專利名稱：制備人血清淀粉樣蛋白a1的方法及其表達(dá)載體和基因工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)蛋白質(zhì)或多肽的領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及基因工程制備人血清淀粉樣蛋白A1(Serum Amyloid A1，SAA1)的方法，還涉及其表達(dá)載體和基因工程菌。

背景技術(shù)：
血清淀粉樣蛋白A(Serum Amyloid A，SAA)是一種急性期反應(yīng)載脂蛋白，SAA基因位于11號染色體上，是由同一簇基因編碼的一組多形性蛋白。人血清淀粉樣蛋白A1(SAA1)由104個氨基酸組成，分子量約12KD-14KD左右。SAA是一個多態(tài)性蛋白，由幾個相關(guān)的蛋白家族(SAA1-SAA4)組成。主要由肝細(xì)胞合成。其中SAA1和SAA2的基因只有7個氨基酸的差別，它們均編碼急性期SAA蛋白。SAA4在急性期反應(yīng)中變化不大，是一個在動態(tài)平衡中與高密度脂蛋白膽固醇一起出現(xiàn)的異形物。
SAA與C-反應(yīng)蛋白(CRP)都是急性期反應(yīng)蛋白，均能受到細(xì)胞因子刺激而表達(dá)，但SAA對刺激更敏感。在急性感染早期，SAA受到IL-1、IL-6和TNF等炎癥因子刺激，在肝細(xì)胞中大量合成，然后其N端的特異性結(jié)合區(qū)與高密度脂蛋白(HDL)形成SAA-HDL顆粒，進(jìn)而調(diào)節(jié)高密度脂蛋白的代謝，以增強與巨噬細(xì)胞親和力并輸送脂質(zhì)至炎癥部位，SAA是有效的中性粒細(xì)胞激活劑，增強中性粒細(xì)胞的抗菌作用、抑制霉菌感染。另外，SAA還表現(xiàn)出細(xì)胞因子的相似特性，可以誘發(fā)ILlb產(chǎn)生。同樣，SAA還上調(diào)T淋巴細(xì)胞分泌干擾素。SAA能減少金屬蛋白酶的產(chǎn)生，從而引導(dǎo)組織損傷修復(fù)。
更加有意義的是，不同于CRP只在急性炎癥時有變化，SAA在急性和慢性炎癥患者血清內(nèi)含量均有變化，有時可達(dá)正常濃度的1000倍(正常值一般為910±270微克/升)，因此，SAA作為反映感染性疾病炎癥的生物檢測指標(biāo)更為敏感。對于SAA的臨床意義和應(yīng)用受到極大關(guān)注，如澳大利亞墨爾本大學(xué)研究人員發(fā)現(xiàn)SAA不僅是慢性阻塞性肺病(COPD)急性加重期的生物學(xué)標(biāo)志物，也是急性心梗(AMI)患者在接受急診冠狀動脈介入(PCI)手術(shù)后發(fā)生心臟破裂的預(yù)測因子，這為早期發(fā)現(xiàn)心臟破裂患者提供了重要參考指標(biāo)。其他大量的研究也表明，在胰腺炎、肝炎、冠心病、糖尿病、慢性腎臟疾病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及肥胖病例中SAA升高與疾病活動有非常密切的關(guān)系。因此，目前臨床研究認(rèn)為，與其它急性期反應(yīng)蛋白相比，SAA是在急性炎癥期反應(yīng)最靈敏，升值幅度最大的蛋白，特別是在免疫功能受到抑制和減退以及慢性炎癥造成機體內(nèi)CRP水平不能反映疾病變化的狀況時，SAA依然與炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展保持良好的相關(guān)性，同時檢測患者的CRP和SAA水平能提高對感染的診斷靈敏度。而且SAA在診斷病毒性感染、腎移植排斥反應(yīng)以及用腎上腺皮質(zhì)激素治療囊性纖維化的治愈方面，比CRP更準(zhǔn)確。同時研究還表明SAA與甲胎蛋白等的腫瘤相關(guān)蛋白相似，其在血清中的濃度與癌癥發(fā)生程正相關(guān)。因此臨床上對SAA在病人血清中含量的檢測具有輔助診斷價值。
