定方法，即使在以數(shù)PM程度的極低濃度含有AP的樣品中，也能夠準(zhǔn)確地測定AP濃度。解決技術(shù)問題的手段
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種P淀粉樣蛋白的測定方法，其包括樣品準(zhǔn)備工序，在樣品處理容器中加入可能含有3淀粉樣蛋白的樣品；濃縮工序，在上述樣品處理容器中的上述樣品中添加能夠使3淀粉樣蛋白溶液化的增溶劑，通過濃縮操作，降低上述樣品中含有的溶劑的量；中和工序，中和在上述濃縮工序中獲得的樣品處理液中的上述增溶劑；和測定工序，基于抗原抗體反應(yīng)，確定經(jīng)過上述中和后的樣品處理液中可能含有的P淀粉樣蛋白的量。本發(fā)明還提供一種3淀粉樣蛋白的測定方法，其包括樣品處理容器準(zhǔn)備工序，在樣品處理容器中加入用于使3淀粉樣蛋白附著的添加劑；樣品準(zhǔn)備工序，在上述樣品處理容器中加入可能含有3淀粉樣蛋白的樣品；第一濃縮工序，將上述樣品處理容器內(nèi)的上述樣品濃縮；第二濃縮工序，在通過上述第一濃縮工序濃縮后的樣品中，添加能夠使P淀粉樣蛋白溶液化的增溶劑，通過濃縮操作，降低上述樣品中含有的溶劑的量；中和工序，中和在上述第二濃縮工序中獲得的樣品處理液中的上述增溶劑；和測定工序，基于抗原抗體反應(yīng)，確定經(jīng)過上述中和后的樣品處理液中可能含有的P淀粉樣蛋白的量。
發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明的0淀粉樣蛋白的測定方法，即使在以極低濃度(例如數(shù)PM的程度)含有AP的樣品中，也能夠準(zhǔn)確地測定AP濃度。


圖I是表不實施例I的各步驟的流程圖。圖2是表示實施例I中測得的AP濃度的結(jié)果的圖。圖3是表不實施例2的各步驟的流程圖。圖4是表示實施例2中測得的AP濃度的結(jié)果的圖。圖5是表不實施例3的各步驟的流程圖。圖6是表示由實施例3獲得的AP回收率的結(jié)果的圖。圖7是表不實施例4的各步驟的流程圖。圖8是表示由實施例4獲得的AP回收率的結(jié)果的圖。圖9是表示參考例的各步驟的流程圖。圖10是表示由參考例獲得的AP回收率的結(jié)果的圖。圖11是表示本發(fā)明第一實施方式的AP測定方法各步驟的流程圖。圖12是表示本發(fā)明第二實施方式的AP測定方法各步驟的流程圖。圖13是表示由于有無增溶劑的差異帶來的AP回收率的差異的圖。
具體實施例方式本發(fā)明的AP測定方法中的AP是凝集性和吸附性高的物質(zhì)。這是因為構(gòu)成A 3的氨基酸大多由疏水性高的氨基酸構(gòu)成?！澳愿摺币馕吨鳤P本身容易締合而凝集的性質(zhì)。這里，將不凝集而以一個分子游離的々0稱為AP單體。另外，將兩個分子以上的AP凝集、但是能夠溶解在生理鹽水中等水溶液中的AP稱為可溶性AP多聚體或可溶性AP低聚物(以下統(tǒng)稱為可溶性A3低聚物)。此外，將從上述可溶性A3低聚物的狀態(tài)繼續(xù)凝集、不溶于上述水溶液的AP稱為不溶性々0多聚體或不溶性々0聚合物(以下統(tǒng)稱為不溶性AP聚合物)。一般而言，疏水性強的AP在水溶液中以凝集物存在更為穩(wěn)定是凝集性高的原因?！拔叫愿摺币馕吨鳤 P容易被吸附于A P以外的物質(zhì)的性質(zhì)。AP以外的物質(zhì)例如為容器表面，或者為機體組織。在任何情況下都可以認(rèn)為AP以外的物質(zhì)的疏水性區(qū)域與AP的疏水性區(qū)域的疏水相互作用是原因之一。在八0單體中，尤為重要的是由42個氨基酸構(gòu)成的AP單體(將其稱為A￠42)和由40個氨基酸構(gòu)成的AP單體(將其稱為AM0)?？梢哉J(rèn)為，已知作為阿爾茨海默氏病的特征現(xiàn)象的、在腦組織中形成老年斑，是由上述AP 42和AP 40的凝集性和吸附性引起的。目前，在臨床實踐中，髓液中的A P 42和A P 40視為測定指標(biāo)。對A P 42和A P 40進(jìn)行比較，A342的凝集性和吸附性都相對較強。在本發(fā)明中，在沒有特別說明的情況下，“AP ”一并 表示AP單體、可溶性々0低聚物和不溶性々0聚合物。此外，在沒有特別說明的情況下，“A3單體”表示A3 42和A3 40。本發(fā)明的AP測定方法中的樣品是從阿爾茨海默氏病患者或懷疑患有阿爾茨海默氏病的被檢測者采集的體液(例如，腦脊液、血清、淚液、鼻涕、唾液等)。或者是通過利用棉棒或藥簽等采集工具從上述被檢測者的鼻粘膜采集鼻粘液而獲得的鼻涕或鼻腔內(nèi)粘膜摩擦物?；蛘撸鲜鰳悠愤€可以是利用生理鹽水等對可能凝集或吸附有上述A3的機體組織(例如腦組織或粘膜等)進(jìn)行清洗而獲得的清洗液。在本發(fā)明中，可以將通過利用棉棒或藥簽等采集工具從上述被檢測者的鼻粘膜采集鼻粘液而獲得的鼻涕或鼻腔內(nèi)粘膜摩擦物作為樣品。這是因為發(fā)現(xiàn)了腦內(nèi)的々0在鼻粘膜周圍的組織蓄積的傾向。具體而言，可以使用藥簽或棉棒(例如，榮研化學(xué)株式會社生產(chǎn)的Y滅菌鋁軸棉棒)進(jìn)行采集。通過將藥簽或棉棒等在鼻粘膜上擦拭，采集鼻粘液，將該采集的鼻粘液本身作為樣品，或者將利用規(guī)定的提取液從該棉棒提取的鼻粘液作為樣品。其中，作為規(guī)定的提取液，可以列舉生理鹽水、含有表面活性劑的溶液、有機溶劑等。在本發(fā)明中，特別是可以將利用生理鹽水等對鼻粘膜進(jìn)行清洗而獲得的清洗液作為樣品。這是因為發(fā)現(xiàn)了腦內(nèi)的々0在鼻粘膜周圍的組織蓄積的傾向。具體而言，可以使用通常出售的鼻腔清洗設(shè)備采集上述清洗液。例如，使用泉精器制作所生產(chǎn)并出售的鼻清洗器(商品名INC-7000、INC-7200、INC-7001)，從一個鼻孔注入生理鹽水，從另一個鼻孔接受清洗后的生理鹽水。這樣一來，就能夠?qū)⒈乔逑春蟮玫降囊后w全部采集，將其作為本發(fā)明的樣品。其中，注入鼻腔內(nèi)使用的清洗用液體，只要是具有生物相容性的液體即可，不限于生理鹽水。本發(fā)明的AP測定方法中作為對象的樣品中的AP的量，可以為極微量。由于 在粘膜等機體組織中牢固地凝集或吸附，所以在前面提及的利用藥簽或棉棒采集鼻粘
液時，需要將該采集工具在鼻粘膜上用力地擦拭多次。然而，這樣獲得的鼻粘液中的A3是微量的，所以在用提取液提取時，樣品中的AP濃度進(jìn)一步降低。此外，在前面提及的進(jìn)行鼻清洗時，由于利用少量的生理鹽水難以取出AP，所以需要使用大量的生理鹽水進(jìn)行鼻清洗。因此，獲得的樣品中的AP濃度極低。粘膜等機體組織中所含的A ^大部分是可溶性A ^低聚物或不溶性A ^聚合物， 單體為極微量。因此，例如使用和光純藥株式會社生產(chǎn)并出售的AP單體定量用試劑
盒，對鼻粘液和鼻清洗液進(jìn)行直接ELISA測定時，無法確認(rèn)AP的存在。因此，制備測定時的濃度調(diào)整為規(guī)定的濃度(A ￠40為50pM，A ￠42為IOpM)的樣品，進(jìn)行減壓濃縮后，利用ELISA對該樣品進(jìn)行測定。于是，盡管非常微量，但也能夠確UAP的存在。因此，當(dāng)鼻粘液和鼻清洗液中所含的AP 40單體濃度低于50pM、AP 42單體濃度低于IOpM時，被認(rèn)為是極低。主要在腦組織中蓄積，但是其他的體細(xì)胞、或者例如血液、腦脊液、鼻涕等體液中也有極微量的々0分泌。但是，例如，為了從鼻粘膜采集樣品，將藥簽或棉棒在鼻粘膜上擦拭，或者用清洗用液體對鼻粘膜進(jìn)行清洗。在用藥簽或棉棒采集時，優(yōu)選用提取液對所采集的鼻粘液進(jìn)行提取。此外，在通過鼻清洗進(jìn)行采集時，優(yōu)選使用大量的清洗用液體進(jìn)行清洗。故而樣品中的AP濃度降低。因此，在進(jìn)行測定之前，需要對樣品進(jìn)行濃縮操作以提高樣品中的AP濃度。濃縮操作通?？梢允褂脺p壓濃縮。本發(fā)明的發(fā)明人著眼于濃縮工序，對濃縮工序的條件和方法進(jìn)行各種改變，反復(fù)進(jìn)行實驗。