專利名稱：一種培育克隆動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種培育克隆動(dòng)物與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法。
背景技術(shù)：
哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆包括卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)、供體細(xì)胞培養(yǎng)、核移植操作、細(xì)胞融合、胚胎培養(yǎng)等步驟。在常規(guī)體細(xì)胞克隆時(shí)，受體卵母細(xì)胞是從卵巢表面抽得的卵丘卵母細(xì)胞，經(jīng)體外成熟培養(yǎng)20-2^1·(牛、羊等)、40-44hr(豬)后，脫除卵丘細(xì)胞。然后再選擇排出第一極體的卵，將其核物質(zhì)去除后，作為受體胞質(zhì)。這樣處理得到的卵母細(xì)胞，其第一極體很容易偏離卵的遺傳物質(zhì)，在以PBl為標(biāo)志的盲吸去核過(guò)程中，去核率降低。如果使用熒光染料并輔以紫外線照射法，易造成對(duì)卵的傷害，影響胚胎質(zhì)量。選擇形態(tài)良好的體細(xì)胞注入去核卵母細(xì)胞的卵周隙中，經(jīng)過(guò)電脈沖刺激使體細(xì)胞融入卵中，形成重構(gòu)胚。在這期間，融合胚不經(jīng)任何處理，只是移到胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)。然后，重構(gòu)胚再經(jīng)化學(xué)處理使其激活。激活方法是鈣離子激活劑結(jié)合蛋白合成抑制劑處理。把經(jīng)過(guò)激活處理的胚胎轉(zhuǎn)入胚胎培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。常規(guī)克隆操作的不足在于，重構(gòu)胚的染色體容易發(fā)生位置漂移、擴(kuò)散現(xiàn)象，造成胚胎非正常二倍體率增加，形成多個(gè)微核，影響胚胎發(fā)育與胚胎質(zhì)量。最終影響克隆效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種培育克隆動(dòng)物胚胎或轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物胚胎的方法。本發(fā)明提供的上述方法包括如下步驟1)獲得離體的去核卵母細(xì)胞，2)將離體的供體細(xì)胞與所述去核卵母細(xì)胞融合得到重構(gòu)胚，3)將所述重構(gòu)胚進(jìn)行體外激活，4)將激活的重構(gòu)胚進(jìn)行培養(yǎng)，其特征在于步驟 3)中，所述體外激活包括將所述重構(gòu)胚用鈣離子激活劑進(jìn)行2次以上的處理，然后將處理過(guò)的重構(gòu)胚在蛋白合成抑制劑或蛋白質(zhì)磷酸化抑制劑中激活，得到激活的重構(gòu)胚，將所述激活的重構(gòu)胚培養(yǎng)得到所述克隆動(dòng)物胚胎或轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物胚胎。在一實(shí)施例中，上述處理的次數(shù)為2次；所述處理包括如下步驟a)將所述重構(gòu)胚放置在所述鈣離子激活劑中5分鐘；再將所述重構(gòu)胚轉(zhuǎn)入胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)10-15分鐘；b)在步驟a)的基礎(chǔ)上，將所述重構(gòu)胚放置在所述鈣離子激活劑中5分鐘。在另一實(shí)施例中，上述處理的次數(shù)為3次；所述處理包括如下步驟a)將所述重構(gòu)胚放置在所述鈣離子激活劑中5分鐘；再將所述重構(gòu)胚轉(zhuǎn)入胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)10-15分鐘；b)在步驟a)的基礎(chǔ)上，將所述重構(gòu)胚放置在所述鈣離子激活劑中5分鐘；再將所述重構(gòu)胚轉(zhuǎn)入胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)10分鐘；c)在步驟b)的基礎(chǔ)上，將所述重構(gòu)胚放置在所述鈣離子激活劑中2分鐘。所述胚胎培養(yǎng)液是在CRlaa培養(yǎng)液或SOFaa培養(yǎng)液中添加BSA得到的培養(yǎng)液；所述BSA在所述胚胎培養(yǎng)液的終濃度是0. 4g/100ml ；所述培養(yǎng)條件是38. 5°C和5% CO2 ；所述 CRlaa培養(yǎng)液和SOFaa培養(yǎng)液的溶劑均為水，溶質(zhì)分別如表1和表2所示。表1. CRlaa培養(yǎng)液的溶質(zhì)
