一種制備動物轉基因陽性單細胞克隆的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備動物轉基因陽性單細胞克隆的方法，步驟為：（1）構建包括目的基因、熒光標記基因和藥物篩選標記基因的質粒；（2）質粒轉染已培養(yǎng)至對數生長期的宿主動物細胞；（3）經轉染的細胞生長恢復后，進行消化、離心和重懸稀釋，再置于熒光顯微鏡下，用內徑20~80μm的吸針吸取表達熒光標記基因的單個細胞，分別接種至不同份的細胞培養(yǎng)基中；（4）各單個細胞生長成克隆團后，消化其中穩(wěn)定表達熒光標記基因的細胞克隆團進行傳代擴增，即得到轉基因陽性單細胞的克隆。該方法轉基因陽性單個細胞分離和接種技術操作簡單快速、克隆形成率高，大大簡化了不同轉基因動物個體的檢測鑒定工作，降低檢測成本，省時省力。
【專利說明】一種制備動物轉基因陽性單細胞克隆的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及動物轉基因方法【技術領域】，具體涉及一種快速可行的制備動物轉基因陽性單細胞克隆的方法。
【背景技術】
[0002]近年來發(fā)展迅速的動物轉基因和動物體細胞克隆兩項技術對生物、農業(yè)和醫(yī)學等諸領域的基礎研究和應用已產生了變革性的影響。已開發(fā)用于動物轉基因的方法多種多樣，其中包括顯微注射法、精子載體法、逆轉錄病毒介導技術等。目前，在生產轉基因大家畜研究中應用較多的是更為高效安全的轉基因細胞核移植法。該方法是將外源基因轉移至體外培養(yǎng)的細胞中，大片段外源基因的細胞轉染效率通常較低，需要利用熒光標記和新霉素(neomycin, neo)等藥物標記來篩選并擴增基因組內整合了外源目標基因的細胞。之后利用這種轉基因陽性克隆細胞進行體細胞核移植獲得的克隆動物全部為轉基因動物。
[0003]轉基因細胞系的獲得是轉基因細胞核移植技術的難點之一。目前國內外的動物轉基因細胞系篩選的通用方法是在基因轉染后進行兩周左右的藥物篩選，未整合外源基因的絕大部分細胞由于缺乏抗性標記基因而死亡。繼續(xù)使用濃度減半的藥物維持篩選和培養(yǎng)，之后刮除不表達熒光的耐藥性非轉基因細胞，用克隆環(huán)局部消化轉基因陽性細胞克隆并擴增培養(yǎng)。由此方法獲得的單克隆細胞不一定是由單個細胞分裂增殖形成的，而很大可能是由相近位置的兩個或很多個轉染時整合了目標基因的不同細胞增殖而來的。外源基因隨機整合入細胞基因組內時，不同細胞內的外源基因的插入位點不一樣，由這種單克隆細胞核移植后出生的不同轉基因動物個體的外源基因整合在染色體上的位置和對自身其他基因表達的影響，目標基因 的表達水平及遺傳效應都可能不一樣。因此轉基因動物的目標基因的整合、表達鑒定、生物安全和篩選高表達優(yōu)良性狀個體的工作很繁重，檢測耗費成本很聞。
[0004]通過轉基因單細胞克隆方法才能獲得生物學性狀均一和外源基因表達模式一致的細胞群體。采用單細胞克隆核移植能大大簡化所獲得轉基因動物的檢測鑒定工作。目前，細胞轉染效率較低和藥物篩選后細胞克隆形成能力降低是難于獲得轉基因單細胞克隆的主要障礙。轉基因單細胞克隆的制備通常采用有限稀釋法。它是一種適用于一般細胞培養(yǎng)中的細胞純化技術，其主要方案是計算細胞濃度后稀釋細胞，使細胞濃度達到0.01個/μ L，將細胞接種至96孔板中，每孔100 μ L，理論上來說有些孔內有且只有一個細胞，這樣增殖分裂下去就能獲得單細胞克隆。