經(jīng)過深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在濃縮工序中，樣品所含的溶劑蒸發(fā)，樣品中的溶劑量減少，但是，在該過程中，樣品中所含的AP 40或AP 42的 單體彼此之間凝集，產(chǎn)生大量的單體的凝集物。即，明確了當(dāng)直接對樣品進(jìn)行濃縮操作時，樣品中的A P 40或A P 42的單體彼此之間凝集而形成牢固的凝集物，因此樣品中的A 3 40或AP42的單體量劇減，其結(jié)果導(dǎo)致ELISA法測得的AP的測定值減少。因此，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，為了防止在濃縮工序中單體之間的凝集，在樣品中添加甲酸等增溶劑之后實施濃縮工序時，AP的測定靈敏度顯著提高。結(jié)果如圖13所示。將前面所示的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)調(diào)節(jié)至規(guī)定的濃度，并加入甲酸之后進(jìn)行濃縮，將由此獲得的樣品與不加入甲酸進(jìn)行濃縮而得到的樣品進(jìn)行比較，得到了約26倍至28倍的AP的測定值。由此可以判斷，通過添加甲酸等增溶劑實施濃縮工序，與不進(jìn)行添加而直接進(jìn)行濃縮工序的情況相比，能夠以極高的靈敏度進(jìn)行AP的測定。本發(fā)明的AP的測定方法包括樣品準(zhǔn)備工序，在樣品處理容器中加入可能含有^淀粉樣蛋白的樣品；濃縮工序，在上述樣品處理容器中的上述樣品中添加能夠使3淀粉樣蛋白溶液化的增溶劑，通過濃縮操作，降低上述樣品中含有的溶劑的量；中和工序，中和在上述濃縮工序中獲得的樣品處理液中的上述增溶劑；和測定工序，基于抗原抗體反應(yīng)，確定經(jīng)過上述中和后的樣品處理液中可能含有的3淀粉樣蛋白的量。通過包括上述工序，從而在測定前使樣品中所含的AP溶液化，并且由溶液化形成的AP單體經(jīng)過濃縮工序也能夠被保持，因而能夠更準(zhǔn)確地進(jìn)行A3的定量測定。在本發(fā)明的AP測定方法中，優(yōu)選在樣品處理容器中加入樣品之前，在樣品處理容器中加入用于使AP附著的添加劑。由此，添加劑附著在々0上，能夠抑制AP之間的凝集。此外，在本發(fā)明中，在以鼻清洗液這種大量的樣品作為測定對象時，在進(jìn)行上述濃縮工序之前實施預(yù)濃縮工序較為有效。即，本發(fā)明優(yōu)選包括在上述濃縮工序(第二濃縮工序)之前，對上述樣品處理容器內(nèi)的上述樣品進(jìn)行濃縮的預(yù)濃縮工序(第一濃縮工序)。由此，能夠有效地實施接下來的濃縮工序(第二濃縮工序)。此外，本發(fā)明優(yōu)選包括樣品處理容器準(zhǔn)備工序，在該工序中，在上述樣品準(zhǔn)備工序使用的樣品處理容器中加入用于使AP附著的添加劑。由此，能夠提高AP的回收率，能夠更準(zhǔn)確地進(jìn)行A 3的定量測定。特別是在實施上述預(yù)濃縮工序的情況下，通過預(yù)先在樣品處理容器中加入用于使々0附著的添加劑，能夠防止在預(yù)濃縮工序中發(fā)生AP的不溶化，能夠更準(zhǔn)確進(jìn)行AP的定量測定。本發(fā)明的AP測定方法包括樣品處理容器準(zhǔn)備工序，在樣品處理容器中加入用于使3淀粉樣蛋白附著的添加劑；樣品準(zhǔn)備工序，在上述樣品處理容器中加入可能含有^淀粉樣蛋白的樣品；第一濃縮工序，將上述樣品處理容器內(nèi)的上述樣品濃縮；第二濃縮工序，在通過上述第一濃縮工序濃縮后的樣品中，添加能夠使3淀粉樣蛋白溶液化的增溶齊U，通過濃縮操作，降低上述樣品中含有的溶劑的量；中和工序，中和在上述第二濃縮工序中獲得的樣品處理液中的上述增溶劑；和測定工序，基于抗原抗體反應(yīng)，確定經(jīng)過上述中和后的樣品處理液中可能含有的P淀粉樣蛋白的量。(第一實施方式)下面，按照圖11說明本發(fā)明第一實施方式中的各工序的詳細(xì)情況。
在本發(fā)明的AP測定中的樣品準(zhǔn)備工序101中，向樣品處理容器中加入可能含有A3的樣品。在本發(fā)明的AP測定方法中使用的樣品處理容器，為了抑制AP對于容器的內(nèi)壁表面的吸附、提高AP的回收率，優(yōu)選有具有抑制AP吸附的物性的內(nèi)壁表面的容器。具體而言，優(yōu)選內(nèi)壁表面為非疏水性的容器。例如，通?？梢允褂貌Ａе频娜萜鳌；蛘撸部梢允褂美霉璧葘?nèi)壁表面實施了親水處理的容器。通過使用上述容器，能夠降低疏水性高的八0單體與容器內(nèi)壁之間的疏水相互作用，其結(jié)果，能夠抑制AP單體在容器的內(nèi)壁表面上的吸附。因此，能夠提高AP的回收率。此外，通過使用封閉劑，能夠進(jìn)一步抑制AP單體對于容器內(nèi)壁的吸附。封閉劑是包含不與AP單體反應(yīng)或結(jié)合的蛋白質(zhì)或化合物的試劑的統(tǒng)稱。具體而言，可以列舉牛血清白蛋白(BSA)或脫脂牛奶、酪蛋白、表面活性劑等。通過這些物質(zhì)與容器的內(nèi)壁表面發(fā)生相互作用，能夠相對地阻止在樣品中以低濃度存在的八0在內(nèi)壁表面上的吸附。封閉劑通常以0. 01% w/v 5% w/v濃度使用，在粘性等方面存在問題的情況下，使用濃度通常為0. 01 w/v 0. 5 w/v。在使用封閉劑的情況下，在將樣品放入容器時，封閉劑存在于容器中即可。具體而言，含有封閉劑的溶液以不泄漏的狀態(tài)封入容器中，在該容器中投入樣品?；蛘叻忾]劑以能夠再溶解的干燥狀態(tài)保持在容器中，在該容器中投入液體的樣品。作為其他方式，可以預(yù)先使含有封閉劑的溶液與容器的內(nèi)壁表面接觸，從而使封閉劑吸附固定在內(nèi)壁表面。此外，作為另外的方式，可以在容器中添加樣品之后，添加封閉劑或含有封閉劑的溶液。其中，用于溶解封閉劑的溶液通常為緩沖液。例如，磷酸緩沖液或Tris緩沖液等。在使用封閉劑時能夠進(jìn)一步提高AP的回收率，因而優(yōu)選。但是也可以不使用封閉劑。本發(fā)明中使用的樣品處理容器的容量及其形狀沒有特別限定。只要是能夠保持樣品的容量即可，可以任意設(shè)定。例如，作為ImL至2mL的容量的容器,可以使用Eppendorf管；作為50mL以下的容器，可以使用Corning管；作為IOOOmL以下的容器，可以使用燒杯或燒瓶。此外，關(guān)于形狀，可以根據(jù)后續(xù)的處理方法任意選擇。這里所說的處理方法是通常的生化實驗或檢測中使用的方法，為離心分離等方法。其中，上述Eppendorf管或Corning管多數(shù)情況下為與經(jīng)常使用的離心機的轉(zhuǎn)子相匹配的形狀。接著，進(jìn)彳丁濃縮工序102,在該工序中，在樣品處理各器中的樣品中添加能夠使溶液化的增溶劑，對得到的混合物實施濃縮操作，從而降低上述樣品中含有的溶劑的量。在濃縮工序102中，通過利用增溶劑對上述樣品中可能含有的々3低聚物進(jìn)行處理，轉(zhuǎn)化為AP單體。由于基于抗原抗體反應(yīng)的AP測定對于AP單體的靈敏度高，所以通過使用增溶劑的處理，預(yù)先使樣品中的AP轉(zhuǎn)化為AP單體，將其作為測定對象，從而能夠?qū)崿F(xiàn)更準(zhǔn)確的定量測定。此外，通過減少樣品中所含的溶劑量，樣品中的AP濃度增高，能夠?qū)崿F(xiàn)更高靈敏度的測定。作為增溶劑，可以使用甲酸。甲酸通常用于使動物或人的組織中凝集或吸附的蛋白質(zhì)溶液化而從組織中分離。然而，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甲酸作用于分散在不含機體組織的液體中的可溶性AP低聚物時，可溶性々0低聚物被分解，成為AP單體。甲酸添加到樣品中時，優(yōu)選使用甲酸濃度在70%以上的甲酸?？扇苄訟P低聚物變?yōu)锳U單體的機理尚不清楚，推測可能是因為在液體中部分可溶性低聚物極小一部分以可逆的方式偏離為單體，其中，甲酸有助于AP單體的穩(wěn)定化。 