SAA并不是一種簡單的炎癥標(biāo)志物，也積極介入疾病的相關(guān)過程。比如SAA的降解產(chǎn)物是由76個氨基酸組成，分子量為8500淀粉樣A蛋白(AA)，其通常沉積在各組織器官之間，主要見于慢性感染，炎癥或腫瘤引起的全身性淀粉樣病變。同樣在青光眼的研究中發(fā)現(xiàn)，由于SAA在眼部的過量表達(dá)，引起局部的眼球壓力過大，從而誘發(fā)青光眼疾病。由于SAA與多種疾病的發(fā)生相關(guān)這一特性，目前針對SAA的治療方法已越來越受到重視。
鑒于SAA在臨床治療及診斷中的重要性，目前國內(nèi)外對SAA的研究越來越重視。目前普遍使用兩種表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌和昆蟲表達(dá)系統(tǒng)，分別表達(dá)GST-SAA及rSAA蛋白。但SAA的體外重組表達(dá)及純化由于其蛋白特性，如其容易體外聚集，表達(dá)量低，獲得的可溶性蛋白少，純化方法復(fù)雜等。從而長期以來一直限制了SAA體外研究的進(jìn)一步開展。通過這兩種方法獲得的重組SAA蛋白均為包涵體，因此在純化過程中必須使用6M尿素或鹽酸胍對純化目的蛋白進(jìn)行變復(fù)性等復(fù)雜手段，因而純化獲得的重組蛋白生物活性較低，并且活性不穩(wěn)定。另外，此純化方法耗時長、得率低、成本高，不利于大量生產(chǎn)。
本發(fā)明所揭示的制備方法在國內(nèi)外均未見有報道，本發(fā)明通過基因擴增及重組的方法，針對SAA1的成熟肽進(jìn)行克隆重組，并在N-端加上多聚組氨酸(6x His)親和肽標(biāo)記，進(jìn)而選用大腸桿菌Rosetta-gami作為宿主菌，獲得了可溶的目的蛋白。本發(fā)明的優(yōu)點在于，(1)用以上方法獲得的重組SAA蛋白為可溶性成熟蛋白，從而避免了在純化步驟中的變復(fù)性，最大可能性地還原其在體內(nèi)的折疊結(jié)構(gòu)，保持其生物活性；(2)對重組成熟SAA-多聚組氨酸親和肽的使用可簡化純化方法；(3)使用大腸桿菌Rosetta-gami，最大限度地防止重組SAA蛋白大量表達(dá)對宿主細(xì)胞的毒性，從而提高重組蛋白的產(chǎn)量。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是提供一種在大腸桿菌中表達(dá)可溶性人SAA1，即人血清淀粉樣蛋白A1，并能通過親和柱高效制備該可溶性人SAA1的重組方法，及其表達(dá)載體和工程菌。
本發(fā)明的第一方面，提供一種基因工程人SAA1的表達(dá)載體，該載體含有人SAA(hSAA1)基因序列的質(zhì)粒載體pET28a(+)，并且hSAA1編碼序列位于pET28a(+)載體上NdeI和XholI酶切位點之間。
本發(fā)明的第二方面，提供一種基因工程菌，為pET28a(+)-hSAA1/Rosetta-gami，其宿主是大腸桿菌(Escherichia coli)Rosetta-gami，并被本發(fā)明所述的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明的第三方面，提供一種表達(dá)及純化基因工程人SAA的制備方法，包括如下步驟①培養(yǎng)和表達(dá)基因工程菌pET28a(+)-hSAA1/Rosetta-gami；②離心收集基因工程菌；③融合蛋白SAA1的親和柱純化；④透析除鹽，得到目的蛋白。
本發(fā)明的制備方法以大腸桿菌(Escherichia coli)Rosetta-gami為宿主菌，所述載體選用含有人SAA(hSAA1)基因序列的質(zhì)粒載體pET28a(+)，且hSAA1編碼序列位于pET28a(+)載體上NdeI和XholI酶切位點之間。通過基因擴增及重組，針對SAA1的成熟肽進(jìn)行克隆重組，去除SAA前體蛋白的N端的20個氨基酸，并在其N端加上6個多聚組氨酸親和多肽標(biāo)記，構(gòu)成SAA-6His融合蛋白。通過鎳親和柱一步純化法，獲得可溶性的目的蛋白。
本發(fā)明的鎳親和柱一步純化法，純化步驟簡單，所需時間短，純化全程時間較短，優(yōu)選的純化全程時間為4-6小時。純化優(yōu)化全程時間與純化的菌液體積的關(guān)系一般為1升(1L)的表達(dá)菌液，純化時間需4小時左右。
