專利名稱：：一種x-str基因座熒光標記復(fù)合擴增體系及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及檢測人體基因組中具有多態(tài)性的遺傳標記，尤其涉及X染色體遺傳標記技術(shù)，具體涉及一種X-STR基因座熒光標記復(fù)合擴增體系及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandemr印eats，簡稱STR)是由27個堿基對作為核心單位，串聯(lián)重復(fù)形成的一類微衛(wèi)星DNA序列，其片段可采用PCR技術(shù)擴增。STR主要由于核心重復(fù)單位數(shù)目的變化形成了STR基因位點的遺傳多態(tài)性，其等位基因可用銀染、熒光標記和放射自顯影等技術(shù)分型。人類基因組中，平均每610kb就存在有一個STR基因位點，為法醫(yī)個人識別和親子鑒定提供了高信息基因位點的豐富來源。X染色體是人類性染色體，X染色體短串聯(lián)重復(fù)(X-chromosomalShortTandemR印eat，X-STR)是性染色體上一類多態(tài)性遺傳標記，男性的X-STR以單倍型形式存在只能從其母親中得到，且只能遺傳給女兒，因此同父所生的姐妹在X-STR基因座上有l(wèi)個相同的等位基因，孫女X-STR基因座有1個等位基因與其祖母相同。X染色體這種獨特的遺傳方式，使得X-STR在親緣鑒定中有特殊的應(yīng)用價值。在親緣鑒定中，有些沒有父母雙親參與檢測的特殊案件，如姐妹認親、同父異母的半同胞姐妹認親、隔代認親(祖母-孫女)等，用常染色體、Y染色體或線粒體的遺傳標記無法排除或認定，此時只有依靠X染色體STR才能起到直接排除或認定的作用。此外在有先天性缺陷的遺傳病中，可通過檢測X染色體STR來診斷有無X染色體多倍體、X染色體重復(fù)、X-STR重復(fù)序列長短等，同時，X染色體STR檢測可應(yīng)用于X連鎖遺傳病、X染色體單親二倍體、X染色體失活的親源性等鑒定。從而為伴X染色體遺傳病提供產(chǎn)前診斷方法。因此，可以通過分析X染色體上的STR基因座的等位基因分型來確定親緣關(guān)系和用于伴X染色體遺傳病的產(chǎn)前診斷。X染色體STR位點廣泛存在真核細胞基因組中，高度穩(wěn)定且具有較高的遺傳多態(tài)性，然而與常染色體和Y染色體STR相比，迄今發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用的X-STR位點數(shù)量較少，群體分布、突變率、連鎖平衡、基因結(jié)構(gòu)等方面的信息尚不夠豐富，在法醫(yī)學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用受限，遠不及其他DNA遺傳標記廣泛。X染色體遺傳標記的研究在國內(nèi)還處于初期，目前國際上商品化檢測試劑盒僅有德國ArgusX-8和Mentype⑧ArgusX_12，該類試劑盒在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用實踐中存在以下問題(1)采用這類試劑盒需要增加遺傳標記時遇到困難；(2)這些X-STR基因位點都是基于中國群體以外的群體(主要是白人群體)資料而開發(fā)的，其中有些基因位點，在中國群體的基因頻率分布較差，個人識別能力較低；(3)國外商品化試劑盒價格昂貴。這些缺點限制了X染色體遺傳標記在國內(nèi)的應(yīng)用，不利于進一步在基層推廣。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種適合于中國人群的，可以快速、方便針對常染色體STR、Y-STR難以排除或認定親緣關(guān)系的特殊檢案(姐妹認親、同父異母的半同胸姐妹認親、隔代認親等)進行鑒定的X-STR基因座熒光標記復(fù)合擴增體系。本發(fā)明的另一個目的在于提供上述X-STR基因座熒光標記復(fù)合擴增體系在為伴X連鎖遺傳病、X染色體單親二倍體、X染色體失活的親源性鑒定等提供產(chǎn)前診斷，以及姐妹認親、同父異母的半姐妹認親、隔代認親等親緣鑒定中的應(yīng)用。