在本發(fā)明中，增溶劑不限于甲酸。作為增溶劑，可以使用有能力使可溶性AP低聚物轉(zhuǎn)化為A P單體的有機酸。作為這種有機酸，可以列舉具有羧基或磺基的有機酸。具體而言，除了甲酸之外，還可以列舉乙酸、草酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、三氟乙酸、苯二甲酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、甲磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸等。增溶劑可以只使用一種，也可以并用兩種以上。濃縮工序102中使用的增溶劑，優(yōu)選含有甲酸，并且含有具有雙鍵、三鍵或共軛鍵的化合物(例如，S-烯丙基-I-半胱氨酸(以后，簡稱為SAC))。由此，能夠進(jìn)一步提高A 3的回收率。作為濃縮工序102中進(jìn)行濃縮的方法，可以使用減壓濃縮法。在本發(fā)明的AP測定方法中的濃縮工序102中，優(yōu)選不使AP不溶化而對樣品進(jìn)行濃縮。樣品中含有AP單體或可溶性低聚物。隨著濃縮，上述A3單體或可溶性低聚物發(fā)生凝集，形成不溶性A3聚合物，從而析出由AP構(gòu)成的固相，將這種現(xiàn)象稱為AP的不溶化。在本發(fā)明中，不使A3不溶化而對樣品進(jìn)行濃縮，是為了避免通過不使樣品干燥固化而進(jìn)行濃縮，或者不中和作為增溶劑添加的甲酸而進(jìn)行濃縮，從而造成樣品中不溶性AP聚合物的量(即，由AP構(gòu)成的固相的量)隨著濃縮實質(zhì)上增加。進(jìn)行濃縮工序102的目的在于提高樣品中的AP濃度，但由于是以不使不溶性AP聚合物增加的方式進(jìn)行濃縮，所以通過添加增溶劑而得到的A3單體以原狀態(tài)保持，能夠準(zhǔn)確地進(jìn)行A 3的定量測定。為了如上述那樣不使樣品干燥固化而進(jìn)行濃縮，只要調(diào)節(jié)濃縮工序中的溶劑的減少量即可。由于溶劑的減少量過多時樣品會干燥固化，所以需要抑制減少量。這里，樣品干燥固化是指樣品中所含的溶劑量相對減少，樣品整體的流動性喪失而發(fā)生固化。因此，為了不使樣品干燥固化而進(jìn)行濃縮，可以在液態(tài)的樣品維持其流動性的狀態(tài)下結(jié)束濃縮工序。一旦樣品在濃縮工序中干燥固化，A3單體或可溶性低聚物就會凝集，如后述的實施例3所示，AP的測定靈敏度降低。因此，在第一實施方式的濃縮工序中，優(yōu)選以樣品不發(fā)生干燥固化的程度降低樣品中所含的溶劑的量，由此，能夠顯著提高々0的測定靈敏度。接著，進(jìn)行中和工序103，在該工序中，在通過濃縮工序102得到的樣品處理液中添加中和劑，以中和樣品處理液中所含的增溶劑。在濃縮工序102中使用甲酸等有機酸作為增溶劑時，由于樣品處理液的酸性強，為了進(jìn)行后續(xù)的測定工序104，就需要進(jìn)行中和。
作為中和劑，例如可以添加規(guī)定量的IM的Tris來中和甲酸。接著，進(jìn)行測定工序104，在該工序中，基于抗原抗體反應(yīng)，確定經(jīng)過中和工序103中和后的樣品處理液中的AP的量。在本發(fā)明的AP測定方法中的測定工序103中，利用基于抗原抗體反應(yīng)的免疫測定法。鼻清洗液等樣品中，除了含有作為測定對象的AP之外，還含有許多蛋白質(zhì)和雜質(zhì)。為了從該樣品中僅測定作為測定對象的AP，優(yōu)選使用與A3發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)。因此，利用免疫測定法。所謂免疫測定法是指利用作為免疫反應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)的測定法，由于能夠人為制作需要測定的物質(zhì)的抗體，所以作為測定原理而廣泛應(yīng)用。實際上，和光純藥公司出售有AP測定試劑盒。然而，僅使用這種市售的A3測定試劑盒時，在樣品所含的AP的濃度低的情況下，無法準(zhǔn)確地進(jìn)行AP的定量。根據(jù)本發(fā)明，通過進(jìn)行上述增溶劑存在下的濃縮工序，即使是以極低濃度含有A3的樣品，也能夠準(zhǔn)確地進(jìn)行AP的定量。由于測定工序104的目的在于定量測定，所以優(yōu)選在濃縮工序102中將其濃縮量(濃縮后的液體量)控制為一定量。例如可以在樣品處理液中添加二甲基亞砜(DMSO)等不與水系介質(zhì)共沸的、沸點高的介質(zhì)，從而容易地實施濃縮量的控制。在這種情況下，將該高 沸點介質(zhì)的添加量調(diào)節(jié)為一定量時，通過利用水分蒸發(fā)的濃縮，只有水系介質(zhì)蒸發(fā)，DMSO等高沸點介質(zhì)保留，因而能夠穩(wěn)定地得到一定的濃縮量?；蛘咭部梢岳霉鉁y量控制濃縮量。S卩，向容器的規(guī)定位置照射光，在檢測出濃縮過程中樣品處理液的彎月面(Meniscus)移動至規(guī)定位置時的光散射信號的時刻，停止?jié)饪s?；蛘哌€可以通過以電化學(xué)方式檢測剩余量來控制濃縮量。即，在容器的規(guī)定位置設(shè)置電極對，在濃縮過程中樣品液的彎月面超過位于規(guī)定位置的電極對而導(dǎo)致電流不再流通的時刻，停止?jié)饪s。另外，還可以通過設(shè)置測量揮發(fā)的溶液體積來計算剩余量的單元，控制濃縮量?；蛘?，也可以通過設(shè)置利用濃縮液的重量而達(dá)到一定量的濃縮量的單元，來進(jìn)行控制。例如，在容器上安裝壓電元件，利用該壓電元件來測定質(zhì)量變化量。以上說明的包括101 104的所有工序的第一實施方式的測定方法，特別是能夠有效地用于使用如下樣品的情況，該樣品利用棉棒或藥簽等采集工具從鼻粘膜采集鼻粘液而獲得。這是因為在鼻粘液作為樣品時，樣品的體積小，所以能夠直接在樣品中添加增溶劑進(jìn)行濃縮。(第二實施方式)下面，按照圖12說明本發(fā)明第二實施方式中的各工序的詳細(xì)情況。在本發(fā)明的AP測定中的樣品處理容器準(zhǔn)備工序111中，在樣品處理容器中加入用于使AP附著的添加劑。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使上述添加劑與AP單體和可溶性A3低聚物作用時，A0單體和可溶性低聚物彼此之間的凝集受到抑制。添加劑例如為甲酸。由于使用的甲酸不需要具有使可溶性AP低聚物轉(zhuǎn)化為AP單體的能力，所以甲酸的濃度可以低于70%。在本發(fā)明中，添加劑不限于甲酸。作為添加劑，可以使用有能力抑制々0單體和可溶性低聚物彼此之間的凝集的有機酸。作為這種有機酸，可以列舉具有羧基或磺基的有機酸。具體而言，除了甲酸之外，還可以列舉乙酸、草酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、三氟乙酸、苯二甲酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、甲磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸等。添加劑可以只使用一種，也可以并用兩種以上。樣品處理容器準(zhǔn)備工序111中使用的添加劑，優(yōu)選含有甲酸，并且含有具有雙鍵、三鍵或共軛鍵的化合物(例如，S-烯丙基-I-半胱氨酸(以后，簡稱為SAC))。由此，能夠進(jìn)一步提高AP的回收率。由于樣品處理容器準(zhǔn)備工序111將添加劑加入樣品處理容器中，由此能夠提高 的回收率，所以能夠更準(zhǔn)確地進(jìn)行AP的定量測定。但是，在本發(fā)明中并不是必須預(yù)先
