專利名稱：一種樣本中中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種樣本中中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的檢測方法。
背景技術(shù)：
中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(簡稱NGAL)是1993年在中性粒細(xì)胞內(nèi)首 先被發(fā)現(xiàn)的，與炎癥、胚胎發(fā)育、免疫應(yīng)答、趨化作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展 等過程相關(guān)。近年來國內(nèi)外的研究表明，NGAL蛋白在多種疾發(fā)過程中具有特異性表達(dá)變化 的特點，使得NGAL成為檢測疾病的生物標(biāo)志物。在發(fā)生缺血性和毒性腎損傷過程中，腎小管上皮細(xì)胞中的NGAL將顯著增加，在開 始的兩個小時內(nèi)，尿液和血液中NGAL水平將顯著增加，因此NGAL是早期急性腎損傷的敏感 標(biāo)志物。急性腎功能損傷預(yù)后將發(fā)展成為急性腎功能衰竭。通用的診斷方法如測定血清肌 酐或者半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(Cystatin C)，只能在損傷后一天甚者幾天內(nèi)檢測。有研 究表明，健康志愿者尿液中NGAL含量檢測結(jié)果分布0. 7-9. 6ng/ml，平均值為5. 3ng/mL·而 血漿中的含量檢測結(jié)果為37-106ng/ml，平均值為63ng/ml。當(dāng)腎損傷后，隨機(jī)檢測重病患 者，尿液NGAL的濃度為llOng/ml到40000ng/ml不等。而他們EDTA抗凝血漿檢測結(jié)果為 25ng/ml到3491ng/ml。根據(jù)急性腎衰竭患者檢測的90%陽性預(yù)測值判斷，尿液中NGAL的 陽性判斷值為350ng/ml，而血漿檢測的陽性判斷值為400ng/ml。同源性分析表明，NGAL與小鼠的Mp3和大鼠的neu相關(guān)lipocalin(neu-related lipocalin, NRL)具有很高的同源性。小鼠的Mp3在肝臟中合成，炎癥反應(yīng)時上調(diào)，另外 24p3也見于巨噬細(xì)胞和子宮內(nèi)膜，尤其是生殖期的子宮內(nèi)膜。用類固醇激素可使相應(yīng)組織 中的Mp3水平升高，而一些生長因子和腫瘤促進(jìn)因子也可以使其升高。猴毒SV40、多瘤毒 或其他毒感染可以刺激培養(yǎng)的小鼠腎細(xì)胞Mp3mRNA的表達(dá)增加7_10倍。且隨著大T抗原 的合成的增加而升高。因此Mp3被認(rèn)為是癌基因產(chǎn)物。這同時表明NGAL可能是人類的一 種新的癌基因。實驗證明，在卵巢癌細(xì)胞系、結(jié)腸腫瘤和乳腺癌等中的NGAL的表達(dá)明顯增強(qiáng)。免 疫組化證明在肺癌組織中的NGAL強(qiáng)陽性，而支氣管肺泡細(xì)胞癌和粘液細(xì)胞癌染色最強(qiáng)， NGAL在胰腺癌中會從陰性增加到強(qiáng)陽性。綜上所述，建立針對樣本中NGAL的快速檢測方法為該蛋白的研究將會提供一個 強(qiáng)有力的工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了檢測樣本中NGAL的方法所述方法包含以下步驟i)使用相關(guān)器械收集樣本包括人的血清、血漿和尿液， )樣本與抗體接觸反應(yīng)，
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iii)檢測樣本中NGAL的濃度。優(yōu)選通過免疫化學(xué)方法來測定NGAL水平，這種方法的例子包括但絕不限于免疫 比濁法、夾心法ELISA、競爭法ELISA。對生物樣本，可以用任何提供滿意的分析特異性、靈敏度和精確度的方法來進(jìn)行。 檢測實驗中，使用NGAL的單克隆、多克隆抗體或任何可與NGAL特異性結(jié)合的分子。結(jié)合 分子首先固相化捕捉樣品中的NGAL形成復(fù)合物，而另外一個標(biāo)記可檢測的結(jié)合分子再結(jié) 合上述復(fù)合物，最后通過特定方法顯示出復(fù)合物量的值從而間接反應(yīng)出樣品中NGAL的含 量。另外可以直接利用游離的NGAL抗體或偶聯(lián)乳膠顆粒以膠體形式存在的抗體與樣品中 的NGAL直接結(jié)合所形成的復(fù)合物引起濁度變化；用光投射強(qiáng)度或光散射強(qiáng)度表征這種變 化；從人NGAL標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與相應(yīng)光散射強(qiáng)度或光透射強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線查出待檢標(biāo)本的 人NGAL的含量；


圖1是夾心法ELISA檢測重組人NGAL標(biāo)準(zhǔn)曲線圖； 圖2是競爭法ELISA檢測重組人NGAL標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測人尿液中的NGAL含量實現(xiàn)本實例的技術(shù)方案一種檢測人NGAL的免疫比濁法，用抗NGAL的多克隆抗 體首先與乳膠交聯(lián)，然后用交聯(lián)后的乳膠溶液與待檢標(biāo)本的NGAL反應(yīng)，所形成的復(fù)合物引 起濁度變化；用光投射強(qiáng)度或光散射強(qiáng)度表征這種變化；從NGAL標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與相應(yīng)光散 射強(qiáng)度或光投射強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線查出待檢樣本的NGAL含量；其中所用的NGAL的多克隆抗 體效價至少為1 500，不含雜抗體，具有識別NGAL多種抗原決定簇；待檢標(biāo)本用稀釋劑做 1 200-1 1000 稀釋；上述方法中，所述NGAL標(biāo)準(zhǔn)品是純NGAL，其濃度為0. 