[0005]目前，運用電穿孔或脂質體轉染等方法介導外源基因轉移入細胞的效率仍然很低，特別是超過IOkb的大片段外源基因整合效率大多低于5%。利用有限稀釋法接種轉染后的細胞至96孔板中，雖然操作簡單，對細胞的物理損害小，但此方法不能保證每孔都為單個細胞，且能從混雜細胞中挑選出轉基因陽性單細胞的概率非常小。G418是一種氨基糖苷類抗生素，對原核和真核等細胞都有毒性，是穩(wěn)定轉染最常用的篩選藥物。當外源新霉素抗性基因neo被整合入真核細胞基因組后，如果能啟動其編碼的序列轉錄并高效表達G418抗性產物氨基糖苷磷酸轉移酶，則能使細胞在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長。若細胞經過長期的藥物篩選去除大部分非轉基因細胞后再用有限稀釋法進行單克隆化培養(yǎng)，由于非轉基因細胞易出現耐藥性克隆團，以及G418篩選對轉基因陽性細胞的毒性較大等現象同樣會影響稀釋法獲得的目標單細胞數量比例和單細胞的克隆形成能力。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的在于解決現有技術中的上述問題，提供一種快速高效制備動物轉基因陽性單細胞克隆的方法。
[0007]本發(fā)明提供的制備方法，步驟如下:
(1)構建包括目的基因、突光標記基因和藥物篩選標記基因的質粒；
(2)步驟(1)獲得的質粒轉染已培養(yǎng)至對數生長期的宿主動物細胞；
(3)質粒轉染后的宿主動物細胞經過生長恢復后，進行消化、離心和重懸稀釋，再置于熒光顯微鏡下，用內徑20-80 μ m的吸針吸取表達熒光標記基因的單個細胞，分別接種至不同份的細胞培養(yǎng)基中；
(4)各單個細胞 生長成克隆團后，消化其中穩(wěn)定表達熒光標記基因的細胞克隆團進行傳代擴增，即得到轉基因陽性單細胞的克隆。
[0008]優(yōu)選地，步驟(3)所述吸針為玻璃吸針，其制備方法包括:用無菌玻璃管在使其軟化的溫度下拉制成內徑20-80 μ m的吸針，吸針口燒至平滑，另一端連接橡膠吸頭。
[0009]優(yōu)選地，步驟(3)所述細胞培養(yǎng)基由40%~65%體積濃度的DMEM、15%~20%體積濃度的胎牛血清、20%~40%體積濃度的條件培養(yǎng)基、促進細胞增殖的生長因子和維持陽性轉基因細胞生長的劑量的篩選藥物組成；
所述條件培養(yǎng)基為F2>6代宿主動物細胞生長至匯合度為60%~90%時，更換成不含血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12~24小時，收集培養(yǎng)液后離心棄沉淀并過濾獲得。
[0010]該優(yōu)選方案中，所述的促進細胞增殖的生長因子常用的包括堿性成纖維細胞生長因子bFGF，表皮生長因子EGF，血管內皮細胞生長因子VEGF。所述的篩選藥物常用的包括G418和嘌呤霉素。
[0011]優(yōu)選地，步驟(1)所述的熒光標記基因為綠色熒光蛋白基因。
[0012]優(yōu)選地，步驟(1)所述宿主動物細胞為豬胎兒成纖維細胞。
[0013]優(yōu)選地，步驟(1)所述質粒為真核表達質粒，步驟(2)所述轉染為穩(wěn)定轉染。穩(wěn)定轉染指外源基因整合入宿主動物細胞的染色體中。
[0014]與現有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
通過本發(fā)明的方法能獲得表觀遺傳效應和基因表達模式一致的細胞群體。采用單細胞克隆核移植出生的正常轉基因動物的遺傳性能相似，外源基因整合和表達模式一致，能大大簡化數量繁多的不同轉基因動物個體的檢測鑒定工作，降低檢測成本，省時省力。
[0015]本發(fā)明公布的轉基因陽性單個細胞分離和接種技術操作簡單快速、準確性高、克隆形成率高。其中利用吸針吸取單個細胞，在操作上雖存在一定的難度，但實驗熟練后準確度高、速度快，并且對細胞的物理損害也很小，能夠替代有限稀釋法分離接種單細胞，并能大大提高獲得單個轉基因陽性細胞的概率。另外，本發(fā)明提供的能有效維持轉基因單細胞生長增殖的特殊培養(yǎng)基，培養(yǎng)的單細胞克隆形成效率超過20%，轉基因陽性單細胞克隆形成的比例約2%~5%。這相對于普通培養(yǎng)體系下的單細胞克隆形成效率也有顯著提高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是質粒pEGFP-Nl的圖譜；
圖2是質粒pcDNA-neo-t2a-EGFP的圖譜；