將添加劑加入樣品處理容器中，也可以使用未加入添加劑的樣品處理容器實施樣品準(zhǔn)備工序112，之后再添加添加劑。在本發(fā)明的AP測定方法中使用的樣品處理容器，為了抑制AP對于容器的內(nèi)壁表面的吸附、提高AP的回收率，優(yōu)選內(nèi)壁表面具有抑制AP吸附的特性。具體而言，優(yōu)選內(nèi)壁表面為非疏水性的容器。例如，通?？梢允褂貌Ａе频娜萜??；蛘?，也可以使用利用硅 等對內(nèi)壁表面實施了親水處理的容器。通過使用上述容器，能夠降低疏水性高的A3單體與容器內(nèi)壁之間的疏水相互作用，其結(jié)果，能夠抑制AP單體在容器的內(nèi)壁表面上的吸附。因此，能夠提高AP的回收率。此外，通過使用封閉劑，能夠進(jìn)一步抑制AP單體對于容器內(nèi)壁的吸附。封閉劑是包含不與AP單體反應(yīng)或結(jié)合的蛋白質(zhì)或化合物的試劑的統(tǒng)稱。具體而言，可以列舉牛血清白蛋白(BSA)或脫脂牛奶、酪蛋白、表面活性劑等。通過這些物質(zhì)與容器的內(nèi)壁表面發(fā)生相互作用，能夠相對地阻止在樣品中以低濃度存在的八0在內(nèi)壁表面上的吸附。使用封閉劑的濃度通常為0. 01% w/v 5% w/v。在粘性等方面存在問題的情況下，使用濃度為0. 01 w/v 0. 5 w/v。在使用封閉劑的情況下，在將樣品放入容器內(nèi)時，封閉劑存在于容器中即可。具體而言，含有封閉劑的溶液以不泄漏的狀態(tài)封入容器中，在該容器中投入樣品。或者封閉劑以能夠再溶解的干燥狀態(tài)保持在容器中，在該容器中投入液態(tài)的樣品。作為另一種方式，可以預(yù)先使含有封閉劑的溶液與容器的內(nèi)壁表面接觸，從而使封閉劑固定吸附在內(nèi)壁表面。此夕卜，作為又一種方式，可以在容器中添加樣品之后，添加封閉劑或含有封閉劑的溶液。其中，用于溶解封閉劑的溶液通常為緩沖液。例如，磷酸緩沖液或Tris緩沖液等。在使用封閉劑時能夠進(jìn)一步提高AP的回收率，因而優(yōu)選。但是也可以不使用。本發(fā)明中使用的樣品處理容器的容量及其形狀沒有特別限定。只要是能夠保持樣品的容量即可，可以任意設(shè)定。例如，作為ImL至2mL容量的容器,可以使用Eppendorf管；作為50mL以下的容器，可以使用Corning管；作為IOOOmL以下的容器，可以使用燒杯或燒瓶。此外，關(guān)于形狀，可以根據(jù)后續(xù)的處理方法任意選擇。這里所說的處理方法是通常的生化實驗或檢測中使用的方法，為離心分離等方法。其中，上述Eppendorf管或Corning管多數(shù)情況下為與經(jīng)常使用的離心機的轉(zhuǎn)子相匹配的形狀。接著，進(jìn)行在準(zhǔn)備好的樣品處理容器中加入樣品的樣品準(zhǔn)備工序112。下面，進(jìn)行對樣品處理容器中的樣品進(jìn)行濃縮的第一濃縮工序113。在第一濃縮工序113中，通過使樣品中々0的濃度升高，能夠容易地進(jìn)行后面的AP測定，并且，能夠高效地實施接下來的溶液化。在進(jìn)行第一濃縮工序113時，優(yōu)選進(jìn)行在樣品處理容器中預(yù)先加入用于使々0溶液化的添加劑的樣品處理容器準(zhǔn)備工序111。由此，能夠防止在第一濃縮工序113中發(fā)生AP的不溶化。在該第一濃縮工序113中，如后述的參考例所示，不使試樣干燥固化而進(jìn)行濃縮。接著，進(jìn)行第二濃縮工序114，在該工序中，在通過第一濃縮工序濃縮后的樣品處理容器中的樣品中添加能夠使A3溶液化的增溶劑，對得到的混合物實施第二次濃縮操作，從而降低上述樣品中含有的溶劑的量。在第二濃縮工序114中，利用增溶劑對上述樣品中可能含有的AP低聚物進(jìn)行處理，從而轉(zhuǎn)化為AP單體。由于基于抗體抗原反應(yīng)的A3測定對于々0單體的靈敏度高，所以通過使用增溶劑的處理，使樣品中的AP轉(zhuǎn)化為A3單體，從而能夠?qū)崿F(xiàn)更準(zhǔn)確的定量測定。此外，通過減少樣品中所含的溶劑量，樣品中的A3濃度增高，就能夠?qū)崿F(xiàn)更高靈敏度的測定。作為增溶劑，可以使用甲酸。甲酸通常用于使動物或人的組織中凝集或吸附的蛋白質(zhì)溶液化而從組織中分離。然而，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甲酸作用于分散在不含機體組織的液體中的可溶性AP低聚物時，可溶性AP低聚物被分解，成為AP單體。甲酸添加到 樣品中時，優(yōu)選使用甲酸濃度在70%以上的甲酸。可溶性AP單體低聚物變?yōu)锳P單體的機理尚不清楚，推測可能是因為在液體中部分可溶性低聚物極小一部分以可逆的方式偏離為A&單體，其中，甲酸有助于AP單體的穩(wěn)定化。在本發(fā)明中，增溶劑不限于甲酸。作為增溶劑，可以使用有能力使可溶性AP低聚物轉(zhuǎn)化為A P單體的有機酸。作為這種有機酸，可以列舉具有羧基或磺基的有機酸。具體而言，除了甲酸之外，還可以列舉乙酸、草酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、三氟乙酸、苯二甲酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、甲磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸等。增溶劑可以只使用一種，也可以并 用兩種以上。 第二濃縮工序114中使用的增溶劑，優(yōu)選含有甲酸，并且含有具有雙鍵、三鍵或共軛鍵的化合物(例如，S-烯丙基-I-半胱氨酸(以后，簡稱為SAC))。由此，能夠進(jìn)一步提高
的回收率。作為第二濃縮工序114中進(jìn)行濃縮的方法，可以使用減壓濃縮法。在本發(fā)明的A 3測定方法中的第二濃縮工序114中，優(yōu)選不使AP不溶化而對樣品進(jìn)行濃縮。樣品中含有
單體或可溶性低聚物。隨著濃縮，上述A3單體或可溶性低聚物發(fā)生凝集，形成不溶性聚合物，從而析出由AP構(gòu)成的固相，將這種現(xiàn)象稱為AP的不溶化。在本發(fā)明中，不使不溶化而對樣品進(jìn)行濃縮，是為了避免通過不使樣品干燥固化而進(jìn)行濃縮，或者不中和作為增溶劑添加的甲酸而進(jìn)行濃縮，從而導(dǎo)致樣品中不溶性AP聚合物的量(即，由A3構(gòu)成的固相的量)隨著濃縮而實質(zhì)上增加。進(jìn)行第二濃縮工序114的目的在于提高樣品中的濃度，但由于是以不使不溶性A3聚合物增加的方式進(jìn)行濃縮，所以通過添加增溶劑而得到的AP單體以原狀態(tài)保持，能夠準(zhǔn)確地進(jìn)行AP的定量測定。由于第二濃縮工序114后續(xù)的測定工序116的目的在于定量測定，所以優(yōu)選在第二濃縮工序114中將其濃縮量(濃縮后的液體量)控制至一定量。例如可以在樣品處理液中添加二甲基亞砜(DMSO)等不與水系介質(zhì)共沸的、沸點高的介質(zhì)，從而容易地實施濃縮量的控制。在這種情況下，將該高沸點介質(zhì)的添加量調(diào)節(jié)為一定量時，通過利用水分蒸發(fā)的濃縮，只有水系介質(zhì)蒸發(fā)，DMSO等高沸點介質(zhì)保留，因而能夠穩(wěn)定地得到一定的濃縮量。另外也可以利用光測量控制濃縮量。S卩，向容器的規(guī)定位置照射光，在檢測出濃縮過程中樣品處理液的彎月面移動至規(guī)定位置時的光散射信號的時刻，停止?jié)饪s。