本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實現(xiàn)的—種X-STR基因座熒光標記復(fù)合擴增體系，該復(fù)合擴增體系共包含14個基因座DXS7133、DXS6801、DXS981、DXS6809、DXS7424、DXS6789、DXS9898、DXS7132、GATA165B12、DXSIOI、DXS10075、GATA31E08、DXS10074和DXS10079。本發(fā)明對上述14個X-STR基因座進行了研究，表明這14個基因座在中國人群中有高度的遺傳多態(tài)性和良好的等位基因頻率分布?！⒈景l(fā)明復(fù)合擴增體系中14個基因座的選擇(1)位于同一連鎖群內(nèi)作為位于同一染色體的基因座，必須考慮到連鎖遺傳的問題。各基因座位于同一個連鎖群之內(nèi)，呈連鎖遺傳，便于以單倍型觀察多態(tài)性。除GATA31E08外其余13個基因座DXS7133、DXS6801、DXS981、DXS6809、DXS7424、DXS6789、DXS7132、GATA165B12、DXSIOI、DXS10075、DXS10074和DXS10079均位于第二連鎖群內(nèi)，應(yīng)呈連鎖遺傳。本發(fā)明的14個基因座分布于同一染色體上不同的位置，既有緊密連鎖者，也有遺傳距離相距較遠者。緊密連鎖的DXS7132-DXS10075-DXS10074-DXS10079;DXS7133-DXS7424-DXS101和DXS6801-DXS6809-DXS6789。它們分別位于Xql2、Xq21和Xq22區(qū)。緊密連鎖的基因座構(gòu)成單倍型，在親緣鑒定中有利于分析親代與子代之間的遺傳關(guān)系。(2)易于擴增除上述14個基因座外，實驗初期發(fā)明人還選擇了另外一些位于X染色體第二連鎖群內(nèi)的基因座，如ARA、DXS6800、DXS9905、DXS7130、DXS6797、DXS9895等。但單基因座擴增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些基因座的擴增存在著一些問題，有的擴增的產(chǎn)物量少，顯帶過淺，甚至有時很難得到擴增產(chǎn)物，如DXS7130;有的很容易出現(xiàn)非特異帶(如影子帶)，如DXS6797;而上述14個基因座易于擴增穩(wěn)定性好，結(jié)果清晰，非特異性帶很少。因此最后選擇了DXS7133、DXS6801、DXS981、DXS6809、DXS7424、DXS6789、DXS9898、DXS7132、GATA165B12、DXSIOI、DXS10075、GATA31E08、DXS10074和DXS10079這14個易于擴增，分型較好的基因座進行復(fù)合擴增。(3)擴增產(chǎn)物片段長度不重疊復(fù)合擴增各基因座片段大小的差距應(yīng)大于20bp，各基因座的等位基因之間才不會發(fā)生重疊，干擾分型。本發(fā)明的X-STR基因座復(fù)合擴增體系根據(jù)各基因座擴增產(chǎn)物片段長度大小，用同一熒光標記不同擴增產(chǎn)物片段長度(相差大于20bp)的基因座，保證復(fù)合擴增各基因座的等位基因之間不會發(fā)生重疊，不會干擾分型。用四種不同顏色的熒光標記多個基因座的引物，保證同一反應(yīng)體系能同時擴增多個基因座，而不影響各基因座的分型。本發(fā)明的14個基因座引物分別用FAM、HEX、TAM、ROX四種不同顏色的熒光標記。體系中14個X-STR基因座其熒光組合方式為FAM熒光素標記DXS7133、DXS6801、DXS981和DXS6809，HEX熒光素標記DXS7424、DXS6789、DXS9898和DXS7132，TAMRA熒光素標記DXS165B12、DXS101和DXS10075，ROX熒光素標記GATA31E08、DXS10074和DXS10079。本發(fā)明提供一種同時分析多個X染色體STR基因座的熒光標記復(fù)合擴增體系，包括用于復(fù)合擴增分析的14個X-STR基因座的引物，全部14個基因座的引物混合在一個試管內(nèi)。復(fù)合擴增體系中的基因座被位于該基因座兩側(cè)的一對引物擴增，其中每對引物中的引物正鏈的5'端用相應(yīng)的熒光素標記。