圖3是線性化質粒pEGFP-Nl穩(wěn)定轉染豬胎兒成纖維細胞后48小時的拍照結果，其中A為白光下，B為藍色激發(fā)光下；
圖4是線性化質粒pEGFP-Nl穩(wěn)定轉染豬胎兒成纖維細胞后，接種單細胞的96孔板的一個孔中整合并表達EGFP基因的細胞克隆拍照結果，其中A為白光下，B為藍色激發(fā)光下；圖5是線性化質粒pcDNA-ne0-t2a-EGFP穩(wěn)定轉染豬腎細胞后48小時的時拍照結果，其中A為白光下，B為藍色激發(fā)光下；
圖6是線性化質粒pcDNA-ne0-t2a-EGFP穩(wěn)定轉染豬腎細胞后，接種單細胞的96孔板的一個孔中整合并表達EGFP基因的細胞克隆拍照結果，其中A為白光下，B為藍色激發(fā)光下。
【具體實施方式】
[0017]下面結合具體實施例進一步對本發(fā)明進行解釋，以使本領域技術人員能更好地理解本發(fā)明并能予以實施，但實施例并不作為對本發(fā)明的限定。實施例中使用的各生物材料僅是作為說明本發(fā)明方法 的示范載體和細胞系，其來源不會對本發(fā)明的方法實施造成影響，更換成其他同類材料也同樣能夠實現本發(fā)明目的。質粒構建方法現有技術已經公開，且不是本發(fā)明的創(chuàng)新部分所在，因此以下實施例中直接使用的構建好的質粒進行舉例說明本發(fā)明的技術方案。
[0018]以下實施例中用到的生物材料如下:
pEGFP-Nl質粒購自Takara公司；pcDNA-neo-t2a_EGFP質粒由華南農業(yè)大學動物科學學院遺傳育種系的博士生張獻偉贈送；豬胎兒成纖維細胞和豬腎細胞采自廣東華農溫氏畜牧股份有限公司車崗豬場。
[0019]實施例1
以獲得穩(wěn)定轉染pEGFP-Nl質粒的轉基因陽性豬胎兒成纖維細胞系為例，pEGFP-Nl質粒內含有熒光報告基因EGFP和藥物標記neo (如圖1)。用限制性內切酶DraIII單酶切PEGFP-Nl質粒后，用DNA純化回收試劑盒回收線性化的質粒，之后轉染入豬胎兒成纖維細胞。48小時后消化細胞，用熒光顯微鏡下找出發(fā)綠色熒光的細胞，再用玻璃吸針每次準確吸取一個發(fā)熒光的細胞接種至96孔細胞培養(yǎng)板中。在培養(yǎng)基中添加生長因子bFGF和實驗中收集的條件培養(yǎng)基，單個細胞存活和克隆形成率超過20%，96孔板中最終形成轉基因陽性克隆的孔的比例約2%~5%。
[0020]具體試驗方法如下:
1.豬胎兒成纖維細胞的分離培養(yǎng)
使用藥物流產獲得日齡約30天的豬胎兒，無菌條件下用眼科剪剪開羊膜，剪去頭、尾、器官和四肢，剩余組織剪碎成Imm3的小塊。然后轉移到細胞培養(yǎng)皿內，加入培養(yǎng)基(DMEM中添加體積濃度10%的胎牛血清，Gibco品牌)，放入39°C，5%C02和飽和濕度的培養(yǎng)箱中。細胞長至90%匯合時進行傳代培養(yǎng)和凍存。細胞傳代的步驟為:吸除培養(yǎng)液，用PBS洗一遍后胰蛋白酶消化至細胞變圓，用培養(yǎng)基終止消化后離心，按1:3或1:4比例接種培養(yǎng)?；蜣D染用F3至F5代的生長增殖旺盛的細胞即可。
[0021]2.豬胎兒成纖維細胞對藥物G418的耐受性檢測
將豬胎兒成纖維細胞接種到6孔板，細胞匯合度為60%~70%時，在6個孔中分別加入含 100 μ g/mL、200 μ g/mL、400 μ g/mL、600 μ g/mL、800 μ g/mL> 1000 μ g/mL G418 的培養(yǎng)基，另外接種一皿細胞以無G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)作為對照。培養(yǎng)兩周，隔兩天換液時補加相同濃度的G418。實驗結果表明:G418濃度為100 μ g/mL時，兩周后細胞生長正常；G418濃度為200 μ g/mL時，兩周后活細胞剩余約30% ；G418濃度為400 μ g/mL時，兩周后細胞全部死亡；G418濃度為600 μ g/mL時，第12d后細胞全部死亡；G418濃度為800 μ g/mL時，第9d后細胞全部死亡；G418濃度為1000 μ g/mL時，第6d后細胞全部死亡。選擇在兩周內細胞全部死亡的最低G418濃度400 μ g/mL為轉基因陽性細胞的篩選濃度。而該濃度減半為200 μ g/mL的篩選壓力為維持轉基因陽性細胞生長的藥物濃度。