本發(fā)明所述的“SAA前體蛋白”，是指由SAA cDNA編碼，在細(xì)胞內(nèi)合成的，未切除信號肽的SAA全長蛋白。本發(fā)明所述的“SAA1的成熟肽”，是指在細(xì)胞內(nèi)切除信號肽，分泌到血清中，具有生物功能的SAA蛋白。
本發(fā)明所述的“鎳親和柱一步純化法”，是指只通過一根鎳親和柱，通過合適方法，直接從親和柱上獲得所需要的目的蛋白。不需要依賴其他方法不需要依賴其他試劑再進(jìn)一步純化。
本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于首次采用多聚組氨酸融合表達(dá)載體(PET28a)來表達(dá)去除信號肽后的人SAA1成熟蛋白，一是可以在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)大量可溶的人SAA1蛋白。所獲得的可溶性目的蛋白，不需要進(jìn)行變復(fù)性步驟等其他方法，使純化方法簡單化，并且目的蛋白的得率大為提高。二是可利用融合蛋白的N端的6個多聚組氨酸多肽作為純化標(biāo)記，快速簡便高效，有利于后續(xù)的純化工藝，獲得高純度的人重組SAA1蛋白，其純度在95％以上。本發(fā)明純化成本低，但純度高，可在1升工程菌液中獲得10mg以上的可溶性重組SAA蛋白。
比較本發(fā)明的SAA純化方法與傳統(tǒng)的SAA純化方法，結(jié)果如表一所示。
表一本發(fā)明的SAA純化方法與傳統(tǒng)的SAA純化方法的比較
本發(fā)明的優(yōu)點在于，(1)用以上方法獲得的重組SAA蛋白為可溶性成熟蛋白，從而避免了在純化步驟中的變復(fù)性，最大可能性地還原其在體內(nèi)的折疊結(jié)構(gòu)，保持其生物活性；(2)對重組成熟SAA-多聚組氨酸親和肽的使用可簡化純化方法；(3)使用大腸桿菌Rosetta-gami，最大限度地防止重組SAA蛋白大量表達(dá)對宿主細(xì)胞的毒性，從而提高重組蛋白的產(chǎn)量。
綜上所述，運用本發(fā)明所述的重組載體，表達(dá)工程菌及蛋白質(zhì)純化方法，可簡便快速地獲得純度達(dá)95％以上的可溶性人體外重組SAA1蛋白質(zhì)。



圖1反轉(zhuǎn)錄PCR從病人組織內(nèi)擴增獲得人SAA1。其中，M標(biāo)準(zhǔn)DNA ladder；1-3不同反應(yīng)管的PCR產(chǎn)物。
圖2pET28a(+)-hSAA1重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定。其中，M標(biāo)準(zhǔn)DNA ladder；1-14雙酶切鑒定的不同克隆質(zhì)粒(限制性內(nèi)切酶為NedI、XholI)。
圖3全長PET28a-rSAA重組質(zhì)粒圖譜。
圖4a重組人SAA蛋白在Rosetta-gami宿主菌中IPTG誘導(dǎo)表達(dá)電泳圖(15％的丙稀酰胺凝膠)。其中，M標(biāo)準(zhǔn)蛋白ladde，1IPTG誘導(dǎo)前；2-4不同SAA-rosetta-gami宿主菌IPTG誘導(dǎo)后2.5小時。
圖4b在各SAA表達(dá)宿主菌IPTG誘導(dǎo)前至誘導(dǎo)后，宿主菌生長濃度OD值曲線圖。從菌液生長曲線結(jié)果表明，SAA-Rosetta-gami IPTG誘導(dǎo)后生長最佳，Rosetta-gami比較適合用于人重組SAA表達(dá)。
圖515％的SDS-PAGE檢測最終獲得的重組蛋白。其中，lane1IPTG誘導(dǎo)以前總菌裂解液；lane2IPTG誘導(dǎo)以后總菌裂解液；lane3鎳柱純化后的產(chǎn)物。
圖6蛋白印跡(Weston Blot)試驗。其中，lane1IPTG誘導(dǎo)以前總菌裂解液；lane2IPTG誘導(dǎo)以后總菌裂解液；lane3鎳柱純化后的產(chǎn)物。