二、本發(fā)明復(fù)合擴增基因座的擴增本發(fā)明的X-STR基因座熒光標記復(fù)合擴增體系是采用復(fù)合PCR技術(shù)在同一反應(yīng)管中同時擴增14個X-STR基因座。(l)PCR反應(yīng)體系反應(yīng)總體積為25iU:PCR反應(yīng)緩沖液5.0iil，引物混合物5.0ii1，DNA聚合酶0.3iil，模板DNA2.0iil，消毒純凈水12.7ill。上述DNA聚合酶可選用本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的DNA聚合酶，如金牌DNA聚合酶T叫Gold.)。(Ampl〗(2)PCR擴增參數(shù):95°Cllmin94°C1min，^30個循環(huán)61°Clmin72°C1min60°C45min(3)ABIPRISM3100遺傳分析儀電泳分型擴增產(chǎn)物a.樣品準備GeneScanTM-500LIZsizestandard0.25pinkx樣品數(shù)去離子甲酰胺9.75^1混勻后瞬時離心，每管加10.0ill混合物，再加PCR產(chǎn)物1.0ii1，瞬時離心。95°C變性4min，放置冰盒中冷卻3min，取10.0變性后的樣品轉(zhuǎn)移至96孔樣品板，裝載入ABIPRISM3100遺傳分析儀進行電泳。b.電泳條件:14.7kV，130iiA，14.8mW。c.結(jié)果分析GeneM即perlDv3.1軟件。本發(fā)明的14個基因座已在發(fā)明人實驗室應(yīng)用于群體學(xué)調(diào)查并獲得中國群體的分型結(jié)果，結(jié)果證明這些基因座多態(tài)性較高，適合于中國人群的檢測，并應(yīng)用于實際檢案取得理想的結(jié)果。本發(fā)明的X-STR基因座熒光標記復(fù)合擴增體系也可以制成試劑盒，為姐妹認親和5隔代認親提供新的檢測系統(tǒng)，為X染色體相關(guān)性遺傳病進行產(chǎn)前診斷。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果1.靈敏度高本發(fā)明的X-STR基因座熒光標記復(fù)合擴增體系在模板量為0.lng時可檢出全部14個基因座；2.個體識別率高本發(fā)明的X-STR基因座熒光標記復(fù)合擴增體系中的14個X-STR基因座單倍型個體識別率達到0.9999992;3.本發(fā)明的X-STR基因座熒光標記復(fù)合擴增體系已在發(fā)明人實驗室用于檢測多代家系和多個小孩家系的樣本。結(jié)果在120例姐妹樣本中14個X-STR基因座分型均有1個相同等位基因。58例祖母-父親-孫女的三代家系中祖母的X-STR均通過父親穩(wěn)定地傳遞給孫女。這結(jié)果表明本研究所選的基因座穩(wěn)定性好，突變率低，分型結(jié)果準確，能滿足實際檢案的需要；4.本發(fā)明在國內(nèi)首先研制出一組14個X-STR基因座同時在單一反應(yīng)管中的復(fù)合擴增的五色熒光標記X-STR復(fù)合擴增檢測體系，達到目前國際上熒光標記X-STR基因座復(fù)合擴增試劑盒的最高水平；5.本發(fā)明的熒光標記引物復(fù)合擴增技術(shù)快速、方便，PCR產(chǎn)物可用310、377、ABIPRISM3100、3130等遺傳分析儀電泳，結(jié)果自動分析，能標準化、國際化，保證不同實驗室數(shù)據(jù)比較的正確性；6.本發(fā)明可制備一套試劑盒，可進行商品化，可以填補國內(nèi)沒有X-STR基因座熒光復(fù)合擴增試劑盒的空白，也可補充國際X-STR基因座熒光復(fù)合擴增試劑盒的不足，作為具有中國特色的X-STR基因座復(fù)合擴增試劑盒，可用于親子鑒定、個體識別、性別鑒定、X連鎖遺傳病的基因定位，特別是用于產(chǎn)前診斷和姐妹認親、同父異母的半姐妹認親、隔代認親等親緣鑒定；7.本發(fā)明的X-STR基因座熒光標記復(fù)合擴增體系可以為伴X連鎖遺傳病、X染色體單親二倍體、X染色體失活的親源性鑒定等提供產(chǎn)前診斷方法，也為解決僅靠常染色體STR、Y-STR難以排除或認定親緣關(guān)系的某些特殊檢案(姐妹認親、同父異母的半同胞姐妹認親、隔代認親等)的親緣鑒定提供新的鑒定方法，具有廣泛的應(yīng)用前景。