權(quán)利要求
1.一種培育克隆動(dòng)物胚胎或轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物胚胎的方法，包括如下步驟1)獲得離體的去核卵母細(xì)胞，2)將離體的供體細(xì)胞與所述去核卵母細(xì)胞融合得到重構(gòu)胚，3)將所述重構(gòu)胚進(jìn)行體外激活，4)將激活的重構(gòu)胚進(jìn)行培養(yǎng)，其特征在于步驟3) 中，所述體外激活包括將所述重構(gòu)胚用鈣離子激活劑進(jìn)行2次以上的處理，然后將處理過(guò)的重構(gòu)胚在蛋白合成抑制劑或蛋白質(zhì)磷酸化抑制劑中激活，得到激活的重構(gòu)胚，將所述激活的重構(gòu)胚培養(yǎng)得到所述克隆動(dòng)物胚胎或轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物胚胎。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述處理的次數(shù)為2次；所述處理包括如下步驟a)將所述重構(gòu)胚放置在所述鈣離子激活劑中5分鐘；再將所述重構(gòu)胚轉(zhuǎn)入胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)10-15分鐘；b)在步驟a)的基礎(chǔ)上，將所述重構(gòu)胚放置在所述鈣離子激活劑中5分鐘。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述處理的次數(shù)為3次；所述處理包括如下步驟a)將所述重構(gòu)胚放置在所述鈣離子激活劑中5分鐘；再將所述重構(gòu)胚轉(zhuǎn)入胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)10-15分鐘；b)在步驟a)的基礎(chǔ)上，將所述重構(gòu)胚放置在所述鈣離子激活劑中5分鐘；再將所述重構(gòu)胚轉(zhuǎn)入胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)10分鐘；c)在步驟b)的基礎(chǔ)上，將所述重構(gòu)胚放置在所述鈣離子激活劑中2分鐘。
4.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述胚胎培養(yǎng)液是在CRlaa培養(yǎng)液或SOFaa培養(yǎng)液中添加BSA得到的培養(yǎng)液；所述BSA在所述胚胎培養(yǎng)液的終濃度是 0. 4g/100ml ；所述培養(yǎng)條件是38. 5°C和5% CO2 ；所述CRlaa培養(yǎng)液和SOFaa培養(yǎng)液的溶劑均為水，溶質(zhì)分別如表1和表2所示。
5.如權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述鈣離子激活劑為離子霉素、鈣離子載體A23187、乙醇或氯化鍶；所述離子霉素存在于培養(yǎng)液一中；所述離子霉素在所述培養(yǎng)液一中的終濃度優(yōu)選是2. 0-5. 0 μ mol/L ；所述蛋白合成抑制劑是放線菌酮；所述蛋白質(zhì)磷酸化抑制劑是6-二甲氨基嘌呤；所述放線菌酮和所述6-二甲氨基嘌呤分別存在于培養(yǎng)液二和培養(yǎng)液三中，所述培養(yǎng)液一、培養(yǎng)液二、培養(yǎng)液三與權(quán)利要求2-4中任一所述的胚胎培養(yǎng)液均相同；所述放線菌酮在所述培養(yǎng)液二中的終濃度是優(yōu)選為10 μ g/mL ；所述6- 二甲氨基嘌呤在所述培養(yǎng)液三中的終濃度是優(yōu)選為1. 9-2. lmmol/L ；所述激活的時(shí)間為4_6小時(shí)。