或者還可以通過以電化學(xué)方式檢測剩余量來控制濃縮量。即，在容器的規(guī)定位置設(shè)置電極對，在濃縮過程中樣品液的彎月面超過位于規(guī)定位置的電極對而導(dǎo)致電流不再流通的時刻，停止?jié)饪s。另外，還可以通過設(shè)置計量揮發(fā)的溶液的體積來計算剩余量的單元，控制濃縮量?；蛘?，也可以通過設(shè)置利用濃縮液的重量而達(dá)到一定量的濃縮量的單元，來進(jìn)行控制。例如，在容器上安裝壓電元件，利用該壓電元件來測定質(zhì)量變化量。在本發(fā)明的AP測定方法中的濃縮工序中，在樣品是鼻清洗液這種含有鹽的溶液的情況下，通過進(jìn)行濃縮而樣品中的鹽濃度增高，接著例如在利用酶免疫測定法進(jìn)行測定時，有時會帶來不利影響。在這種情況下，可以使用柱或超濾等進(jìn)行樣品的脫鹽操作，也可以預(yù)先減少樣品的液量再實施本發(fā)明。接著，進(jìn)行中和工序115，在該工序中，在第二濃縮工序114中得到的樣品處理液中添加中和劑，中和樣品處理液中所含的增溶劑。在第二濃縮工序114中使用甲酸等有機酸作為增溶劑時，由于樣品處理液的酸性強，所以為了進(jìn)行后續(xù)的測定工序116，需要進(jìn)行中和。作為中和劑，例如可以添加規(guī)定量的IM的Tris來中和甲酸。接著，進(jìn)行測定工序116，在該工序中，基于抗原抗體反應(yīng)，確定經(jīng)過中和工序115中和后的樣品處理液中的AP的量。在本發(fā)明的AP測定方法中的測定工序116中，利用基于抗原抗體反應(yīng)的免疫測定法。鼻清洗液等樣品中，除了含有作為測定對象的AP之外，還含有許多蛋白質(zhì)和雜質(zhì)。為了從該樣品中僅測定作為測定對象的AP，優(yōu)選使用與A3發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)。因此，利用免疫測定法。所謂免疫測定法是指利用作為免疫反應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)的測定法，由于能夠人為制作需要測定的物質(zhì)的抗體，所以作為測定原理而廣泛應(yīng)用。實際上，和光純藥公司出售有AP測定試劑盒。然而，僅使用這種市售的A3測定試劑盒時，在樣品所含的AP的濃度低的情況下，無法準(zhǔn)確地進(jìn)行AP的定量。根據(jù)本發(fā)明，通過進(jìn)行上述增溶劑存在下的濃縮工序，即使是以極低濃度含有A3的樣品，也能夠準(zhǔn)確地進(jìn)行AP的定量。以上說明的包括111 116的所有工序的第二實施方式的測定方法，特別是能夠 有效地用于鼻清洗液等樣品體積大、且含有極低濃度的A3的情況。這是因為在鼻清洗液作為樣品時，樣品的體積大，直接在樣品中添加增溶劑時，液量達(dá)到大量。因此，優(yōu)選在實施第一濃縮工序而降低樣品的液量之后，再添加增溶劑。本發(fā)明中作為用于測定作為對象的AP的免疫測定法，例如有酶免疫測定法、熒光免疫測定法、化學(xué)發(fā)光免疫測定法、電化學(xué)發(fā)光免疫測定法。根據(jù)這些方法，將標(biāo)記有酶、熒光性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)性物質(zhì)或電化學(xué)發(fā)光性物質(zhì)的與測定對象物特異性結(jié)合的抗體、與作為測定對象物的抗原反應(yīng)并結(jié)合，分離并除去未結(jié)合的上述標(biāo)記抗體。之后，檢測從與上述抗原結(jié)合的上述標(biāo)記抗體上標(biāo)記的酶、熒光性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)性物質(zhì)或電化學(xué)發(fā)光性物質(zhì)發(fā)出的光學(xué)信號或電化學(xué)信號。這些免疫測定技術(shù)，需要將作為測定對象物的抗原和與測定對象物特異性結(jié)合的抗體的抗原結(jié)合體從未結(jié)合的標(biāo)記抗體中分離的工藝。因此，統(tǒng)稱為BF分離方式免疫測定(Bind-Free分離方式的縮寫)。具體而言，上述和光純藥公司生產(chǎn)的測定試劑盒，以酶免疫測定法為基本原理。該測定試劑盒的構(gòu)成包括固定有AP單體(AP 40、AP 42)的第一抗體的微量滴定板、HRP標(biāo)記的第抗體和酶顯色底物。作為性能，AP 40/42 ELISA測定試劑盒，對于A ￠40，能夠檢測IpM至IOOpM ;對于A ￠42，能夠檢測0. IpM至20pM。測定時間為17小時。靈敏度非常高。關(guān)于測定方法，首選，在微量滴定板中分別注入樣品液，在利用緩沖液對微量滴定板進(jìn)行清洗之后，加入第二抗體。然后，進(jìn)一步利用緩沖液對微量滴定板進(jìn)行清洗后，添加顯色底物，使其顯色，測定吸光度。本發(fā)明中作為用于測定作為對象的AP的免疫測定法，也可以利用非BF分離方式的免疫測定法。例如，免疫比池法、免疫散射比池法(nephelometric immunoassay)和乳膠免疫比濁法為非BF分離方式的免疫測定。這種方法以光學(xué)方式測定抗原抗體凝集體，該凝集體通過作為測定對象物的抗原和與測定對象物特異性結(jié)合的抗體之間的結(jié)合反應(yīng)而生成。在這些方法中，以光學(xué)變化檢測出伴隨抗原抗體結(jié)合反應(yīng)而發(fā)生的大小的變化。免疫比濁法和膠乳免疫比濁法，以透射光強度的變化量檢測出抗原抗體反應(yīng)所產(chǎn)生的濁度，從而對測定對象物進(jìn)行定量。此外，免疫散射比濁法，以散射光強度的變化量檢測出抗原抗體 反應(yīng)所產(chǎn)生的凝集體的大小的變化，從而對測定對象物進(jìn)行定量。本發(fā)明中用于測定作為對象的AP的免疫測定法中使用的抗體，是與AP發(fā)生特異性反應(yīng)并結(jié)合的抗體?？贵w的制作方法已經(jīng)確立了多種方法，已經(jīng)是公知技術(shù)。作為代表性的方法，將測定對象物作為抗原對小鼠進(jìn)行免疫，之后取出小鼠的脾臟，通過小鼠的脾臟與作為癌細(xì)胞的骨髓瘤的融合，從而制作雜交瘤(抗體產(chǎn)生細(xì)胞)。其中最重要的是抗原。本發(fā)明中，將A3作為抗原。具體而言是AP 42和AP 40。此外，與抗原結(jié)合的抗體識別并結(jié)合AP的哪些區(qū)域至關(guān)重要。例如，為了利用抗體區(qū)分AM2和AP 40，需要識別AM2和AP 40中不同區(qū)域的氨基酸序列。S卩，由于AP 42和AP 40中C末端側(cè)的氨基酸序列不同，所以能夠識別含有氨基酸序列的C末端側(cè)的2個氨基酸的序列的抗體是對AP 42特異的抗體，否則是對A P 40特異的抗體。此外，N末端側(cè)A P 42和A P 40的氨基酸序列都相同，所以是與AP 42和AP 40都結(jié)合的抗體。上述和光純藥公司的測定試劑盒中使用抗體是這些抗體的適當(dāng)組合。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的々0測定方法，利用腦內(nèi)的AP隨著年齡的增長在鼻粘膜及其周邊組織蓄積的現(xiàn)象，對利用藥簽和棉棒擦拭鼻粘膜等而得到的鼻粘液或者鼻粘膜等進(jìn)行清洗，將清洗液作為樣品。在這種情況下，本發(fā)明具有下述優(yōu)點能夠不取出鼻骨，即，能夠以有助于臨床研究和診斷的方式，測定包括鼻骨和鼻粘膜的鼻腔內(nèi)的々0的量。此外，通過不使々3凝集而濃縮樣品，能夠以高靈敏度測定々3，所以具有能夠測定通常的濃縮方法所不能測定的從鼻等采集的樣品中的AP的量。實施例下面，列舉實施例進(jìn)一步對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但本發(fā)明不限于這些實施例。(實施例I)由棉棒采集的鼻粘液的測定利用圖I對本實施例進(jìn)行說明。(樣品準(zhǔn)備工序的實施)使用榮研化學(xué)公司生產(chǎn)并銷售的棉棒(11) ( Y殺菌鋁軸棉棒)，運用流感簡易試劑盒的方法，從被檢測者a e五個健康的被檢測者米集鼻粘液。將米集有鼻粘液的棉棒
(11)放入試管(12)中，將米集的鼻粘液作為樣品(13)。(濃縮工序的實施)
然后，在裝入采集有樣品(13)的棉棒(11)的試管(12)中加入80%甲酸(14)500iiL，并且加入IOuM SAC (15)50 y L，提取出附著于棉棒的樣品(13)，并進(jìn)行溶液化，得到試樣(16)。并且，在將棉棒(11)的采集部從試管(12)內(nèi)的溶液中取出的狀態(tài)下，將棉棒