[0022]3.制作吸取單個細胞的工具
用高壓無菌的規(guī)格為2.5X2.0X IOOmm的細玻璃管的中間部分在酒精燈火焰下加熱變軟后往外拉長后截斷成兩根內徑約為20-80μπι的吸針，在微火焰下燒斷口處至平滑。把ImL注射器的針筒帽截斷后一端裝上合適大小的橡膠吸頭，另一端內套入一小截空心的膠塞，把玻璃吸針的寬管口端套入膠塞中，即制備出一個可以吸取單細胞的吸針工具。吸針進行紫外消毒備用。
[0023]4.基因轉染
用限制性內切酶DraIII酶切pEGFP-Nl質粒后，用DNA純化回收試劑盒回收線性化質粒，調節(jié)線狀質粒濃度至500-?000η8/μ L，在-20°C下保存?zhèn)溆?。用此質粒轉染豬胎兒成纖維細胞，轉染方法為BTX電轉儀轉染。電轉參數設置為180V-15ms-l。轉染后隔天更換培養(yǎng)基去除死細胞，培養(yǎng)基為含有體積濃度10%的胎牛血清的DMEM。
[0024]5.制備培養(yǎng)單細胞克隆的特殊培養(yǎng)基
單個細胞由于缺乏細胞信號連接和旁分泌功能等因素造成細胞增殖能力變弱，易出現老化和死亡。本發(fā)明設計了有利于克隆形成的培養(yǎng)體系(細胞培養(yǎng)基)，能有效維持單細胞的正常分裂增殖。本實施例中在單細胞的DMEM基礎培養(yǎng)體系中提高胎牛血清含量至15%~20%，加入濃度0.002 μ g/mL~0.008 μ g/mL的堿性成纖維細胞生長因子bFGF，200 μ g/mL的G418，并添加20%~40%體積的條件培養(yǎng)基，該條件培養(yǎng)基的收集方法如下:用IOOmm的培養(yǎng)皿培養(yǎng)F2>6代豬胎兒成纖維細胞，細胞生長至匯合度約60%~90%時，吸棄培養(yǎng)液，加入5mL~10mL的DMEM后置于培養(yǎng)箱內，12~24小時后收集皿里的培養(yǎng)液并離心，上清液過濾后分裝凍存于_20°C備用。
[0025]6.挑選轉基因陽性單細胞并接種
細胞轉染后48小時，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光(如圖3)，初步判斷轉染效率。用
0.05%胰蛋白酶消化細胞后離心，用培養(yǎng)基重懸細胞，再置于熒光顯微鏡下觀察。在藍色激發(fā)光下找到發(fā)綠色熒光的細胞，同時打開明場光源確定其準確位置，觀察的同時用已制作好的玻璃吸針準確吸取單個有熒光的細胞，并接種至裝有細胞培養(yǎng)基的96孔板中。
[0026]7.培養(yǎng)并鑒定單細胞克隆接種了單細胞的96孔板需每隔4至5天更換細胞培養(yǎng)基。12天后可發(fā)現部分孔內已長出較大的克隆團。有部分細胞克隆團沒有表達熒光，原因之一是這類外源基因插入后未整合入宿主細胞的基因組，只能在細胞質內發(fā)生瞬時表達，而不能在細胞分裂增殖過程中穩(wěn)定遺傳。原因之二是該質粒片段屬于隨機整合類型，各單細胞克隆團之間表達目的基因的量有很大差異。本發(fā)明中設計的G418濃度200 μ g/mL的培養(yǎng)基能維持轉基因陽性細胞生長，這一篩選壓力能一定程度上阻遏不表達熒光的細胞克隆團生長。觀察每個克隆團是否發(fā)綠色熒光，以及綠色熒光的表達強度。由此即可篩選獲得理想的轉基因陽性單細胞克隆(如圖4)。
[0027]實施例2