6.如權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括步驟2)與步驟3) 之間的組蛋白去乙酰化酶抑制劑處理步驟，所述組蛋白去乙?；敢种苿┨幚戆ㄒ韵虏襟E將步驟幻中的所述重構(gòu)胚移入含組蛋白去乙酰化酶抑制劑的胚胎培養(yǎng)液中進(jìn)行激活前培養(yǎng)，所述激活前培養(yǎng)時(shí)間為1-6小時(shí)，優(yōu)選是2-3小時(shí)；所述含組蛋白去乙?；敢种苿┑呐咛ヅ囵B(yǎng)液優(yōu)選是在CRlaa培養(yǎng)液中添加BSA和組蛋白去乙酰化酶抑制劑得到的培養(yǎng)液；所述含組蛋白去乙酰化酶抑制劑的胚胎培養(yǎng)液中 BSA和組蛋白去乙?；敢种苿┑慕K濃度為如下①或②①BSA為0.3-0. 5g/100ml、組蛋白去乙?；敢种苿?. 0-10ng/ml ；②BSA為0.4g/100ml、組蛋白去乙?；敢种苿閘Ong/ml ；所述激活前培養(yǎng)的條件是38. 5°C和5% CO2 ；所述CRlaa培養(yǎng)液的溶劑是水，溶質(zhì)如表 1所示；所述組蛋白去乙酰化酶抑制劑優(yōu)選是曲古抑菌素A。
7.如權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述獲得去核卵母細(xì)胞包括如下三個(gè)步驟I)在離體的卵丘-卵母細(xì)胞-復(fù)合體體外成熟培養(yǎng)12-18小時(shí)時(shí)，去除卵丘細(xì)胞，得到去除卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞；II)將步驟I)得到的去除卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞繼續(xù)體外成熟培養(yǎng)，得到帶有第一極體的待去核的卵母細(xì)胞；III)將步驟II)獲得的待去核的卵母細(xì)胞進(jìn)行去核，得到去核卵母細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于步驟II)中，所述繼續(xù)體外成熟培養(yǎng)的時(shí)間為4-8小時(shí)；步驟I)和步驟II)中，所述體外成熟培養(yǎng)是在M199培養(yǎng)液中添加如下物質(zhì)得到的成熟液中培養(yǎng)的胎牛血清、丙酮酸鈉、卵泡刺激素，促黃體激素、雌二醇、青霉素和鏈霉素；其中，添加的物質(zhì)在所述成熟液中的終濃度分別為胎牛血清10% (體積百分比)、丙酮酸鈉0. 38mM/L、卵泡刺激素0. 01U/mL、促黃體激素0. 01U/mL和雌二醇1 μ g/mL、青霉素 50 μ g/mL 和鏈霉素 100 μ g/mL ；所述體外成熟培養(yǎng)的條件是38. 5°C,5% CO2和飽和濕度條件。
9.權(quán)利要求1-8中任一所述的方法在培育克隆動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求1-8中任一所述的方法或權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述動(dòng)物是牛、羊、豬或鼠。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種培育克隆動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物的方法。本發(fā)明還提供一種培育克隆動(dòng)物胚胎或轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物胚胎的方法。本發(fā)明提供的上述方法包括如下步驟1)獲得去核卵母細(xì)胞，2)將供體細(xì)胞與所述去核卵母細(xì)胞融合得到重構(gòu)胚，3)將所述重構(gòu)胚進(jìn)行體外激活，4)將激活的重構(gòu)胚進(jìn)行培養(yǎng)，其特征在于步驟3)中，所述體外激活包括將所述重構(gòu)胚用鈣離子激活劑進(jìn)行2次以上的處理，然后將處理過(guò)的重構(gòu)胚在蛋白合成抑制劑或蛋白質(zhì)磷酸化抑制劑中激活，得到重構(gòu)胚。實(shí)驗(yàn)證明采用以上技術(shù)方案后，克隆牛的7個(gè)月的妊娠率、發(fā)育到期率、出生后存活率分別為44％、33％和100％。
文檔編號(hào)A01K67/027GK102344941SQ20101024115
公開(kāi)日2012年2月8日 申請(qǐng)日期2010年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月29日
發(fā)明者李光鵬 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古大學(xué)