(11)固定于試管(12)，將試管(12)放入離心機，以轉(zhuǎn)速2000rpm離心I分鐘，使棉棒(11)脫水(17)，然后，從試管(12)取出棉棒(11)，得到樣品(18)。然后，通過減壓濃縮(19)對試樣(18)進(jìn)行濃縮，得到體積為40 y L的樣品(20)。(中和工序的實施)然后，在試樣(20)中加入IM Tris緩沖溶液(未調(diào)節(jié)pH) (21) 960 y L，中和甲酸，得到體積為ImL的測定用試樣(22)。(測定工序的實施)使用用于測定P淀粉樣蛋白的ELISA的測定試劑盒進(jìn)行測定(和光純藥公司生產(chǎn)，Human/Rat ^ Amyloid42 ELISA Kit wako, High-Sensitive,商品編號 292-64501 和Human/Rat 3 Amyloid40 ELISA Kit wako II，商品編號 294-64701)。在進(jìn)行測定之前,使用AP 42和AP 40的標(biāo)準(zhǔn)溶液或?qū)嵤├?中制備的原液，將AP 42制備為0. 05、0. I、0. 2、
0.25、1、2、2. 5、5、10 或 20pM，將 A3 40 制備為 0. 25,0. 5、I、I. 25,2. 5、5、10、12. 5、25、50 或IOOpM,來制備用于制作校正曲線的溶液。制備后，在上述測定試劑盒的微量滴定板中分別添加用于制作校正曲線的溶液和各測定用試樣IOOy L。然后，按照測定試劑盒的使用說明，實施測定。測定后，使用校正曲線，算出各測定用試樣中所含的A￠42和AP 40的濃度。(測定結(jié)果)圖2表示上述測定結(jié)果。根據(jù)該測定結(jié)果，在利用本實施例的方法處理過的鼻粘液樣品中，AP 40顯示0. 75 3. 26pM的值，AP 42顯示0. 12 0. 27pM的值。如上所述，通過在鼻粘液樣品中添加甲酸進(jìn)行減壓濃縮，成功地測定出了通常無法測定的鼻粘液中所含的A3量。(實施例2)小鼠腦勻漿的測定利用圖3對本實施例進(jìn)行說明。(樣品準(zhǔn)備工序的實施)將以A3大量表達(dá)的方式改變了基因的小鼠(以下稱為APP小鼠)的腦切片在IOmM磷酸緩沖液(PB)中勻漿化，得到腦勻漿溶液的上清液，使用該上清液。在本實施例中，將其作為樣品(31)，在試管(32)中加入IOy L該樣品。(濃縮工序的實施)然后，在添加于試管(32)的樣品(31)中加入80%甲酸(33) 500 iiL，并且加入IOuM SAC (34)50 iiL，進(jìn)行溶液化，得到體積為560 ii L的試樣(35)。然后，通過減壓濃縮
(36)對試樣(35)進(jìn)行濃縮，得到體積為40 y L的樣品(37)。(中和工序的實施)然后，在試樣(37)中加入IM Tris緩沖液(未調(diào)節(jié)pH) (38) 960 y L，中和甲酸，得到體積為ImL的測定用試樣(39)。(未處理樣品的制備)在IOii L的試管中加入在樣品準(zhǔn)備工序中制備的腦樣品，再添加IOmM磷酸緩沖液(PB) 990 iiL，稀釋100倍。這與到中和工序為止實施的腦樣品同等的稀釋倍率。將其作為用于與本實施例的處理樣品進(jìn)行比較的未處理樣品。(測定工序的實施)使用用于測定0淀粉樣蛋白的ELISA的測定試劑盒進(jìn)行測定(和光純藥公司生產(chǎn)，Human/Rat ^ Amyloid42 ELISA Kit wako, High-Sensitive,商品編號 292-64501 和Human/Rat 3 Amyloid40 ELISA Kit wako II，商品編號 294-64701)。在進(jìn)行測定之前,使用A P 42和A P 40的標(biāo)準(zhǔn)溶液或?qū)嵤├?中制備的原液，將A @ 42制備為0. 1、0. 2、0. 25、I、2,2. 5、5、10 或 20pM，將 A3 40 制備為 1、1. 25,2. 5、5、10、12. 5、25、50 或 100pM，來制備用于制作校正曲線的溶液。制備后，在上述測定試劑盒的微量滴定板中分別加入用于制作校正曲線的溶液和各測定用試樣100 u L0然后，按照測定試劑盒的使用說明，實施測定。測定后，使用校正曲線，算出各測定用試樣中所含的A￠42和AP 40的濃度。(測定結(jié)果)
·
圖4表示上述測定結(jié)果。根據(jù)該測定結(jié)果，在利用本實施例的方法處理過的腦樣品中，A P 40和A P 42均顯示高于未處理樣品的值。其中，A P 42約為18倍，可知腦樣品中含有大量的凝集A3 42。由此可知，通過在樣品中添加甲酸進(jìn)行減壓濃縮，能夠使通常無法測定的樣品中所含的凝集AP轉(zhuǎn)化為AP單體進(jìn)行測定，能夠以非常高的靈敏度測定A3。(實施例3)溶液化工序后的濃縮工序的有無利用圖5對本實施例進(jìn)行說明。其中，在實施例3中，作為假定鼻清洗液的模型，制備將々0在磷酸緩沖液中稀釋的溶液，將其作為樣品。該樣品中AP的濃度，AMO為50pM，A M2為10pM?；趯PP小鼠進(jìn)行鼻清洗、并對得到的清洗液進(jìn)行測定得到的AP濃度，以按照體重比反映為人時得到的預(yù)測的濃度設(shè)定以上濃度。(樣品準(zhǔn)備工序的實施)使用市售的固體A P 42 (PEPTIDE INSTITUTE, INC.生產(chǎn)，商品編號4349-V)、市售的固體A ￠40 (PEPTIDE INSTITUTE, INC.生產(chǎn)，商品編號4307-V)和二甲基亞砜(DMS0)，制備A M2的DMSO溶液(濃度20 u M)和A MO的DMSO溶液(濃度100 u M)。將這些溶液等量混合，得到A P 42與A P 40的混合液。(濃縮工序的實施)接著，通過使用70%甲酸稀釋該混合液進(jìn)行溶液化，對于AP 42最終濃度設(shè)為70%甲酸溶液的10 11，對于六0 40最終濃度設(shè)為70%甲酸溶液的50 11。將其作為樣品
(41)。在試管(42)中加入樣品(41) lmL，通過減壓濃縮(43)進(jìn)行樣品(41)的濃縮，制作完全干燥固化的試樣(44)和未完全干燥固化殘留有50 UL液體的試樣(45)。然后，在完全干燥固化的試樣(44)中加入40 ii L甲酸(46)，得到試樣(47)。(中和工序的實施)然后，在該試樣(47)中加入IM Tris緩沖液(48)960 iiL，進(jìn)行中和，得到IOOOuL的測定用試樣(49)。在未完全干燥固化的試樣(45)中直接加入IM Tris緩沖液(50)950 iiL，進(jìn)行中和，得到IOOOiiL的測定用試樣(51)。(測定工序的實施)
使用用于測定P淀粉樣蛋白的ELISA的測定試劑盒進(jìn)行測定(和光純藥公司生產(chǎn)，Human/Rat ^ Amyloid42 ELISA Kit wako, High-Sensitive,商品編號 292-64501 和Human/Rat 3 Amyloid40 ELISA Kit wako II，商品編號 294-64701)。在進(jìn)行測定之前,使用AP 42和AP 40的標(biāo)準(zhǔn)溶液或?qū)嵤├?中制備的原液，將A3 42制備為0. 3125,0. 625、