圖7純化蛋白在高效液相色譜(HPLC)上純度分析的結(jié)果。經(jīng)HPLC分析測得的蛋白純度為97.25％。
圖8純化蛋白的質(zhì)譜上蛋白分子量分析結(jié)果。重組SAA1蛋白質(zhì)分子量經(jīng)質(zhì)譜分析儀測定為13.8KD。
圖9質(zhì)譜對純化蛋白的氨基酸多肽分析結(jié)果。通過對純化的該重組蛋白的氨基酸多肽分析及還原結(jié)果表明，該重組蛋白序列與目的蛋白(人SAA1成熟肽)序列一致，純度97.27％。
具體實施方法 以下結(jié)合實施例和附圖，來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。以下各實施例是為說明本發(fā)明而非為限制本發(fā)明范圍。
實施例1.人SAA1的編碼基因PCR擴增及重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-SAA的構(gòu)建 構(gòu)建步驟如下 1)抽提總RNA 取新鮮病人肝臟組織，勻漿器粉碎后用RNA抽提試劑盒抽提總RNA。
2)目的基因的PCR擴增(RT-PCR) 以總RNA為模版，運用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，得到SAA1的cDNA。根據(jù)基因庫中公布的人SAA1序列設(shè)計一對引物，引物為 上游引物5‘AT CATATG TTCTTTTCGTTCCTTGGCGAG(Nde I)； 下游引物5’AT CTCGAG TCAGTATTTCTCAGGCAGG(Xhol I)。
設(shè)計引物時參考已報道的人SAA1序列，從cDNA的第60個核苷酸開始，擴增人SAA蛋白的成熟肽基因。
采用以下PCR反應(yīng)系統(tǒng)和程序在一個200ul微量PCR反應(yīng)管內(nèi)加入以下試劑10XPCR緩沖液5μl；模版cDNA庫1μg；dNTP1mM；上下游引物各100pM；Taq酶2U；加入去離子滅菌水至終體積50ul。反應(yīng)條件為94℃5分鐘，94℃30秒，48℃30秒，72℃30秒，40個循環(huán)，然后72℃延伸10分鐘。
反應(yīng)完成后，對反應(yīng)產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠TAE電泳，見附圖1，結(jié)果得到的DNA擴增片段與預(yù)期設(shè)計的基因大小相一致。
3)PCR產(chǎn)物克隆 擴增出的PCR片段，用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，然后雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒純化后直接定向連接到pET-28a(+)載體上，方法見文獻(xiàn)(Sambrooks，分子克隆手冊)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5a宿主菌中，提取質(zhì)粒，用NdeI和XholI雙酶切鑒定，瓊脂糖電泳結(jié)果，如附圖2所示，酶切片段大小與設(shè)計一致的(約為300個核苷酸的片段)為陽性克隆。
4)將陽性克隆進(jìn)行DNA序列測定 將篩選得到的陽性克隆進(jìn)行DNA小規(guī)模抽提，方法見文獻(xiàn)(Sambrooks，分子克隆手冊)，并將抽提的DNA質(zhì)粒送到測序公司進(jìn)行測序，如序列1，SEQ NO.1所示，測序引物為T7通用引物。全長PET28a-rSAA重組質(zhì)粒圖譜見附圖3所示。全長PET28a-rSAA重組質(zhì)粒核甘酸序列，如序列2，SEQ NO.2所示，其中，SEQNO.2中的黑體劃線部分為插入人saa1基因序列。其測序結(jié)果與其基因庫已報道人SAA1序列的比較(NM 000331)，序列比較一致，如序列3，SEQ NO.3所示。