以獲得穩(wěn)定轉染pcDNA-neo-t2a-EGFP質粒的轉基因陽性豬腎細胞系為例，pcDNA-neo-t2a-EGFP質粒是在invitrogen公司的pcDNA3.1 (+)質粒的多克隆位點插入neo-t2a_EGFP融合基因片段,t2a是來自昆蟲的Thosea asigna病毒的2a連接多肽(如圖2)。將此載體穩(wěn)定轉染豬腎細胞系PK15，已驗證在24小時后能觀察到熒光，且可用G418進行篩選。用限制性內切酶PvuI酶切pcDNA-ne0-t2a-EGFP質粒后回收線性化的質粒，之后轉染入豬腎細胞。48小時后消化細胞，用熒光顯微鏡下找出發(fā)綠色熒光的細胞，再用玻璃吸針每次準確吸取一個發(fā)熒光的細胞接種至96孔細胞培養(yǎng)板中。在培養(yǎng)基中添加表皮生長因子EGF和實驗中收集的條件培養(yǎng)基，單個細胞存活和克隆形成率超過20%, 96孔板中最終形成轉基因陽性克隆的孔的比例約2%~5%。[0028]具體試驗方法如下:
1.豬腎細胞的分離培養(yǎng)
取約Icm3的豬腎組織，用酒精消毒后浸泡于DPBS中。無菌條件下用鑷子和剪刀剝去腎表皮膜，將腎組織切成約Imm3的小塊，加入0.25%胰蛋白酶于37°C消化4小時以上，待組織變成粘稠液狀，混勻后過100 μ m的細胞篩。收集過濾后的液體，離心棄上清液后加入培養(yǎng)基(DMEM中添加體積濃度10%的胎牛血清)重懸細胞并接種至培養(yǎng)皿中，再放入37°C，5%C02和飽和濕度的培養(yǎng)箱中。隔天換液，細胞長至90%匯合進行傳代培養(yǎng)和凍存。
[0029]2.豬腎細胞對藥物G418的耐受性檢測
將豬腎細胞接種到6孔板，細胞匯合度為60%~70%時，在6個孔中分別加入含100μ g/mL、200 μ g/mL、400 μ g/mL、600 μ g/mL、800 μ g/mL> 1000 μ g/mL G418 的培養(yǎng)基，另外接種一皿細胞以無G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)作為對照。培養(yǎng)兩周，隔兩天換液時補加相同濃度的G418。實驗結果表明:G418濃度100 μ g/mL時，兩周后細胞生長正常；G418濃度為200 μ g/mL時，細胞在兩周后剩余約40% ；G418濃度為400 μ g/mL時，細胞在兩周后剩余約20% ；G418濃度為600 μ g/mL時，細胞在兩周后全部死亡；G418濃度為800 μ g/mL時，細胞第IOd后全部死亡；G418濃度為1000 μ g/mL時，細胞培養(yǎng)第8d后全部死亡。選擇在兩周內細胞全部死亡的最低G418濃度600 μ g/mL為轉基因陽性細胞的篩選濃度。而該濃度減半為300 μ g/mL的篩選壓力為維持轉基因陽性細胞生長的藥物濃度。
[0030]3.制作吸取單個細胞的工具
用高壓無菌的規(guī)格為2.5X2.0X IOOmm的細玻璃管在酒精燈火焰下加熱變軟后往外拉長后截斷成兩根內徑約為20-80 μ m的吸針，在微火焰下燒斷口處至平滑。把ImL注射器的針筒帽截斷后一端裝上合適大小的橡膠吸頭，另一端內套入一小截空心的膠塞，把玻璃吸針的寬管口端套入膠塞中，即制備出一個可以吸取單細胞的吸針工具。吸針進行紫外消
毒備用。
[0031]4.基因轉染
用限制性內切酶PvuI酶切pcDNA-ne0-t2a-EGFP質粒后，用DNA純化回收試劑盒回收線性化質粒，調節(jié)線狀質粒濃度至50(ri000ng/l.! L，在-20°C下保存?zhèn)溆谩Ｓ么速|粒轉染豬腎細胞，方法為Lipofectamine ? LTX with PLUS ?轉染試劑(invitrogen品牌)轉染。轉染后隔天更換培養(yǎng)基去除死細胞，培養(yǎng)基為含有體積濃度10%的胎牛血清的DMEM。
[0032]5.制備培養(yǎng)單細胞克隆的特殊培養(yǎng)基