I.25,2. 5、5、10 或20pM，將 AP 40 制備為 I. 5625,3. 125,6. 25,12. 5、25、50 或 IOOpM,來制備用于制作校正曲線的溶液。制備后，在上述測定試劑盒的微量滴定板中分別加入用于制作校正曲線的溶液和各測定用試樣ImL。然后，按照測定試劑盒的使用說明，實施測定。測定后，使用校正曲線，算出各測定用試樣中所含的A P 42和A P 40的濃度。進(jìn)行體積校正后，評價對于各試樣中所含的A 3 42量和A ￠40量的回收率。 (測定結(jié)果)圖6表示上述測定結(jié)果。根據(jù)該測定結(jié)果，AP 42和AP 40的回收率，在通過添加增溶劑后的濃縮工序沒有使其干燥固化的試樣中，分別為80%和100%，是非常高的值。而在通過添加增溶劑后的濃縮工序使其干燥固化的試樣中，回收率低于10%和低于20%，僅為極低的值。由此可知，通過在利用添加增溶劑的濃縮工序不使試樣干燥固化，AP的回收率、即測定靈敏度顯著提高。(實施例4)樣品處理容器準(zhǔn)備工序中的添加劑的研究利用圖7對本實施例進(jìn)行說明。(樣品(61)的制備)在制備AP 42、AP 40等AP單體的磷酸緩沖液時，會發(fā)生由于AP單體的凝集性和吸附性所帶來的損失。因此，基于分段稀釋謹(jǐn)慎地進(jìn)行制備。具體而言，使用市售的固體 AP 42 (PEPTIDE INSTITUTE, INC.生產(chǎn)，商品編號 4349-V)、市售的固體 A3 40 (PEPTIDEINSTITUTE, INC.生產(chǎn)，商品編號4307-V)和二甲基亞砜(DMSO)，制備A M2的DMSO溶液(濃度20 ii M)和A P 40的DMSO溶液(濃度100 u M)。將這些溶液等量混合，得到A P 42與A 3 40的混合液。然后，使用0. 5%牛血清白蛋白(BSA)和0. 1%的Tween 20的磷酸生理鹽水緩沖液(PH7. 4、PBS)，將上述混合液稀釋至A P 42的濃度達(dá)到5nM、A ^ 40的濃度達(dá)到25nM。在該稀釋后的混合液中，能夠使A 0 42和A 0 40均以A 0單體穩(wěn)定存在，所以將其作為本實施例中的原液。之后，利用磷酸緩沖液(PB)，對上述原液進(jìn)行分段稀釋，調(diào)節(jié)至目的濃度。在本實施例中，對于A P 42將最終濃度設(shè)為磷酸緩沖溶液中5pM，對于A P 40將最終濃度設(shè)為磷酸緩沖液中25pM。此外，在上述分段稀釋的過程中進(jìn)行調(diào)節(jié)，使得作為封閉劑含有最終濃度為0. 9%的牛血清白蛋白(BSA)。之后，通過將制備的溶液放置24小時以上，得到可溶性A3低聚物、不溶性AP聚合物和AP單體的混合物溶液，將其作為樣品(61)。如上所述制備的樣品為5pM A^ 42-25pM A^ 40-0. 9% BSA的磷酸緩沖溶液(包含微量的DMSO )。(樣品處理容器準(zhǔn)備工序的實施)準(zhǔn)備13支試管(62)，在各試管中加入添加劑(63)250 L。作為添加劑，準(zhǔn)備下列
(A)至(M)所示的13種添加劑(63)，每支試管添加一種添加劑。(A) 0. 9%BSA-80% 甲酸
(B) IOnM 酸性黃 _0. 9%BSA_80% 甲酸(C) 9%TritonX100-0. 9%BSA_80% 甲酸(D) IOuM SAC-0. 9%BSA_80% 甲酸(E) 20%DMS0-0. 9%BSA_80% 甲酸(F) 0. 9%BSA-0. l%Tween20_PBS(G) IOnM 酸性黃 _0. 9%BSA_0. l%Tween20_PBS(H) 9%TritonX100-0. 9%BSA-0. l%Tween20-PBS (I)10u MSAC-0. 9%BSA-0. l%Tween20-PBS(J) 50%DMS0-0. 9%BSA-0. l%Tween20-PBS (K) PB(L) 28%NH3(M) 5. 6%NH3-0. 9%BSA_0. l%Tween20_PBS(樣品準(zhǔn)備工序的實施)接著，在各試管中加入樣品(61) 2mL，得到2250 ii L的試樣(64)。(第一濃縮工序的實施)利用減壓濃縮對試樣(64)實施濃縮(65),得到將體積濃縮至50li L的試樣(66)。(第二濃縮工序)通過在試樣(66)中添加300 ii L 80%甲酸(67)進(jìn)行溶液化，得到體積為350 y L的試樣(68 )。然后，通過減壓濃縮(69 )對試樣(67 )進(jìn)行濃縮，得到體積為40 y L的試樣(70 )。(中和工序的實施)然后，在試樣(70)中加入IM Tris緩沖液(未調(diào)節(jié)pH) (71) 960 ii L，進(jìn)行甲酸的中和，得到體積為ImL的測定用試樣(72)。(測定工序的實施)使用用于測定0淀粉樣蛋白的ELISA的測定試劑盒進(jìn)行測定(和光純藥公司生產(chǎn)，Human/Rat ^ Amyloid42 ELISA Kit wako, High-Sensitive,商品編號 292-64501 和Human/Rat P Amyloid40 ELISA Kit wako II,商品編號 294-64701)。在進(jìn)行測定之前，使用A P 42和A P 40的標(biāo)準(zhǔn)溶液或上述制備的原液，將A P 42制備為0. 3125,0. 625、I. 25、2. 5、5、10 或 20pM，將 A3 40 制備為 I. 5625,3. 125,6. 25,12. 5、25、50 或 100pM，來制備用于制作校正曲線的溶液。制備后，在上述測定試劑盒的微量滴定板中分別加入用于制作校正曲線的溶液和各測定用試樣(72 )。然后，按照測定試劑盒的使用說明，實施測定。測定后，使用校正曲線，算出測定用試樣(72)中所含的AP 42和AP 40的濃度。進(jìn)行體積校正后，評價對于各試樣中所含的A ^ 42量和A ￠40量的回收率。(測定結(jié)果)圖8表示上述測定結(jié)果。根據(jù)該測定結(jié)果，與未添加甲酸的試樣(F) (M)相比，在樣品處理容器中預(yù)先添加有甲酸的試樣(A) (E)，AP 42和AP 40兩者的回收率都顯示非常高的值。其中，并用甲酸和SAC的試樣(D)顯示最高的回收率。由此可知，通過預(yù)先在樣品處理容器中添加以甲酸為代表的添加劑，即使在濃縮工序(第二濃縮工序)之前進(jìn)行預(yù)濃縮工序(第一濃縮工序)的情況下，AP的回收率、即測定靈敏度也顯著提高。
(參考例)在實施例4中不使用添加劑的狀態(tài)下，實施第一濃縮工序，研究在實施第一濃縮工序時添加劑的必要性。利用圖9對本參考例進(jìn)行說明。(樣品(81)的制備)使用市售的固體A P 42 (PEPTIDE INSTITUTE INC.生產(chǎn)，商品編號4349-V)、市售的固體AP 40 (PEPTIDE INSTITUTE INC.生產(chǎn)，商品編號4307-V)和二甲基亞砜(DMSO)，制備A M2的DMSO溶液(濃度20 y M)和AMO的DMSO溶液(濃度100 u M)。將這些溶液等量混合，得到A P 42與A P 40的混合液。然后，使用0. 5 %牛血清白蛋白(BSA)和0. I %的Tween 20的磷酸生理鹽水緩沖液(PH 7. 4、PBS)，將上述混合液稀釋至A P 42的濃度達(dá)到5nM、AP 40的濃度達(dá)到25nM。在該稀釋后的混合液中，能夠使AP 42和AP 40均以A3單體穩(wěn)定存在，因而將其作為本參考例的原液。之后，利用磷酸緩沖液(PB)，對上述原液進(jìn)行分段稀釋，調(diào)節(jié)至目的濃度。在本參 考例中，對于AP 42將最終濃度設(shè)為磷酸緩沖液中20pM，對于AP 40將最終濃度設(shè)為磷酸緩沖液中100pM。此外，在上述分段稀釋的過程中進(jìn)行調(diào)節(jié)，使得作為封閉劑含有最終濃度為0. 9%的牛血清白蛋白(BSA)。之后，將制備的溶液放置24小時以上，得到可溶性AP低聚物、不溶性AP聚合物和AP單體的混合物溶液，將其作為樣品(81)。如上所述制備的樣品是20pM AP 42-100pM A^ 40-0. 9% BSA的磷酸緩沖液(包含微量的DMSO )。(第一濃縮工序的實施)在試管(82)中加入樣品(81)500 ii L后，利用減壓濃縮對試樣(81)實施濃縮(83)。在此，在濃縮(83)中，利用凍結(jié)干燥或減壓濃縮，制作通過減壓濃縮完全干燥固化的試樣
(84)、通過凍結(jié)干燥得到的試樣(85)和通過減壓濃縮將體積濃縮至50y L的未干燥固化的試樣(86 )。(第二濃縮工序)通過在各試樣中添加70%甲酸(87)，進(jìn)行溶液化，得到體積為500 的試樣