實施例2.高效表達(dá)工程菌的構(gòu)建及篩選 將重組質(zhì)粒pET-28(a)-SAA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta-gami中，取重組菌單菌落接種于3ml含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過夜。次日將過夜培養(yǎng)的重組工程菌按2％接種于3mlLB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)約2小時至OD600為0.8左右時，加入IPTG到終濃度1mM，誘導(dǎo)2.5小時。15％的SDS-PAGE檢測融合蛋白的表達(dá)形式和表達(dá)量，篩選高效表達(dá)菌株。結(jié)果見以下的表二，附圖4a和附圖4b。附圖4a和4b表明，從蛋白電泳圖及宿主菌生長曲線結(jié)果表明，在加入誘導(dǎo)劑IPTG總培養(yǎng)時間1.5小時以后，其他宿主菌的生長均表現(xiàn)抑制甚至停止，而宿主菌Rosetta-gami則生長狀況最佳，最適合表達(dá)重組人SAA蛋白。
表二各人SAA-表達(dá)菌種，不同時間生長濃度OD600測定 注當(dāng)OD值達(dá)到0.8時，取出菌液加入1mM IPTG誘導(dǎo)并繼續(xù)生長。
實施例3.基因重組菌的大規(guī)模表達(dá)及純化方法 重組人SAA-多聚組氨酸融合蛋白在大腸桿菌宿主中的表達(dá)； 1)將PET28a-saa1轉(zhuǎn)化到Rosetta-gami大腸桿菌中在帶有卡那霉素抗性(50ng/ml)的LB培養(yǎng)板上，37℃培養(yǎng)過夜； 2)挑取一個單菌落在50ml含有50微克/毫升卡那霉素的LB培養(yǎng)中37℃250轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)過夜； 3)2％接種培養(yǎng)到1L LB培養(yǎng)基中(包括50ug/ml卡那霉素)，37℃to A600，O.D.0.5； 4)加入IPTG至終濃度1mM 37℃，300轉(zhuǎn)/分鐘誘導(dǎo)培養(yǎng)3hours； 5)高速離心4000rpm 20分鐘，收集沉淀并保存在-80℃。
純化重組人SAA-多聚組氨酸融合蛋白的試劑 1)裂解液50mM Tris-HCl Ph 8.0，500mM NaCl，10mM imidazole，1mMPMSF，5mM 2-Me 2)洗滌液150mM Tris-HCl Ph 8.0，500mM NaCl，10mM imidazole，1mMPMSF，5mM 2-Me 3)洗滌液r250mM Tris-HCl Ph 8.0，500mM NaCl，20mM imidazole，1mMPMSF，5mM 2-Me 4)洗滌液350mM Tris-HCl Ph 8.0，500mM NaCl，30mM imidazole，1mMPMSF，5mM 2-Me 5)洗脫液150mM Tris-HCl Ph 8.0，150mM NaCl，100mM imidazole，1mMPMSF，5mM 2-Me 6)洗脫液250mM Tris-HCl Ph 8.0，150mM NaCl，300mM imidazole，1mMPMSF，5mM 2-Me 純化步驟 1)將1升LB培養(yǎng)基表達(dá)SAA1重組融合蛋白的大腸桿菌懸浮在50ml裂解液中； 2)在冰上超聲4-5次，30秒/次； 3)10000g高速離心15分鐘； 4)取上清再10000g高速10分鐘； 5)取上清上柱到1ml鎳柱中； 6)用30ml洗滌液1清洗鎳柱； 7)用30ml洗滌液2清洗鎳柱； 8)用30ml洗滌液3清洗鎳柱； 9)用3ml洗脫液1從鎳柱上洗脫目的蛋白，每11滴收集一個試管； 10)用3ml洗脫液2從鎳柱上洗脫目的蛋白，每11滴收集一個試管； 11)將洗脫的樣品混合在一起，并用1XPBS，4℃透析三次過夜； 12)將透析好的樣品保存在-80℃。
基因重組菌的表達(dá)及純化結(jié)果，如附圖5所示，其中，lane1IPTG誘導(dǎo)以前總菌裂解液；lane2IPTG誘導(dǎo)以后總菌裂解液；lane3鎳柱純化后的產(chǎn)物。通過透析，A280OD值測定，經(jīng)計算得到蛋白總濃度為2.4mg/ml；共6ml，最終結(jié)果約為14mg蛋白/L菌液表達(dá)。