圖1為實施例中祖母樣本的14個X-STR基因座復(fù)合擴增圖譜；圖2為實施例中孫女樣本的14個X-STR基因座復(fù)合擴增圖譜。具體實施例方式實施例1應(yīng)用含有14個基因座的X-STR基因座熒光標記復(fù)合擴增體系進行姐妹認定和祖母與孫女的鑒定。原理X染色體是人類性染色體，X-STR是性染色體上一類多態(tài)性遺傳標記，男性的X-STR以單倍型形式存在只能從其母親中得到，且只能遺傳給女兒，因此同父所生的姐妹在X-STR基因座上有l(wèi)個相同的等位基因。如果可疑姐妹樣本中所有X-STR基因座中有1個相同的等位基因，則不能排除其來自同一父親，如果有3個以上的X-STR基因座中無相同等位基因，則可以排除其來自同一父親。同樣孫女X-STR基因座有1個等位基因與其祖母相同，故可疑奶奶與孫女樣本中所有X-STR基因座中有1個相同的等位基因，則不能排除她們的親緣關(guān)系，如果有3個以上的X-STR基因座中無相同等位基因，則可以排除她們的親緣關(guān)系。操作步驟l.DNA提取Chelex-100法剪取4X4mm的血痕或唾液斑，加200ii110%Chelex-100，56。C烤箱過夜，置于PCR儀中IO(TC10min，振蕩30sec，10000r/min離心2min，4。C保存?zhèn)溆谩?.PCR擴增PCR擴增反應(yīng)總體系為25iil:PCR反應(yīng)緩沖液(Buffer)5.0iU，引物混合物(PrimerPairMix)5.0ii1，金牌DNA聚合酶(AmpliTaqGold)0.3ii1，模板DNA2.0iil，消毒純凈水12.7iU。上述PCR緩沖液的配方為dNTP200iimol/L，MgCl21.5mmol/L，1XBuffer。上述引物混合物中，各個基因座的引物序列及其熒光標記如表1所示。表l14個X-STR基因座引物序列和熒光標記基因座引物序列熒光標記DXS7133F，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示麗R，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示DXS6801F，其核苷酸序列如SEQIDN0:3所示麗R，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示DXS981F，其核苷酸序列如SEQIDN0:5所示麗R，其核苷酸序列如SEQIDN0:6所示DXS6809F，其核苷酸序列如SEQIDN0:7所示麗R，其核苷酸序列如SEQIDN0:8所示DXS7424F，其核苷酸序列如SEQIDN0:9所示HEXR，其核苷酸序列如SEQIDNO:IO所示DXS6789F，其核苷酸序列如SEQIDNO:11所示HEXR，其核苷酸序列如SEQIDN0:12所示DXS9898F，其核苷酸序列如SEQIDN0:13所示HEX7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>把注射器、毛細管、Buffer糟等拆下，用純水清洗，晾干，灌膠注射器里注入相當體積的P0P-4膠，排出空氣。Buffer糟里盛lXBuffer溶液。雙擊Run3100DataCollectionVersion2.0軟件一點擊菜單欄中的Wizards—點擊FillCapillarywizards,對毛細管注膠一毛細管定位和樣品編輯。3)樣品準備GeneScan1M-500LIZ1Msizestandard0.25^1n}x樣品數(shù)去離子甲酰胺9.75(il混勻后瞬時離心，每管加10.0iil混合物，再加PCR產(chǎn)物1.0ia，瞬時離心。95t:變性4min，放置冰盒中冷卻3min，取10.0變性后的樣品轉(zhuǎn)移至96孔樣品板，裝載入3100遺傳分析儀進行電泳。4)電泳條件:14.7kV，130iiA，14.8mW。5)結(jié)果分析用GeneM即perlDv3.1軟件進行基因分型。分析結(jié)果如圖1和2所示，從圖中可以看出孫女樣本14個X-STR基因座的分型均有1個等位基因與爭議祖母相同，故支持爭議祖母與女孩存在祖母與孫女關(guān)系。具體案例案情2009年12月，某女士帶1個小女孩進行鑒定，檢點是否為她的孫女。