(88)、(89)和(90)。接在，通過減壓濃縮對各試樣(88 )、( 89 )和(90 )進(jìn)行濃縮(91 )，使其不完全干燥固化，得到體積為40 u L的試樣(92)、(93)和(94)。(中和工序的實施)然后，在各試樣(92)、(93)和(94)中加入IM Tris緩沖液(未調(diào)節(jié)pH)(95)960 y L，中和甲酸，得到體積為ImL的測定用試樣(96)、(97)和(98)。(測定工序的實施)使用用于測定P淀粉樣蛋白的ELISA的測定試劑盒進(jìn)行測定(和光純藥公司生產(chǎn)，Human/Rat ^ Amyloid42 ELISA Kit wako, High-Sensitive,商品編號 292-64501 和Human/Rat P Amyloid40 ELISA Kit wako II,商品編號 294-64701)。在進(jìn)行測定之前，使用A P 42和A P 40的標(biāo)準(zhǔn)溶液或上述制備的原液，將A P 42制備為0. 3125,0. 625、I. 25、
2.5、5、10、20pMjfA3 40 制備為 I. 5625,3. 125,6. 25,12. 5、25、50、IOOpM,來制備用于制作校正曲線的溶液。制備后，在上述測定試劑盒的微量滴定板中分別加入用于制作校正曲線的溶液和各測定用試樣ImL。
然后，按照測定試劑盒的使用說明，實施測定。測定后，使用校正曲線，算出各測定用試樣中所含的A P 42和A P 40的濃度。進(jìn)行體積校正后，評價對于各試樣中所含的A 3 42量和A ￠40量的回收率。(測定結(jié)果)圖10表示上述測定結(jié)果。 根據(jù)該測定結(jié)果，在任意試樣中，回收率均止于24%左右。在添加增溶劑前對樣品(81)進(jìn)行濃縮的第一濃縮工序中，使試樣完全干燥固化或者不完全干燥固化，在回收率上都不存在顯著差異，回收率很低。如實施例4所示可以判斷，在添加增溶劑之前實施第一濃縮工序的情況下，為了提高A3的回收率、即提高測定靈敏度，預(yù)先在樣品處理容器中添加甲酸等添加劑比在第一濃縮工序中避免試樣完全干燥固化更為重要。產(chǎn)業(yè)上的可利用性根據(jù)本發(fā)明的AP測定方法，即使對樣品進(jìn)行濃縮也能夠?qū)P保持在可溶化狀態(tài)，因而能夠準(zhǔn)確地確定以低濃度含有AP的溶液中的AP的量。因此，能夠測定例如存在于鼻清洗液中的極其微量的AP，能夠用于阿爾茨海默氏病的早期體外診斷。符號說明11 :棉棒；12 :試管；13 :樣品；14 :添加甲酸15 :添加SAC ；16 :添加有甲酸和SAC的試樣；17 :棉棒的脫水；18 :添加甲酸和SAC后除去棉棒后的試樣；19 :濃縮；20 :濃縮至體積為40ii L的試樣；21 :添加IM Tris緩沖液；22 :測定用試樣；31 :樣品；32 :試管；33 添加甲酸34 :添加SAC ；35 :添加有甲酸和SAC的試樣；36 :濃縮；37 :濃縮至體積為40 y L的試樣；38 :添加IM Tris緩沖液；39 :測定用樣品；41 :樣品；42 :試管；43 :濃縮；44 :完全干燥固化的試樣；45 :未完全干燥固化的試樣；46 :添加甲酸；47 :添加甲酸后的試樣；48、50 :添加IM Tris緩沖液；49 :測定用試樣；51 :測定用試樣；61 :樣品；62 :試管；63 :添加劑；64 :添加有添加劑的試樣；65、69 :濃縮；66 :濃縮后的未完全干燥固化的試樣；67 :添加甲酸；68 :添加有甲酸的試樣；70 :第二濃縮后的未完全干燥固化的試樣；71 :添加IM Tris緩沖液；72 :測定用試樣；81 :樣品；82 :試管；83、91 :濃縮；84弟一濃縮后的完全干媒固化的試樣；85 :凍結(jié)干燥后的試樣；86 :第一濃縮后的未完全干燥固化的試樣；87 :添加甲酸；88、88、89 :添加甲酸后的試樣；92、93、94 :第二濃縮后的未完全干燥固化的試樣；95 :添加IM Tris緩沖液;96、97、98 :測定用試樣；101 :樣品準(zhǔn)備工序；102 :濃縮工序；103 :中和工序；104 :測定工序；111 :樣品處理容器準(zhǔn)備工序；112 :樣品準(zhǔn)備工序；113 :第一濃縮工序；114 :第_■濃縮工序；115 :中和工序；116 :測定工序。
權(quán)利要求
1.一種0淀粉樣蛋白的測定方法，其特征在于，包括 樣品準(zhǔn)備工序，在樣品處理容器中加入可能含有3淀粉樣蛋白的樣品； 濃縮工序，在所述樣品處理容器中的所述樣品中添加能夠使3淀粉樣蛋白溶液化的增溶劑，通過濃縮操作，降低所述樣品中含有的溶劑的量； 中和工序，中和在所述濃縮工序中獲得的樣品處理液中的所述增溶劑；和測定工序，基于抗原抗體反應(yīng)，確定經(jīng)過所述中和后的樣品處理液中可能含有的P淀粉樣蛋白的量。
2.如權(quán)利要求I所述的P淀粉樣蛋白的測定方法，其特征在于 還包括在所述樣品準(zhǔn)備工序之前，在樣品處理容器中加入用于使3淀粉樣蛋白附著的添加劑的樣品處理容器準(zhǔn)備工序。
3.—種P淀粉樣蛋白的測定方法，其特征在于，包括 樣品處理容器準(zhǔn)備工序，在樣品處理容器中加入用于使P淀粉樣蛋白附著的添加劑； 樣品準(zhǔn)備工序，在所述樣品處理容器中加入可能含有3淀粉樣蛋白的樣品； 第一濃縮工序，將所述樣品處理容器內(nèi)的所述樣品濃縮； 第二濃縮工序，在通過所述第一濃縮工序濃縮后的樣品中，添加能夠使3淀粉樣蛋白溶液化的增溶劑，通過濃縮操作，降低所述樣品中含有的溶劑的量； 中和工序，中和在所述第二濃縮工序中獲得的樣品處理液中的所述增溶劑；和測定工序，基于抗原抗體反應(yīng)，確定經(jīng)過所述中和后的樣品處理液中可能含有的P淀粉樣蛋白的量。
4.如權(quán)利要求I或3所述的0淀粉樣蛋白的測定方法，其特征在于所述增溶劑是甲酸。
5.如權(quán)利要求2或3所述的P淀粉樣蛋白的測定方法，其特征在于所述添加劑含有甲酸和S-烯丙基-I-半胱氨酸。
6.如權(quán)利要求I或3所述的P淀粉樣蛋白的測定方法，其特征在于所述樣品處理容器含有封閉劑。
7.如權(quán)利要求6所述的P淀粉樣蛋白的測定方法，其特征在于 所述封閉劑含有牛血清白蛋白。
8.如權(quán)利要求I或3所述的P淀粉樣蛋白的測定方法，其特征在于所述樣品處理容器具有抑制0淀粉樣蛋白吸附的內(nèi)壁表面。
9.如權(quán)利要求3所述的P淀粉樣蛋白的測定方法，其特征在于 在所述第一濃縮工序中，不使3淀粉樣蛋白不溶化而進(jìn)行濃縮。
10.如權(quán)利要求I或3所述的P淀粉樣蛋白的測定方法，其特征在于所述樣品是體液。
11.如權(quán)利要求I或3所述的P淀粉樣蛋白的測定方法，其特征在于所述樣品是將機體組織清洗而得到的清洗液。
12.如權(quán)利要求11所述的P淀粉樣蛋白的測定方法，其特征在于 所述機體組織是鼻粘膜。
全文摘要
本發(fā)明提供一種Aβ測定方法，即使在以極低濃度(數(shù)pM的程度)含有Aβ的樣品中，也能夠準(zhǔn)確地測定Aβ濃度。本發(fā)明的β淀粉樣蛋白的測定方法，包括樣品準(zhǔn)備工序(101)，在樣品處理容器中加入可能含有β淀粉樣蛋白的樣品；濃縮工序(102)，在上述樣品處理容器中的上述樣品中添加能夠使β淀粉樣蛋白溶液化的增溶劑，降低上述樣品中含有的溶劑的量；中和工序(103)，中和在上述濃縮工序中獲得的樣品處理液中的上述增溶劑；和測定工序(104)，基于抗原抗體反應(yīng)，確定經(jīng)過上述中和后的樣品處理液中可能含有的β淀粉樣蛋白的量。
文檔編號G01N33/53GK102713622SQ20108006232
公開日2012年10月3日 申請日期2010年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月28日
發(fā)明者南條俊文, 福原崇臣 申請人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社