實施例4.蛋白印跡法對重組蛋白的證明 1)15％丙稀酰胺膠，90V，3小時 2)通過Tris-glycine緩沖液將丙稀酰胺上的蛋白片段電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，條件為1Xtris-glycine緩沖液，20％甲醇，70V電壓下，室溫轉(zhuǎn)移3小時 3)將電轉(zhuǎn)后的PVDF膜取出，用1X PBST清洗30分鐘 4)用含有5％脫脂奶粉的PBST封閉45分鐘 5)用1X PBST漂洗PVDF膜3次，10分鐘/次 6)加入含1∶2000稀釋的抗人SAA抗體的PBST 8mL，室溫反應(yīng)1小時 7)用1X PBST洗滌PVDF膜三次，15分鐘/次 8)加入含1∶1000稀釋的抗小鼠的抗體，室溫反應(yīng)40分鐘 9)用1X PBST洗滌PVDF膜三次，15分鐘/次 10)用含0.3％H2O2和6mg二氨基聯(lián)苯胺的顯色液，顯色15秒實驗結(jié)果如附圖6所示。
實施例6.高效液相色譜(HPLC)對純化蛋白的純度分析 將以上實施例中所獲得的純化蛋白在高效液相色譜(HPLC)上純度分析，按常規(guī)HPLC測試方法，其結(jié)果如附圖7所示，純度結(jié)果分析為檢測蛋白純度為97.25％。
實施例7.質(zhì)譜對純化蛋白的蛋白分子量進(jìn)行分析 將以上實施例中所獲得的純化蛋白在質(zhì)譜上進(jìn)行分子量分析，按常規(guī)質(zhì)譜分析方法，重組SAA1蛋白質(zhì)分子量經(jīng)質(zhì)譜分析儀測定為13.8KD，其結(jié)果如附圖8所示，與從氨基酸序列計算得到的分子量相吻合。
實施例8.通過質(zhì)譜對其氨基酸多肽分析 通過對純化的該重組蛋白的氨基酸多肽分析及還原結(jié)果表明，如附圖9所示，該重組蛋白序列與目的蛋白(人SAA1成熟肽)序列一致，純度97.27％。即，運用本發(fā)明所述的重組載體，表達(dá)工程菌及蛋白質(zhì)純化方法，可獲得純度達(dá)95％以上的人體外重組SAA1蛋白質(zhì)。
序列表
<110>德賽診斷系統(tǒng)(上海)有限公司
<120>制備人血清淀粉樣蛋白A1的方法及其表達(dá)載體和基因工程菌
<160>3
<210>1
<211>309
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
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<210>3
<211>309
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
報道序列133TTCTTTTCGTTCCTTGGCGAGGCTTTTGATGGGGCTCGGGACATGTGGAGAGCCTACTCT 192
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擴增序列284TTCTTTTCGTTCCTTGGCGAGGCTTTTGATGGGGCTCGGGACATGTGGAGAGCCTACTCT 343
報道序列193GACATGAGAGAAGCCAATTACATCGGCTCAGACAAATACTTCCATGCTCGGGGGAACTAT 252
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擴增序列344GACATGAGAGAAGCCAATTACATCGGCTCAGACAAATACTTCCATGCTCGGGGGAACTAT 403
報道序列253GATGCTGCCAAAAGGGGACCTGGGGGTGCCTGGGCTGCAGAAGCGATCAGCGATGCCAGA 312
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擴增序列404GATGCTGCCAAAAGGGGACCTGGGGGTGCCTGGGCTGCAGAAGCGATCAGCGATGCCAGA 463