本實施例中在單細胞的DMEM基礎培養(yǎng)體系中提高血清含量至15%~20%，加入20%~40%體積的條件培養(yǎng)基，并加入有利于豬腎細胞增殖的濃度為0.002 μ g/mL^0.008 μ g/mL的表皮生長因子EGF以及300 μ g/mL維持劑量的藥物G418，其中的條件培養(yǎng)基收集方法如下:用IOOmm的培養(yǎng)皿培養(yǎng)F2卞6代豬腎細胞，細胞生長至匯合度約60%~90%時，吸棄培養(yǎng)液，加入5mL~10mL的DMEM后置于培養(yǎng)箱內，12~24小時后收集皿里的培養(yǎng)液并離心，上清液過濾后分裝凍存于_20°C備用。
[0033]6.挑選轉基因陽性單細胞并接種
細胞轉染后48小時，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光(如圖5)，初步判斷轉染效率。用
0.25%胰蛋白酶消化細胞后離心，用培養(yǎng)基重懸細胞，再置于熒光顯微鏡下觀察。在藍色激發(fā)光下找到發(fā)綠色熒光的細胞，同時打開明場光源確定其準確位置，觀察的同時用已制作好的玻璃吸針準確吸取單個有熒光的細胞，并接種至裝有細胞培養(yǎng)基的96孔板中。
[0034]7.培養(yǎng)并鑒定單細胞克隆
接種了單細胞的96孔板需每隔4至5天更換培養(yǎng)基。12天后可發(fā)現部分孔內已長出較大的克隆團。觀察每個克隆團是否發(fā)綠色熒光，以及綠色熒光的表達強度。本發(fā)明中設計的G418濃度300 μ g/mL的培養(yǎng)基能維持轉基因陽性細胞生長，這一篩選壓力能一定程度上阻遏不表達熒光的細胞克隆團生長。觀察每個克隆團是否發(fā)綠色熒光，以及綠色熒光的表達強度。由此即可篩選獲得理想的轉基因陽性單細胞克隆(如圖6)。
【權利要求】
1.一種制備動物轉基因陽性單細胞克隆的方法，其特征在于，步驟如下: (1)構建包括目的基因、突光標記基因和藥物篩選標記基因的質粒； (2)步驟(1)獲得的質粒轉染已培養(yǎng)至對數生長期的宿主動物細胞； (3)質粒轉染后的宿主動物細胞經過生長恢復后，進行消化、離心和重懸稀釋，再置于熒光顯微鏡下，用內徑20-80 μ m的吸針吸取表達熒光標記基因的單個細胞，分別接種至不同份的細胞培養(yǎng)基中； (4)各單個細胞生長成克隆團后，消化其中穩(wěn)定表達熒光標記基因的細胞克隆團進行傳代擴增，即得到轉基因陽性單細胞的克隆。
2.根據權利要求1所述的制備動物轉基因陽性單細胞克隆的方法，其特征在于，步驟(3)所述吸針為玻璃吸針，其制備方法包括:用無菌玻璃管在使其軟化的溫度下拉制成內徑20-80 μ m的吸針，吸針口燒至平滑，另一端連接橡膠吸頭。
3.根據權利要求1所述的制備動物轉基因陽性單細胞克隆的方法，其特征在于，步驟 (3)所述細胞培養(yǎng)基由40%~65%體積濃度的DMEM、159T20%體積濃度的胎牛血清、20%~40%體積濃度的條件培養(yǎng)基、促進細胞增殖的生長因子和維持陽性轉基因細胞生長的劑量的篩選藥物組成； 所述條件培養(yǎng)基為F2>6代宿主動物細胞生長至匯合度為60%~90%時，更換成不含血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12~24小時，收集培養(yǎng)液后離心棄沉淀并過濾獲得。
4.根據權利要求1~3任一所述的制備動物轉基因陽性單細胞克隆的方法，其特征在于，步驟(1)所述的熒光標記基因為綠色熒光蛋白基因。
5.根據權利要求1~3任一所述的制備動物轉基因陽性單細胞克隆的方法，其特征在于，步驟(1)所述宿主動物細胞為豬胎兒成纖維細胞。
6.根據權利要求1~3任一所述的制備動物轉基因陽性單細胞克隆的方法，其特征在于，步驟(1)所述質粒為真核表達質粒，步驟(2)所述轉染為穩(wěn)定轉染。
【文檔編號】C12N15/87GK103937746SQ201410097949
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年3月18日 優(yōu)先權日:2014年3月18日
【發(fā)明者】吳珍芳, 賀曉燕, 張獻偉, 李紫聰, 劉德武, 石俊松, 周榮 申請人:廣東溫氏食品集團股份有限公司