2mg/ml，先用稀釋劑做 1 200倍稀釋，再做倍比稀釋，做成系列標(biāo)準(zhǔn)品，供作標(biāo)準(zhǔn)曲線用；實施例2用夾心法ELISA確定人尿液NGAL濃度具體步驟是包被NGAL抗體A ；配制系列NGAL標(biāo)準(zhǔn)品；準(zhǔn)備人尿液；使系列標(biāo)準(zhǔn)品 或待定值的人尿液加入96微孔板孔內(nèi)，再使已標(biāo)記的、結(jié)合位點不同于包被在96微孔板上 抗體A的抗體B結(jié)合，用基質(zhì)液顯色20-30分鐘后終止顯色，10分鐘后測定上述系列標(biāo)準(zhǔn)品 和待檢測的人尿液中NGAL反應(yīng)后的吸光度；建立系列標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線 并從曲線中查出待定值的人尿液的NGAL的濃度。實施例3用競爭法ELISA確定人尿液NGAL濃度具體步驟是包被NGAL多克隆抗體；配制系列NGAL標(biāo)準(zhǔn)品；準(zhǔn)備人尿液；使系列 標(biāo)準(zhǔn)品或待定值的人尿液和已標(biāo)記的NGAL標(biāo)準(zhǔn)品混合；用基質(zhì)液顯色20-30分鐘后終止顯 色，10分鐘后測定上述系列標(biāo)準(zhǔn)品和待檢測的人尿液中NGAL反應(yīng)后的吸光度；建立系列標(biāo) 準(zhǔn)品的濃度和吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線并從曲線中查出待定值的人尿液的NGAL的濃度。
權(quán)利要求
1.一種樣本中中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的檢測方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，建立在抗原抗體特異性反應(yīng)原理基礎(chǔ)上，通 過包括但不限于免疫比濁法以及酶聯(lián)免疫(ELISA)法的免疫學(xué)方法檢測樣品中人中性粒 細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)的濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，包括如下步驟i)使用相關(guān)器械收集樣本包括血清、血漿和尿液， )樣品中的NGAL與抗體接觸反應(yīng)，iii)檢測樣本中人NGAL的濃度。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的樣品，其特征是包括但不限于人的尿液、血漿和血清。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體，其特征在于該抗體是通過天然或重組的人NGAL免疫動 物獲得的多克隆抗體或者單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的免疫比濁法，其特征在于用抗人NGAL的抗體，與待檢標(biāo)本 的人NGAL反應(yīng)，所形成的復(fù)合物引起濁度變化；用光投射強(qiáng)度或光散射強(qiáng)度表征這種變 化；從人NGAL標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與相應(yīng)光散射強(qiáng)度或光透射強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線查出待檢標(biāo)本的 人NGAL的含量。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫(ELISA)法，其特征在于包括雙抗夾心法ELISA、 競爭法ELISA。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫(ELISA)法，其特征在于人NGAL預(yù)先固相化，或 人NGAL抗體預(yù)先固相化。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫(ELISA)法，其特征在于檢測NGAL含量的范圍為 7. 8ng/ml-500ng/mlo
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的競爭法，如果是直接競爭法，其特征在于預(yù)先固相化人 NGAL抗體。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的競爭法，如果是間接競爭法，其特征在于預(yù)先固相化人 NGAL。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的固相化，其特征在于將人NGAL或人NGAL抗體包被到固相 支持物上，該支持物可以是，例如用于酶聯(lián)免疫吸附試驗的聚苯乙烯或聚氯乙烯表面，或膠 乳(聚苯乙烯)顆粒，或由壓縮的聚乙烯顆粒組成的過濾玻璃棒，或多孔消化纖維素基質(zhì)， 或事實上是在免疫化學(xué)分析使用中任何合適的支持物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種樣本中中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的檢測方法。該檢測方法是使用抗人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)的抗體，與待檢標(biāo)本的人NGAL反應(yīng)，所形成的復(fù)合物引起濁度變化；用光投射強(qiáng)度或光散射強(qiáng)度表征這種變化；從人NGAL標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與相應(yīng)光散射強(qiáng)度或光透射強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線查出待檢標(biāo)本的人NGAL的含量；該方法具有靈敏度高、回收率高、重復(fù)性好的優(yōu)點，為測定尿液或血漿等樣本中NGAL確定了一個簡便、重現(xiàn)性好、適應(yīng)性強(qiáng)、快速的檢測手段。
文檔編號G01N21/31GK102072960SQ20101013622
公開日2011年5月25日 申請日期2010年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月29日
發(fā)明者華權(quán)高, 沈鶴霄 申請人:武漢生之源生物科技有限公司