報道序列313GAGAATATCCAGAGATTCTTTGGCCATGGTGCGGAGGACTCGCTGGCTGATCAGGCTGCC 372
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擴增序列464GAGAATATCCAGAGATTCTTTGGCCATGGTGCGGAGGACTCGCTGGCTGATCAGGCTGCC 523
報道序列373AATGAATGGGGCAGGAGTGGCAAAGACCCCAATCACTTCCGACCTGCTGGCCTGCCTGAG 432
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擴增序列524AATGAATGGGGCAGGAGTGGCAAAGACCCCAATCACTTCCGACCTGCTGGCCTGCCTGAG 583
報道序列433AAATACTGA 441
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擴增序列584AAATACTGA 59權(quán)利要求
1.一種基因工程人SAA1的表達(dá)載體，其特征在于，該載體含有人SAA(hSAA1)基因序列的質(zhì)粒載體pET28a(+)，并且hSAA1編碼序列位于pET28a(+)載體上NdeI和Xhol I酶切位點之間。
2.一種基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌為pET28a(+)-hSAA1/Rosetta-gami，宿主菌為大腸桿菌(Escherichia coli)Rosetta-gami，被權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化。
3.一種制備人血清淀粉樣蛋白A1(hSAA1)的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟①培養(yǎng)和表達(dá)基因工程菌pET28a(+)-hSAA1/Rosetta-gami；②離心收集基因工程菌；③融合蛋白SAA1的親和柱純化；④透析除鹽，得到可溶性目的蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟①中以大腸桿菌(Escherichia coli)Rosetta-gami為宿主菌，以含有人SAA(hSAA1)基因序列的質(zhì)粒載體pET28a(+)為載體。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟①中去除SAA前體蛋白的N端的20個氨基酸，并在其N端加上6個多聚組氨酸親和多肽標(biāo)記。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟③是通過鎳親和柱一步純化法。
全文摘要
本發(fā)明提供一種可溶的基因工程人血清淀粉樣蛋白A1(SAA1)的制備方法，及其表達(dá)載體和基因工程菌。本發(fā)明提供的表達(dá)載體為含有人SAA(hSAA1)基因序列的質(zhì)粒載體pET28a(+)，并且hSAA1編碼序列位于pET28a(+)載體上NdeI和Xhol I酶切位點之間。本發(fā)明提供的基因工程菌是大腸桿菌，為pET28a(+)-hSAA1/Rosetta-gami，可表達(dá)可溶性目的蛋白。本發(fā)明制備方法采用鎳交聯(lián)親和柱一步法，操作簡便、得率高、耗時短，所獲目的蛋白純度大于90％，適于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C12N1/21GK101724641SQ20091005554
公開日2010年6月9日 申請日期2009年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月29日
發(fā)明者吳峻, 王榮芳, 錢震斌 申請人:德賽診斷系統(tǒng)(上海)有限公司