具體鑒定過程采用前述的操作步驟DNA提取——PCR擴增——PCR擴增產(chǎn)物電泳——結(jié)果分析。結(jié)果解析如圖1和2所示，從圖可知，爭議祖母與女孩樣本DXS7133、DXS6801、DXS981、DXS6809、DXS7424、DXS6789、DXS9898、DXS7132、GATA165B12、DXSIOI、DXS10075、GATA31E08、DXS10074和DXS1007914個X-STR基因座的分型均有1個相同等位基因。即孫女樣本14個X-STR基因座的分型結(jié)果均有1個等位基因能從爭議祖母中找到，且14個基因座(DXS7133/DXS6801/DXS981/DXS6809/DXS7424/DXS6789/DXS9898/DXS7132/GATA165B12/DXS101/DXS10075/GATA31E08/DXS10074/DXS10079)的單倍型9/11/13/36/15/15/12/14/10/23/17/10/16/18或9/11/13/36/15/19/12/14/10/23/17/10/16/18尚未見報道，在本實驗室檢測500個無關(guān)個體仍未出現(xiàn)，故其頻率小于0.2X，LR值〉500。支持爭議祖母與女孩存在祖母與孫女關(guān)系。9權(quán)利要求一種X-STR基因座熒光標記復(fù)合擴增體系，該復(fù)合擴增體系共包含14個基因座DXS7133、DXS6801、DXS981、DXS6809、DXS7424、DXS6789、DXS9898、DXS7132、GATA165B12、DXS101、DXS10075、GATA31E08、DXS10074和DXS10079。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述X-STR基因座熒光標記復(fù)合擴增體系，其特征在于所述14個基因座是在一個復(fù)合擴增體系中同時擴增。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述X-STR基因座熒光標記復(fù)合擴增體系，其特征在于所述14個基因座引物分別用FAM、HEX、TAM或ROX四種熒光素標記。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述X-STR基因座熒光標記復(fù)合擴增體系，其特征在于所述復(fù)合擴增體系中，F(xiàn)AM熒光素標記DXS7133、DXS6801、DXS981和DXS6809，HEX熒光素標記DXS7424、DXS6789、DXS9898和DXS7132，TAMRA熒光素標記DXS165B12、DXS101和DXS10075，ROX熒光素標記GATA31E08、DXS10074和DXS10079。5.權(quán)利要求14所述的任一X-STR基因座熒光標記復(fù)合擴增體系在認定特殊的親緣關(guān)系檢案中的應(yīng)用。6.權(quán)利要求14所述的任一X-STR基因座熒光標記復(fù)合擴增體系在作為檢測試劑對X染色體相關(guān)性遺傳病進行產(chǎn)前診斷中應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開一種X-STR基因座熒光標記復(fù)合擴增體系及其應(yīng)用，該復(fù)合擴增體系共包含14個基因座DXS7133、DXS6801、DXS981、DXS6809、DXS7424、DXS6789、DXS9898、DXS7132、GATA165B12、DXS101、DXS10075、GATA31E08、DXS10074和DXS10079。本發(fā)明的14個X-STR基因座是在一個復(fù)合擴增體系中同時擴增，快速、方便，PCR產(chǎn)物經(jīng)遺傳分析儀電泳，結(jié)果自動分析，能標準化、國際化，保證不同實驗室數(shù)據(jù)比較的正確性。文檔編號G01N21/64GK101787396SQ20101013637公開日2010年7月28日申請日期2010年3月26日優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日發(fā)明者劉秋玲,呂德堅,趙虎申請人:中山大學(xué)